Всаа 2 1 1 порошок как принимать: Аминокислоты | БЦАА | BCAA 2:1:1

SSAA SA — Ассоциация спортивных стрелков Южной Австралии

Охота

Департамент окружающей среды и водных ресурсов (DEW) Информация об охоте

Департамент окружающей среды и водных ресурсов (разрешение на охоту)

Разрешение на охоту

Вся охота в Южной Австралии регулируется Законом о национальных парках и дикой природе 1972 года (Закон NPW) и Положениями о национальных парках и дикой природе (охота) 2011 года.

Если вы хотите охотиться в Южной Австралии, у вас должно быть базовое разрешение на охоту, если вы не являетесь:

• уничтожение животных, угрожающих жизни человека.
• уничтожение животных (кроме охраняемых видов), которые наносят ущерб урожаю, скоту или другому имуществу на вашей земле (вашей собственности или собственности работодателя).
• ввоз животных в соответствии с любыми другими разрешительными правилами.

Охраняемые местные животные и охота

Большинство местных млекопитающих, рептилий и птиц полностью защищены.Без этой защиты многие виды могут исчезнуть навсегда. Закон NPW действительно позволяет объявлять открытые сезоны, чтобы можно было охотиться на определенные виды охраняемой дичи (уток и перепелов).

Незащищенные местные животные, интродуцированные животные и охота

Незащищенные местные животные перечислены в Приложении 10 Закона NPW. У вас все еще должно быть разрешение на охоту, прежде чем вы сможете охотиться на незащищенных местных животных или интродуцированных животных,

Согласно Закону учитываются охота и добыча пищи аборигенами.

Дополнительная информация:

В Южной Австралии следующие виды классифицируются как дичь и могут вылавливаться в течение объявленного открытого сезона:

• • Щетина перепела
  • Утка тихоокеанская черная
  • Серо-бирюзовый
  • Hardhead (белоглазая утка)
  • Горная утка (Австралийская овчарка)
  • Утка с розовыми ушами
  • Гривеная утка (древесная утка)
  • Каштан бирюзовый
  • Лопатка синекрылая

В Южной Австралии следующие виды классифицируются как дикие и могут быть взяты в любое время на частной территории с разрешения землевладельцев:

• • Дикая коза
  • Свинья
  • Верблюд
  • Олень
  • Кролик
  • Рыжая лисица
  • Скворец
  • Домашний голубь
  • Черный дрозд европейский
  • Горлица пятнистая

Для получения дополнительной информации или определения необходимости разрешения, пожалуйста, обращайтесь:

Отдел выдачи разрешений на использование фауны DEW
Телефон: (+61 8) 8124 4972
Эл. Почта: dewfaunapermitsunit @ sa.gov.au

Утиная охота

Для вылова / охоты на уток требуется разрешение на охоту на уток в открытом сезоне.

Департамент окружающей среды и водных ресурсов (DEW) Информация об охоте

Департамент окружающей среды и водных ресурсов (разрешение на охоту)

Если вы подаете заявление на разрешение на охоту на уток, вы должны сдать и пройти идентификационный тест на водоплавающих птиц (WIT). Вам потребуется ваш номер WIT, чтобы заполнить заявку.

Обучение и тестирование по идентификации водоплавающих птиц

Чтобы получить разрешение на участие в открытом сезоне охоты на уток в Южной Австралии, вы должны успешно пройти идентификационный тест на водоплавающих птиц.Этот тест предназначен для охотников, чтобы продемонстрировать, что они могут определять водно-болотных птиц и их природоохранный статус, чтобы убедиться, что они выбраны для охоты на правильные виды.

Испытание проводится Департаментом окружающей среды и водных ресурсов.

Обучение

Союз охраны природы и охоты Южной Австралии (CHASA) обеспечивает комплексное обучение по идентификации водоплавающих птиц, чтобы позволить собирающимся охотникам на уток с уверенностью пройти тест на определение водоплавающих птиц.

Курсы проводятся на регулярной основе до и во время сезона охоты и по запросу.

Курс стоит 65 долларов, и в него входит обучение и вся учебная литература, включая печатные справочные материалы и видео. Обычно тренировки проходят в нерабочее время.

Для участия в тренинге CHASA по идентификации водоплавающих птиц заполните форму заявки и отправьте ее в CHASA по почте или электронной почте.

Уникальные функции протеинкиназы D1 и протеинкиназы D2 в клетках млекопитающих

Biochem J. 15 ноября 2010; 432 (Pt 1): 153–163.

, ^{*, 1} , ^{†, 1} , ^† , ^† , ^† и ^{†, 2}

Шарон А.

Мэтьюз

* Отделение медицинских наук, Больница Найнуэллс и медицинская школа, Университет Данди, Данди DD1 9SY, Шотландия, Великобритания

Мария Н. Наварро

† Колледж наук о жизни, Отдел иммунологии и клеточной биологии, Университет Данди , Dow Street, Dundee DD1 5EH, Scotland, UK

Linda V. Sinclair

† Колледж наук о жизни, Отдел иммунологии и клеточной биологии, Университет Данди, Dow Street, Dundee DD1 5EH, Шотландия, Великобритания

Элизабет Эмсли

† Колледж наук о жизни, Отдел иммунологии и клеточной биологии, Университет Данди, Dow Street, Dundee DD1 5EH, Scotland, U.K.

Кармен Фейжу-Карнеро

† Колледж наук о жизни, Отдел иммунологии и клеточной биологии, Университет Данди, Доу-стрит, Данди DD1 5EH, Шотландия, Великобритания

Дорин А. Кантрелл

† Колледж наук о жизни , Отдел иммунологии и клеточной биологии, Университет Данди, Доу-стрит, Данди DD1 5EH, Шотландия, Великобритания

* Отделение медицинских наук, Больница Найнуэллс и медицинская школа, Университет Данди, Данди DD1 9SY, Шотландия, Великобритания

† Колледж наук о жизни, Отдел иммунологии и клеточной биологии, Университет Данди, Доу-стрит, Данди DD1 5EH, Шотландия, U. K.

¹ Эти авторы внесли равный вклад в данную работу.

Поступила 30 июля 2010 г .; Пересмотрено 31 августа 2010 г .; Принято 7 сентября 2010 г.

Copyright © yyyy Автор (ы) Автор (ы) заплатил за эту статью, чтобы она была свободно доступна в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses) /by-nc/2.5/), который разрешает неограниченное некоммерческое использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Изоформы PKD млекопитающих (протеинкиназа D) участвуют в регуляции различных биологических процессов в ответ на передачу сигналов диацилглицерина и PKC (протеинкиназы C). Чтобы сравнить функции PKD1 и PKD2 in vivo , мы создали мышей, дефицитных по ферментативной активности PKD1 или PKD2, посредством гомозиготной экспрессии аллелей PKD1 ^{S744A / S748A} или PKD2 ^{S707A / S711A} «нокаин». Мы также исследовали мышей с дефицитом PKD2, полученных с использованием технологии «генных ловушек». Мы демонстрируем, что, в отличие от PKD1, каталитическая активность PKD2 необходима для нормального эмбриогенеза. Мы также показываем, что PKD2 является основной изоформой PKD, экспрессируемой в лимфоидных тканях, но что каталитическая активность PKD2 не является существенной для развития зрелых периферических Т- и В-лимфоцитов.Однако каталитическая активность PKD2 требуется для эффективного индуцируемого рецептором антигена продукции цитокинов в Т-лимфоцитах и ​​для оптимального Т-клеточно-зависимого ответа антител in vivo . Наши результаты показывают ключевую роль in vivo PKD2 в регуляции функции зрелых периферических лимфоцитов во время адаптивных иммунных ответов. Они также подтверждают функциональную важность PKC-опосредованного фосфорилирования серина каталитического домена PKD для активации PKD и последующей передачи сигналов и показывают, что разные члены семейства PKD выполняют уникальные и не повторяющиеся роли in vivo .

Ключевые слова: цитокин, лимфоцит, протеинкиназа C (PKC), протеинкиназа D (PKD), рецептор Т-клеточного антигена (TCR)

Сокращения: DAG, диацилглицерин; DN, дважды отрицательный; ДП, дважды положительный; ERK1 / 2, киназа 1/2, регулируемая внеклеточными сигналами; ES, эмбриональный стебель; FBS, фетальная бычья сыворотка; IFNγ, интерферон γ; ИЛ-2, интерлейкин 2; NF-κB, ядерный фактор κB; NP, 4-гидрокси-3-нитрофенилацетил; НП-40, Nonidet P40; ПЭ, фикоэритрин; PKC, протеинкиназа C; PKD, протеинкиназа D; SP, однократно положительный; TCR, рецептор Т-клеточного антигена

ВВЕДЕНИЕ

Семейство сериновых / треониновых PKD (протеинкиназы D) млекопитающих включает три различных, но близкородственных сериновых киназы, PKD1, PKD2 и PKD3, каждая из которых имеет высококонсервативный N- концевой регуляторный домен, содержащий два богатых цистеином DAG (диацилглицерин) -связывающих домена и аутоингибиторный домен PH (гомология плекстрина). Члены семейства PKD активируются связыванием DAG с их регуляторным доменом и опосредованным PKC (протеинкиназой C) фосфорилированием двух консервативных остатков серина в их каталитическом домене в ответ на передачу сигналов фосфолипазы C и DAG [1]. PKD являются высококонсервативными ферментами, причем PKD1 и PKD2 являются наиболее близкими из трех изоформ PKD млекопитающих, демонстрируя ~ 85% общей идентичности на уровне аминокислот. В частности, их каталитические домены и их регуляторные DAG-связывающие домены, которые являются ключевыми для контроля внутриклеточной локализации этих протеинкиназ, очень гомологичны.Одним из следствий высокого уровня консервативности PKD1 и PKD2 является то, что было трудно разработать антитела, которые могли бы различать эти изоформы, хотя существуют антитела, которые избирательно распознают PKD3. Соответственно, многие исследования функции PKD не указывают, какая изоформа PKD изучается. Это важно, поскольку PKD1 и PKD2 имеют общие регуляторные механизмы во многих типах клеток. Например, эктопически экспрессируемый GFP (зеленый флуоресцентный белок), помеченный PKD1, и эндогенный PKD2 демонстрируют идентичные механизмы и кинетику активации, инактивации и субклеточного переноса в ответ на запуск рецептора антигена в лейкемической Т-клеточной линии Jurkat и в B-клетках лимфомы A20. [2,3].

Многие взрослые ткани и клеточные линии демонстрируют коэкспрессию различных изоформ PKD, и очевидно, что между этими разными членами семейства PKD может существовать функциональная избыточность. Например, птицы экспрессируют две изоформы PKD, которые наиболее близко напоминают PKD1 и PKD3 млекопитающих, и любая из этих двух киназ может фосфорилировать и регулировать ядерный экспорт HDAC5 и HDAC7 класса II HDAC5 и HDAC7 в В-клетках птиц [4] . Сходным образом, множественные изоформы PKD, по-видимому, избыточно регулируют организацию Гольджи и транспорт белка [5–9], активацию NF-κB (ядерного фактора κB) и реакции выживания клеток [10–12], а также высвобождение хемокинов из активированных Toll-подобных рецепторов. эпителиальные клетки [13].Функциональная избыточность между различными изоформами PKD также наблюдалась при фосфорилировании субстратов PKD, таких как CERT (белок, транспортирующий церамид) [14], PAR1b (дефектное разделение 1) [15], сфингозинкиназа 2 [16] и HSP27 (теплоотдача). шоковый белок 27) [17,18].

Функциональная избыточность между разными членами семейства PKD, экспрессируемыми в одних и тех же тканях / клетках, однако, не всегда имеет место. Например, PKD-опосредованное фосфорилирование фосфоинозитид-4-киназы IIIβ регулируется PKD1 и PKD2, но не PKD3 [19].Кроме того, существует различное время экспрессии изоформ PKD во время раннего эмбриогенеза мышей [20], и есть примеры типов клеток, где экспрессия одной изоформы PKD, по-видимому, доминирует. Следовательно, специфические и не повторяющиеся роли PKD1 в регуляции секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы [21], TLR (Toll-подобный рецептор) -зависимой экспрессии цитокинов в макрофагах [22], пролиферации кератиноцитов [23] и патологического ремоделирования сердца in vivo было идентифицировано [24].

Наше понимание функций различных изоформ PKD млекопитающих осложняется еще и наблюдением, что различные пулы белков PKD наблюдаются в разных внутриклеточных сайтах, включая плазматическую мембрану, цитоплазму, Гольджи, митохондрии и ядро ​​[25]. Кроме того, разные изоформы PKD могут по-разному локализоваться в одной и той же клетке [26]. Было также показано, что PKD перемещаются между различными участками клетки в ответ на специфические стимулы [2, 3, 27, 28], что имеет серьезные последствия для функции этих ферментов.Таким образом, локализованная по Гольджи PKD регулирует фосфорилирование фосфоинозитид-4-киназы IIIβ и перенос пузырьков [19], тогда как митохондриальная PKD контролирует экспрессию SOD2 (супероксиддисмутазы 2) посредством активации NF-κB [29]. Сходным образом белки PKD, нацеленные на плазматическую мембрану, и цитозольные белки PKD регулируют различные аспекты дифференцировки Т-клеток [30].

В совокупности эти данные свидетельствуют в пользу уникальных функций для разных членов семейства ДОК в разных сотовых контекстах. Эффективный способ исследовать физиологическую роль отдельных изоформ PKD — это изучить последствия удаления отдельных ферментов с использованием стратегий нацеливания на гены у мышей.Этот подход использовался ранее для исследования роли PKD1, показывая, что гомозиготная делеция PKD1 в зародышевой линии вызывает эмбриональную летальность [24]. Более того, специфичная для кардиомиоцитов делеция PKD1 также выявила уникальную и неизбыточную роль PKD1 в патологическом ремоделировании сердца [24]. Также был описан мутантный штамм мышей (129S5- Prkd3 ^{Gt ( OST1 ) Lex} / Mmcd), который несет делецию генной ловушки PKD3.Сообщается, что мыши жизнеспособны, и фенотипический анализ выявил лишь незначительные аномалии скелета. Однако на сегодняшний день не было исследований, в которых изучалась бы роль PKD2 in vivo , хотя есть несколько исследований in vitro с использованием методов РНКи (РНК-интерференция) в клеточных линиях, которые предполагали важные неизбыточные функции для ПКД2. Они включают ключевую роль PKD2 в эндотелиальных клетках, чтобы контролировать пролиферацию и выживаемость клеток и способствовать ангиогенезу [31], а в моноцитах — контролировать миграционные ответы [32].Соответственно, целью настоящего исследования было создание моделей мышей, которые позволили бы изучить роль PKD2 в физиологических ответах во время эмбриогенеза и у взрослых мышей.

Данные показывают, что мыши с дефицитом ферментативной активности PKD2 родились с нормальной менделевской частотой, были фертильными и здоровыми. Поразительно, что мы наблюдали, что PKD2, но не PKD1, избирательно экспрессируется в лимфоидных клетках взрослых мышей, но что потеря каталитической активности PKD2 не оказала очевидного влияния на развитие зрелых Т- и В-лимфоцитов.Однако каталитическая функция PKD2 была важна для продукции эффекторных цитокинов после вовлечения TCR (рецептора Т-клеточного антигена), а также для оптимальной индукции ответов антител на модельный антиген. Данные показывают, что каталитическая активность PKD1, но не PKD2, важна для нормального развития эмбриона, и что PKD2, но не PKD1, играет важную роль у взрослых мышей в контроле функции лимфоидных клеток во время адаптивных иммунных ответов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение трансгенных мышей PKD2 и PKD1

Мышей с PKD2-нокином на фоне C57BL / 6 были получены с помощью Ozgene.Вкратце, геномные фрагменты, содержащие экзоны 15-17 гена Prkd2 , амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК C57BL / 6 для создания плеч 5 ‘и 3’ гомологии, которые использовали для фланкирования loxP-PGK- Neo ^R -LoxP селекционная кассета. Мутации (подчеркнутые) в плече 5′-гомологии, которые кодируют точечные мутации аланина Ser ⁷⁰⁷ и Ser ⁷¹¹ (5′-GAGAAGGCCTTCCGGCGCGCCGTG-3 ‘), вводили с помощью ПЦР. Прямое и обратное секвенирование ДНК и расщепление ферментами рестрикции подтвердили целостность конечной конструкции нацеливания.После гомологичной рекомбинации нацеливающего вектора в клетках C57BL / 6 ES (эмбриональные стволовые) клоны с правильной мишенью были идентифицированы с помощью саузерн-блоттинга. Целостность точечных мутаций по Ser ⁷⁰⁷ и Ser ⁷¹¹ в ES-клетках-мишенях подтверждали скринингом ПЦР и секвенированием ДНК. Нацеленные клоны ES-клеток микроинъектировали в бластоцисты C57BL / 6 для получения химерных животных. После установления передачи по зародышевой линии кассета PGK- Neo ^R была удалена путем скрещивания с трансгенной линией, содержащей рекомбиназу Cre, вставленную в локус Rosa26 (мыши-делетеры OZ Cre).Селективное разведение использовали для устранения гена Cre и мышей PKD2 ^SSAA (PKD2 ^{S707A / S711A} ) -knockin поддерживали на чистом генетическом фоне C57BL / 6. Генотипирование проводили методом ПЦР геномной ДНК с использованием праймеров 671-5’armF (5′-AGTGGCACGTTCCCCTTCAATG-3 ‘) и 671-3’armR (5′-CTTTGCCCAATCCCTTACAGCCT-3’), продуцирующих продукты длиной 236 п.н. [PKD2 ^WT (PKD2 дикого типа)] и 344 п.н. (PKD2 ^SSAA ).

Похожая методика была применена для получения PKD1 ^SSAA (PKD1 ^{S744A / S748A} ) -кнокин мышей, за исключением того, что нуклеотиды, кодирующие Ser ⁷⁴⁴ и Ser ⁷⁴⁸ , были мутированы в аланин (5′-GCCTTCCTAGGAG ). Генотипирование проводили с помощью ПЦР геномной ДНК с использованием праймеров 579-5’armF2 (5’CAGCCTTCATGTATCCACCCAACC) и 579-3’armR (5’TGAACAACAGCAGAGCCCTAACAG), продуцирующих продукты размером 512 п.н. (PKD1 ^WT ) и 641 ^{п.н. SSAA} ).

Получение мышей с мутантной ловушкой для гена PKD2

Мышей с дефицитом PKD2 получали с помощью метода генной ловушки на основе ретровируса. Линия ES-клеток E14Tg2a.4 (полученная из линии мыши 129 / OlaHsd), содержащая кассету-ловушку для генов, вставленную в локус Prkd2 (RRJ380, Bay Genomics), была введена в бластоцисты C57Bl / 6J, которые впоследствии были имплантированы реципиенту. самки мышей.ES-клетки подвергали анализу последовательности ДНК перед микроинъекцией, чтобы подтвердить, что клеточная линия содержит только одну кассету-ловушку для гена, расположенную в локусе PKD2 . Полученных химерных мышей скрещивали с фоном C57BL / 6 для получения передачи по зародышевой линии. Генотипирование проводили методом ПЦР геномной ДНК с использованием праймеров PKD2-GTF6 (5′-GTTCCCCTTCCAGTCCATAATCCTCCT-3 ‘), PKD2-GTR2 (5′-CGATGATGCGAGCGAAGCCAAA-3′) и B-geo5’R2 (5’-TGGCCAGT) ) в одной ПЦР с получением продуктов размером 498 п. н. [PKD2 ^GT (генная ловушка PKD2)] и 441 п.н. (PKD2 ^WT ).Все эксперименты на мышах проводились на смешанном фоне 129-C57BL / 6J.

Всех мышей разводили и содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, в биоцентре Wellcome Trust при Университете Данди в соответствии с положениями Закона Великобритании о домашних животных (научные процедуры) 1986 года.

Культура клеток

Селезенки, тимус и лимфатические узлы удаляли у мышей в возрасте 2–4 месяцев, измельчали ​​в клеточных фильтрах и дезагрегировали, а эритроциты лизировали по мере необходимости перед тем, как лимфоциты суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей L -глутамин (Invitrogen) с 10% (об. / об.) инактивированной нагреванием FBS (фетальная бычья сыворотка), 50 единиц / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола.Клетки активировали 200 нМ форбол 12,13-дибутирата, 2 мкМ пептида OVA (SIINFEKL) или указанными концентрациями анти-CD3ϵ-антитела (клон 2C11), как указано, при плотности прибл. (1-2) × 10 ⁶ клеток / мл.

Вестерн-блоттинг

Экспрессию и фосфорилирование белка оценивали с использованием стандартных протоколов вестерн-блоттинга. Вкратце, лизаты клеток (2 × 10 ⁷ клеток или 100 мкг ткани на мл буфера для лизиса) были приготовлены на льду с использованием буфера для лизиса NP-40 (Nonidet P40) (50 мМ Hepes, pH 7.4, 75 мМ NaCl, 1% NP-40, 10 мМ NaF, 10 мМ иодацетимид, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ 2-глицерофосфат, ингибиторы протеаз и 1 мМ PMSF), а затем центрифугировали при 16000 g в течение 10 мин. при 4 ° C. Образцы белка (0,25-0,5 миллиона эквивалентов клеток или 40 мкг тканевого экстракта) были разделены с помощью SDS / PAGE (8% или 4-12% гелей), перенесены на PVDF-мембраны и заблокированы 5% (мас. / Об.) Не содержащими вещества. сухое обезжиренное обезжиренное молоко в PBS / Tween 20. Блоты зондировали антителами, распознающими различные фосфорилированные и нефосфорилированные (общие) белки, как указано.

Иммунопреципитация и

in vitro Анализы киназ

Эндогенные изоформы PKD были иммунопреципитированы из клеточных лизатов с помощью перекрестно реагирующего антитела PKD1 / 2 [33] или PKD3-специфического антитела [34] и восстановлены с помощью протеина A− Бусины сефарозы. Фосфорилирование экзогенного субстрата иммунопреципитированными белками PKD измеряли по включению [γ- ³² P] АТФ в синтетический пептид субстрата PKD (KKLNRTLSVA), как описано ранее [34].

Проточная цитометрия

Если не указано иное, антитела, конъюгированные с FITC, PE (фикоэритрин), PE-Cy5.5 (индодикарбоцианин), PE-Cy7 (индотрикарбоцианин) или APC (аллофикоцианин), были получены от BD Pharmingen или eBioscience. Клетки окрашивали на предмет экспрессии на клеточной поверхности следующих антигенов (клоны указаны в скобках): CD4 (RM4-5), CD8 (53-6,7), TCR-β (H57-597), B220 (RA3-6B2), IgD (11-26) и IgM (11/41). DN (дважды отрицательные) и DP (дважды положительные) тимоциты определяли по окрашиванию CD8 и CD4. Зрелые тимоциты SP (однократно положительные) были определены как TCRβ ^Hi и положительны по экспрессии CD4 или CD8. При необходимости рецепторы Fc блокировали с помощью мышиного блока Fc (CD16 / CD32; рецептор FcγIII / II; 2.4G2) (BD Pharmingen). Клетки окрашивали насыщающими концентрациями антитела в соответствии с инструкциями производителя, промывали и ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 1% FBS, перед сбором. Живые клетки были заблокированы в соответствии с их прямым и боковым рассеянием.Данные были получены на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson) и проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (Treestar).

Цитокин ELISA

Лимфатические узлы собирали и дезагрегировали. CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки очищали отрицательной селекцией с использованием набора CD4 + T Cell Isolation или CD8 + T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) с помощью магнитной сортировки клеток (AutoMacs, Miltenyi Biotec). Клетки стимулировали различными количествами анти-CD3ϵ (клон 2C11). Через 18 ч супернатанты собирали и определяли продукцию цитокинов [IFNγ (интерферон γ) и IL-2 (интерлейкин 2)] с помощью ELISA с использованием Mouse IFNγ ‘Femto-HS’-ELISA Ready-Set-Go и Mouse IL2-ELISA Ready. -Set-Go комплекты (eBiosciences) в соответствии с инструкциями производителя.

Иммунизация и ИФА Ig

Мышей соответствующего пола и возраста в возрасте 8–12 недель иммунизировали подкожно 100 мкг NP (4-гидрокси-3-нитрофенилацетил) -OVA (Biosearch Technologies), предварительно адсорбированного на гидроксид алюминия (Pierce). Сыворотки собирали через 0, 8, 14 и 29 дней. Уровни общего и NP-специфического Ig определяли стандартным ELISA с использованием связанных с планшетом антимышиных Ig (тяжелая и легкая цепи) или NP-BSA ₃₃ и козьих антимышиных антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой (SouthernBiotech).Реакцию выявляли с помощью pNPP (p, -нитрофенилфосфат) (Sigma) с последующим измерением оптической плотности при 405 нм. Стандарты очищенного изотипа Ig использовали для количественного определения уровней специфического Ig.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism 5.00 для Macintosh (программное обеспечение GraphPad). P <0,05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

PKD1, но не PKD2, играет важную роль в эмбриогенезе мышей

PKD сериновые киназы представляют собой большие белки, содержащие несколько доменов взаимодействия, включая как белок-белок-, так и белок-липид-связывающие области, и обладают потенциалом к функционируют как строительные леса.Чтобы изучить физиологическую роль PKD2 in vivo , мы поэтому решили создать мышей, у которых аллели PKD2 дикого типа были заменены мутантными аллелями, кодирующими замены аланина для Ser ⁷⁰⁷ и Ser ⁷¹¹ в области петли активации каталитического домена PKD. . Фосфорилирование этих двух сериновых остатков является критическим для каталитической активности PKD2 [36], следовательно, исследования мышей PKD2 ^SSAA позволяют оценить важность каталитической активности PKD2 in vivo , минуя любое влияние удаления каркасной функции PKD2. Соответственно, мутации PKD2 S707A и S711A были нокаутированы в локусе Prkd2 дикого типа в ES-клетках мыши путем гомологичной рекомбинации. Полученные ES-клетки использовали для получения мышей, экспрессирующих PKD2 ^SSAA под контролем его естественного промотора (). Предыдущие исследования показали, что гомозиготная делеция аллелей PKD1 вызывает эмбриональную летальность [24]. В противоположность этому, гомозиготные мыши PKD2 ^SSAA -knockin были жизнеспособными, фертильными и фенотипически неотличимы от своих однопометников дикого типа (C и результаты не показаны).Это предполагает, что нормальное эмбриональное развитие не нарушается потерей каталитической функции PKD2.

Создание мышей с мутацией knockin PKD2

( A ) Изображение эндогенного мышиного аллеля Prkd2 , содержащего экзоны 10–18, конструкцию knockin и целевой аллель с кассетой неомицина, удаленной рекомбиназой Cre . Черные / серые прямоугольники представляют экзоны, а черные стрелки представляют сайтов LoxP . Толстые черные линии указывают положения зондов, используемых для анализа саузерн-блоттингом.Аллель нокина, содержащий мутацию Ser ⁷⁰⁷ / Ser ⁷¹¹ в экзоне 16, показан серым прямоугольником. ( B ) Генотипы мышей с мутантом PKD2 ^SSAA определяли с помощью ПЦР-амплификации геномной ДНК. Аллель дикого типа генерирует продукт длиной 236 п.н., тогда как аллель нокина генерирует продукт 344 п.н. Более крупный продукт аллеля нокина обусловлен присутствием сайта LoxP из 108 п.н. и фланкирующей области, которая остается в интронной области после опосредованного Cre иссечения кассеты селекции неомицина.( C ) Были созданы гетерозиготные вязки для мышей PKD2 ^SSAA , и потомство было генотипировано, как описано в разделе «Материалы и методы». Количество (и процент) каждого наблюдаемого генотипа с последующей его ожидаемой менделевской частотой. P = 0,482 (χ ² тест).

Мы рассмотрели возможность того, что небольшая остаточная каталитическая активность, все еще присутствующая в мутантном белке PKD2 ^SSAA (см. A), может быть достаточной для нормального эмбриогенеза.Поэтому, чтобы подтвердить нашу гипотезу, мы создали две дополнительные модели мутантных мышей PKD. В первом аллели PKD1 дикого типа были заменены мутантными аллелями PKD1, лишенными критических PKC-зависимых сайтов фосфорилирования серина, Ser ⁷⁴⁴ и Ser ⁷⁴⁸ (A). Мы также создали мышей с дефицитом PKD2 (мыши PKD2 ^GT ), используя линию ES-клеток, содержащую кассету с генной ловушкой, вставленную в локус Prkd2 (C). Наш анализ последовательности ДНК этой линии ES-клеток подтвердил, что клеточная линия содержала только одну кассету-ловушку для гена, расположенную в локусе PKD2 .Мы сопоставили сайт вставки генной ловушки с интроном 15, который разрушает и устраняет каталитический домен PKD2 (C). Важно отметить, что мыши PKD2 ^{GT / GT} родились с нормальной ожидаемой частотой (E) и были жизнеспособными, фертильными и фенотипически неотличимыми от своих однопометников дикого типа. Напротив, когда гетерозиготные мыши PKD1 ^SSAA были скрещены, новорожденных мышей дикого типа и гетерозиготных мышей, но не гомозиготных мышей PKD1 ^SSAA , легко идентифицировать (E). Из 177 наблюдаемых живорождений две мыши были гомозиготными по аллелю PKD1 ^SSAA (~ 1%).Это указывает на то, что гомозиготная экспрессия аллеля PKD1 ^SSAA вызывает эмбриональную летальность с неполной пенетрантностью. Это согласуется с отчетом Olson и его коллег о том, что делеция экзонов 12-14 PKD1, которая устраняет каталитический домен PKD1, также вызывает эмбриональную летальность с неполной пенетрантностью [24]. Анализ стадии эмбриогенеза, который требует каталитической активности PKD1, показал, что нормальные менделевские частоты гомозиготных по PKD1 ^{плодов SSAA} могут быть идентифицированы до 9 дня.5 эмбриогенеза, но не позже (E). Следовательно, большинство эмбрионов с гомозиготными заменами по аллелю PKD1 ^SSAA погибают на ранней стадии развития. В совокупности эти результаты демонстрируют, что каталитическая активность PKD1, но не PKD2, важна для нормального эмбриогенеза мыши.

Создание мутантных мышей с ловушкой для гена PKD2 и мышей с мутантами по PKD1

( A ) Изображение эндогенного мышиного аллеля Prkd1 , содержащего экзоны 15-17, конструкцию нокаина и целевой аллель с удаленной кассетой неомицина по рекомбиназе Cre .Белые / серые прямоугольники представляют экзоны, а черные стрелки представляют сайтов LoxP . Толстые черные линии указывают положения зондов, используемых для анализа саузерн-блоттингом. Аллель нокина, содержащий мутацию Ser ⁷⁴⁴ / Ser ⁷⁴⁸ в экзоне 16, показан серым прямоугольником. ( B ) PKD1 ^SSAA -knockin мышей генотипировали с помощью ПЦР-амплификации геномной ДНК по сайту вставки LoxP, как описано в разделе «Материалы и методы».( C ) Изображение аллеля Prkd2 дикого типа и нацеленного на генную ловушку аллеля Prkd2 , присутствующих в клеточной линии E14Tg2a. 4 ES. Эта вставка нарушает структуру каталитического домена и удаляет несколько ключевых мотивов, которые важны для катализа и связывания субстрата (мотивы DFG и APE), а также сайты фосфорилирования Ser ⁷⁰⁷ и Ser ⁷¹¹ , которые важны для активации PKD2. ( D ) Мышей PKD2 ^GT генотипировали с помощью ПЦР-амплификации геномной ДНК, как описано в разделе «Материалы и методы».( E ) Были созданы гетерозиготные спаривания для мышей PKD2 ^GT и мышей PKD1 ^SSAA , и живое потомство и эмбрионы-нокаин PKD1 ^SSAA были генотипированы, как описано в разделе «Материалы и методы». Показано количество (и процент) каждого наблюдаемого генотипа, а затем его ожидаемая менделевская частота. Данные были проанализированы с использованием критерия χ ² для определения статистической значимости.

PKD2 является доминирующей изоформой PKD, экспрессируемой в лимфоидной ткани и клетках мыши.

( A ) Глобальная каталитическая активность PKD1 / 2 в тимоцитах дикого типа и мутантных PKD2.Белки PKD1 / 2 были иммунопреципитированы из тимоцитов, активированных сложным форболовым эфиром, с использованием антисыворотки pan-PKD1 / 2 [33] до того, как каталитическая активность PKD была измерена в анализах in vitro пептидных субстратных киназ , как описано в разделе «Материалы и методы». Данные взяты из восьми дикого типа, восьми PKD2 ^{GT / GT} и шести PKD2 ^{SSAA / SSAA} тимуса, проанализированных в трех отдельных экспериментах. Результаты — это средства + S.E.M .; Статистическая значимость рассчитывалась по критерию Стьюдента t .( B ) Аутофосфорилирование PKD1 / 2 по Ser ⁹¹⁶ и Ser ⁸⁷³ , соответственно, в экстрактах цельных клеток, приготовленных из контрольных и активированных форболовым эфиром дикого типа, гетерозиготных и гомозиготных PKD2 ^GT и PKD2 SSAA ^{SSAA тимоциты. Кляксы представляют два независимых эксперимента. ( C ) Анализ петли активации PKD и фосфорилирования ERK1 / 2 в экстрактах цельных клеток, полученных из спленоцитов дикого типа, PKD2 GT / GT и PKD2 SSAA / SSAA , активированных сложным эфиром форбола в течение 15 мин.Подобные результаты наблюдались в тимоцитах, активированных сложным форболовым эфиром. ( D ) Петля активации PKD и фосфорилирование Ser 916 в B-клетках дикого типа, PKD1 — / — и PKD3 — / — DT40, активированных сложным эфиром форбола в течение 15 мин. ( E ) Анализ фосфорилирования петли активации PKD в иммунопреципитатах PKD3, полученных из необработанных и активированных сложным форболом тимоцитов дикого типа и PKD2 GT / GT . ( F ) Экспрессия и каталитическая активность PKD3 в первичных лимфоидных клетках дикого типа и гомозиготных PKD2 GT и PKD2 SSAA .Белки PKD3 были иммунопреципитированы из тимоцитов, активированных сложным сложным эфиром форбола, с использованием специфических антител против PKD3 [34] до того, как каталитическая активность PKD3 была измерена в анализах in vitro пептидных субстратных киназ , как описано в разделе «Материалы и методы». Результаты представляют от четырех до шести дикого типа, PKD2 GT / GT и PKD2 SSAA / SSAA тими, проанализированы в трех отдельных экспериментах и ​​представляют собой средние значения + S.E.M. Для расчета статистической значимости использовали критерий Стьюдента t .}

Паттерны экспрессии PKD1 и PKD2 у взрослых мышей

Анализ баз данных экспрессии EST (метка экспрессируемой последовательности) / гена показывает, что во многих тканях взрослого организма наблюдается коэкспрессия различных изоформ PKD на уровне мРНК (A). Однако относительная экспрессия конкретных изоформ PKD на уровне белка в различных тканях и клетках четко не определена. В контексте PKD1 и PKD2, которые являются высокогомологичными, большинство антител, генерируемых против этих киназ, не могут различать две изоформы.Например, наиболее часто используемая антисыворотка «pan’-PKD», используемая для обнаружения PKD1 в различных тканях, была направлена ​​против пептидной последовательности EEREMKALSERVSIL (соответствующей аминокислотам 904–918 в мышиной PKD1), но одинаково хорошо реагирует с PKD2. При анализе SDS / PAGE теоретически возможно различать PKD1 и PKD2 на основе тонких различий в их электрофоретической подвижности [10]. Однако, поскольку электрофоретическая подвижность изоформ PKD может быть изменена фосфорилированием белка [37], невозможно использовать дифференциальную миграцию на гелях SDS / PAGE в качестве надежного критерия для отличия экспрессии PKD1 от экспрессии PKD2.

Дифференциальная экспрессия изоформ PKD1 и PKD2 в тканях взрослых животных

( A ) Анализ экспрессии генов Prkd1 , Prkd2 и Prkd3 в тканях взрослых мышей. Данные экспрессии мРНК в наборе данных GeneAtlas MOE430 (gcrma) были загружены из портала генов BioGPS (http://www.biogps.gnf.org) и выражены как кратное изменение экспрессии в указанных тканях по сравнению с выраженным в клетках NIH 3T3. ( B ) Вестерн-блоттинг экспрессии PKD1, PKD2 и Akt в тимоцитах дикого типа по сравнению с тимоцитами PKD2 ^{GT / GT} . Блоты представляют три или более отдельных экспериментов. Молекулярные массы указаны в кДа. ( C ) Вестерн-блоттинг экспрессии PKD1, PKD2 и Akt в тканях дикого типа по сравнению с взрослыми тканями PKD2 ^{GT / GT} . Блоты получены от двух отдельных мышей PKD2 ^{SSAA / SSAA} и их однопометников дикого типа. Закрытые стрелки указывают на ПКД2; открытые стрелки указывают на ПКД1.

В этом отношении экзоны, кодирующие область белка, распознаваемого антисывороткой pan-PKD, не будут экспрессироваться у мышей PKD2 ^{GT / GT} .Соответственно, анализ вестерн-блоттинга с использованием антисыворотки к пан-PKD тканей от мышей дикого типа по сравнению с мышами PKD2 ^{GT / GT} позволит оценить, какие взрослые ткани экспрессируют PKD1 и PKD2. Вестерн-блот-анализ экстрактов лимфоидной ткани мышей PKD2 ^{GT / GT} , особенно тимуса (B), лимфатических узлов и селезенки (C), показывает, что эти ткани не содержат каких-либо белков, реагирующих с антисывороткой pan-PKD1 / 2, это указывает на то, что Т- и В-лимфоциты, которые составляют большинство клеток в этих тканях, специфически экспрессируют PKD2, но не PKD1. Напротив, делеция PKD2 вызывает небольшую потерю общего белка PKD1 / 2 в головном мозге или поджелудочной железе или не вызывает ее отсутствия, но снижает общие уровни белков PKD1 / 2 в сердце и почках (C). Следовательно, PKD1 и PKD2 коэкспрессируются во многих тканях взрослого человека, хотя и на разных уровнях, но одним исключением являются лимфоидные клетки, которые, по-видимому, экспрессируют только PKD2.

PKD2 является основной изоформой PKD, экспрессируемой в лимфоцитах мыши

Данные, предполагающие, что PKD2, но не PKD1, избирательно экспрессируется в лимфоидных клетках у взрослых мышей, были подтверждены с помощью исследований киназы in vitro , сравнивая общую каталитическую активность PKD1 / 2 в тимоцитах дикого типа и PKD2 ^{GT / GT} .Существенное фосфорилирование пептидного субстрата было обнаружено в иммунопреципитатах PKD1 / 2, полученных из тимоцитов дикого типа, активированных форболовым сложным эфиром, но не в тимоцитах, полученных из тимоцитов PKD2 ^{GT / GT} (A). Другим хорошо охарактеризованным маркером каталитической активности эндогенных PKD1 / PKD2 является статус фосфорилирования консервативного С-концевого сайта аутофосфорилирования (Ser ⁹¹⁶ в PKD1; Ser ⁸⁷³ в PKD2). Как показано на (B), тимоциты дикого типа, активированные сложным форболом, но не PKD2 ^{GT / GT} , содержат активные аутофосфорилированные белки PKD1 / 2.

Мы также исследовали общую каталитическую активность PKD1 / 2 в PKD2 ^SSAA -кнокин-лимфоцитах. Не было потери экспрессии белка PKD2 в гомозиготных лимфоцитах PKD2 ^SSAA , но общая каталитическая активность PKD1 / 2 была серьезно нарушена, по оценке in vitro киназных анализов белков PKD2, иммунопреципитированных из стимулированных форболом сложным эфиром белков дикого типа по сравнению с тимоцитами PKD2 ^{SSAA / SSAA} (A). Более того, мутантные белки PKD2 ^SSAA не могли эффективно аутофосфорилироваться по Ser ⁸⁷³ в ответ на стимуляцию сложным эфиром форбола (B). Однако мы обнаружили небольшое количество остаточной каталитической активности PKD1 / 2 в активированных тимоцитах PKD2 ^{SSAA / SSAA} по сравнению с тимоцитами PKD2 ^{GT / GT} . Поскольку лимфоидные клетки не экспрессируют PKD1 (см. Выше), низкие уровни каталитической активности PKD2, очевидно, могут быть индуцированы в мутантных тимоцитах PKD2 ^SSAA независимо от PKC-опосредованного фосфорилирования каталитического домена PKD2.

Поразительно, мы наблюдали, что, хотя обработка сложным эфиром форбола индуцировала значительное фосфорилирование петли активации PKD в лимфоцитах дикого типа, это не было обнаружено в экстрактах цельных клеток, полученных из PKD2 ^{SSAA / SSAA} или PKD2 ^{GT /, стимулированных сложным эфиром форбола. Лимфоциты GT} , несмотря на нормальную индукцию фосфорилирования ERK1 / 2 (киназа 1/2, регулируемая внеклеточными сигналами) (C).Это было неожиданно, поскольку PKD3 экспрессируется в лимфоцитах млекопитающих [34] (E), а сегмент петли активации PKD полностью консервативен во всех трех изоформах PKD млекопитающих. Следовательно, фосфо-специфические антитела «петли активации» PKD должны одинаково перекрестно реагировать с PKD1 (фосфорилированным по Ser ⁷⁴⁴ / Ser ⁷⁴⁸ ), PKD2 (фосфорилированным по Ser ⁷⁰⁷ / Ser ⁷¹¹ ) и PKD3 (фосфорилированным по Ser ⁷³⁰ / Ser ⁷³⁴ ). Чтобы выяснить, действительно ли фосфо-специфическое антитело петли активации PKD может обнаруживать активные фосфорилированные белки PKD3, мы проанализировали B-лимфоциты птиц DT40, которые, как известно, экспрессируют PKD3 и PKD1 примерно на эквимолярных уровнях, но не экспрессируют PKD2 [4].Данные в (D) показывают, что делеция PKD1 в B-лимфоцитах DT40 приводит к полной потере фосфорилирования PKD1 Ser ⁹¹⁶ , но только к 2–3-кратному снижению общих уровней фосфорилирования петли активации PKD после стимуляции сложным эфиром форбола. . Сходным образом, в клетках PKD3 ^{— / —} DT40 не было изменений в фосфорилировании PKD1 Ser ⁹¹⁶ и снова только 2–3-кратное снижение уровней фосфорилирования петли активации PKD после стимуляции сложным эфиром форбола (D). Таким образом, фосфо-специфические антитела петли активации PKD могут очень эффективно обнаруживать активную фосфорилированную PKD3 в клетках, которые экспрессируют высокие уровни белка PKD3.Действительно, когда мы иммунопреципитировали белки PKD3 из тимоцитов PKD2 ^{GT / GT} , активированных сложным эфиром форбола, мы теперь смогли обнаружить фосфорилирование петли активации PKD3 (E). Соответственно, невозможность обнаружить какое-либо фосфорилирование петли активации PKD в экстрактах цельных клеток, полученных из мутантных лимфоцитов PKD2, свидетельствует о том, что PKD3 не вносит большого количественного вклада в общий пул белков PKD в лимфоидных клетках / тканях мыши.

Хотя экспрессия белка PKD3 очень низкая в лимфоцитах мыши, важно было оценить, повлияла ли потеря каталитической активности PKD2 на экспрессию или активность PKD3.Поэтому мы иммунопреципитировали PKD3 из контрольных и стимулированных форболовым эфиром тимоцитов дикого типа и мутантных PKD2. В этих экспериментах мы обнаружили, что уровни экспрессии PKD3 и каталитическая активность были нормальными в тимоцитах дикого типа, PKD2 ^{GT / GT} и PKD2 ^{SSAA / SSAA} (F). Таким образом, потеря экспрессии PKD2 и / или каталитической активности в лимфоидных клетках не компенсируется повышенной экспрессией / активностью других изоформ PKD. Также нет никаких доказательств того, что экспрессия каталитически неактивной PKD2 оказывает какое-либо доминантно-отрицательное влияние на экспрессию или активность PKD3.

PKD2 незаменима для развития зрелых Т-лимфоцитов

Поскольку PKD2 является основной изоформой PKD, экспрессируемой в тимусе и зрелых Т-лимфоцитах (результаты не показаны), мы спросили, важна ли каталитическая функция PKD2 для нормального T- развитие лимфоцитов. Предыдущие исследования показали, что PKD может активироваться пре-TCR в предшественниках Т-клеток в тимусе и комплексом зрелых α / β TCR в периферических Т-клетках [30,33]. На сегодняшний день в экспериментах по изучению последствий активности PKD для функции TCR использовались методы трансгенеза для нацеливания активированного мутантного белка PKD (включающего каталитический домен PKD1) либо в мембрану, либо в цитозоль пре-Т-клеток. Эти эксперименты демонстрируют, что конститутивно активная передача сигналов PKD может заменять пре-TCR, чтобы управлять пролиферацией и дифференцировкой Т-клеток у мышей с нулевым геном рекомбиназы [30]. Однако эксперименты с такими мутантами с усилением функции могут дать информацию о функциональной способности протеинкиназы, но они не оценивают, важна ли киназа для конкретного биологического процесса.

Поэтому мы исследовали развитие Т-клеток у мышей PKD2 ^{GT / GT} и PKD2 ^{SSAA / SSAA} , используя проточную цитометрию для определения основных субпопуляций тимуса и периферических Т-клеток.Ранние предшественники Т-лимфоцитов в тимусе являются DN корецепторов MHC CD4 и CD8. Эти предшественники DN претерпевают перестройки локуса TCRβ с образованием полипептида TCRβ, который обеспечивает экспрессию комплекса пре-TCR на клеточной поверхности. Затем пре-TCR поддерживает выживание и быстрое клональное размножение предшественников DN вместе с их дифференцировкой в ​​тимоциты CD4 ⁺ CD8 ⁺ DP. Затем происходят перестройки генов цепи TCR, и клетки, которые экспрессируют функциональный, но не самореактивный комплекс α / β TCR, дифференцируются либо в CD4 ⁺ , либо в CD8 ⁺ SP Т-лимфоциты.Thymi от мышей PKD2 ^{SSAA / SSAA} и PKD2 ^{GT / GT} не обнаруживали каких-либо явных отклонений и содержали нормальное количество тимоцитов DN, DP и зрелых SP, которые экспрессируют высокие уровни зрелого комплекса α / β TCR (A и B ). Более того, эти зрелые тимоциты SP были способны выходить из тимуса и нормально заселять периферические ткани, поскольку частота и общее количество периферических Т-лимфоцитов CD4 ⁺ и CD8 ⁺ в лимфатических узлах и селезенке дикого типа, PKD2 Мыши ^{SSAA / SSAA} и PKD2 ^{GT / GT} были сопоставимы (C и D, результаты не показаны).Аналогичным образом, развитие B-лимфоцитов в костном мозге происходило нормально в отсутствие каталитической активности PKD2 (результаты не показаны), что приводило к нормальному общему количеству зрелых IgM / IgD-экспрессирующих B-лимфоцитов в селезенках и лимфатических узлах PKD2 ^{SSAA / SSAA} и PKD2 ^{GT / GT} мышей (C и D, результаты не показаны). Таким образом, активность киназы PKD2 необходима для нормального развития зрелых периферических Т- и В-лимфоцитов.

PKD2 необходим для развития зрелых T- и B-лимфоцитов

Экспрессия CD4 / CD8 DP и SP субпопуляций в тимусе дикого типа по сравнению с PKD2 ^{GT / GT} ( A ) или по сравнению с диким типом с мышами PKD2 ^{SSAA / SSAA} ( B ).Анализ субпопуляций периферических Т-клеток (TCRβ ⁺ CD4 ⁺ и TCRβ ⁺ CD8 ⁺ ) и B-клеток (B220 ⁺ IgM ^{lo / +} IgD ^{lo / +} ) в селезенке от мышей дикого типа по сравнению с PKD2 ^{GT / GT} ( C ) или дикого типа по сравнению с мышами PKD2 ^{SSAA / SSAA} ( D ). Ткани мышей с мутантом PKD2 и контрольных однопометников дикого типа собирали через 8–12 недель, окрашивали специфическими антителами и анализировали проточной цитометрией, как описано в разделе «Материалы и методы». Результаты — это средние значения + S.E.M. ( n, ≥ 7 мышей).

Каталитическая активность PKD2 важна для зрелых периферических Т-лимфоцитов

Следующий вопрос, который был задан, заключался в том, играет ли PKD2 какую-либо роль в периферических Т-клетках. Как показано на (A), взаимодействие TCR вызывает устойчивое и устойчивое фосфорилирование PKD2 на Ser ⁷⁰⁷ / Ser ⁷¹¹ и, соответственно, увеличивает каталитическую активность PKD2, что приводит к усилению аутофосфорилирования на Ser ⁸⁷³ . Хорошо известно, что фосфорилирование Ser ⁷⁰⁷ / Ser ⁷¹¹ в каталитическом домене PKD2 опосредуется PKC [36].В этом контексте изоформы PKC, которые участвуют в регуляции фосфорилирования петли активации PKD и активации в ответ на лигирование рецептора антигена, включают PKCδ в B-лимфоцитах [38] и избыточную роль PKCα и PKCθ в T-лимфоцитах (G. Байер, личное сообщение). Также известно, что ферменты PKC играют ключевую роль в Т-лимфоцитах в контроле экспрессии генов цитокинов в клетках, запускаемых TCR [39–41]. Также сообщалось, что PKD2 может активировать репортерные конструкции для цитокина IL-2 в лейкемической Т-клеточной линии Jurkat [42].Поэтому мы спросили, требуется ли каталитическая активность PKD2 для поддержки нормальных реакций активации лимфоцитов.

Каталитическая активность PKD2 важна для функции периферических Т-лимфоцитов.

( A ) Наивные Т-клетки CD8 ⁺ были очищены из трансгенных клеток лимфатических узлов OTI-TCR и стимулированы in vitro специфическим пептидом OVA. В разные моменты времени клетки лизировали, а фосфорилирование и экспрессию белка оценивали с помощью вестерн-блоттинга.( B ) Наивные Т-клетки CD4 ⁺ и CD8 ⁺ очищали отдельно от лимфатических узлов дикого типа, PKD2 ^{SSAA / SSAA} и PKD2 ^{GT / GT} и стимулировали in vitro через TCR в течение 18 часов с увеличением концентрации моноклонального антитела против CD3ϵ. Уровни IL-2 и IFNγ в супернатанте культуры определяли с помощью ELISA. Результаты — это средние значения + S.E.M. для трех образцов и являются репрезентативными для двух отдельных экспериментов.

Сначала мы сравнили пролиферативные ответы лимфоцитов дикого типа и PKD2 ^{SSAA / SSAA} лимфоцитов.Однако мы не наблюдали значительных различий в пролиферативной способности мутантных лимфоцитов PKD2 по сравнению с контролем дикого типа после стимуляции in vitro TCR (результаты не показаны). Однако поразительно, что способность Т-клеток CD4 ⁺ и CD8 ⁺ продуцировать эффекторные цитокины IL-2 и IFNγ была сильно ослаблена в T-лимфоцитах PKD2 ^{SSAA / SSAA} , которые стимулировались in vitro через TCR (B). Таким образом, каталитическая активность PKD2 необходима для эффективного индуцированного рецептором антигена продукции цитокинов в зрелых периферических Т-лимфоцитах.

Мы дополнительно исследовали функцию in vivo каталитической активности PKD2, изучая способность мышей, мутантных по PKD2, вызывать иммунный ответ на модельный антиген. Мы иммунизировали контрольных мышей и мышей PKD2 ^{SSAA / SSAA} NP-OVA, антигеном, который вызывает продукцию антител Т-клеточно-зависимым образом. В разные моменты времени после иммунизации уровни антигенспецифических Ig в сыворотке определяли с помощью ELISA. Как показано на (A), исходные сывороточные титры Ig были нормальными у мышей PKD2 ^{SSAA / SSAA} .Однако мыши PKD2 ^{SSAA / SSAA} показали пониженные антиген-специфические ответы IgM и IgG ₁ по сравнению с ответами мышей дикого типа (B). Таким образом, каталитическая активность PKD2 важна для оптимальных зависимых от Т-клеток ответов антител in vivo .

Каталитическая активность PKD2 важна для эффективных гуморальных иммунных ответов против Т-клеточно-зависимых антигенов.

( A ) ELISA базальных уровней сывороточного Ig у контрольных мышей и мышей PKD2 ^SSAA -knockin.Результаты представляют собой средние значения ± S.E.M. ( n = 4 мыши на генотип). ( B ) PKD2 ^{SSAA / SSAA} и PKD2 ^{Мышей WT / WT} иммунизировали NP-OVA в день 0. Уровни сывороточных анти-NP IgM и IgG ₁ определяли на 8, 14 и 29 дни после иммунизация методом ELISA серийных разведений сыворотки. Результаты представляют собой средние значения ± S.E.M. ( n = 4 мыши на генотип). Статистическая значимость рассчитывалась с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. P = 0,001 и P = 0,081 для уровней NP-специфического IgM и NP-специфического IgG ₁ соответственно.Результаты представляют два независимых эксперимента.

ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения роли PKD1 и PKD2 in vivo мы получили мышей, у которых аллели PKD1 и PKD2 дикого типа были заменены мутантами с заменами аланина для Ser ⁷⁴⁴ / Ser ⁷⁴⁸ и Ser ⁷⁰⁷ / Ser ⁷¹¹ соответственно. Эти сериновые остатки расположены в каталитических доменах PKD, и исследований in vitro показали, что они фосфорилируются классическими / новыми изоформами PKC, тем самым активируя каталитическую активность PKD [36,43]. Важность этих событий фосфорилирования для регуляции PKD in vivo не была известна. Однако неспособность мутанта PKD1 ^{SSAA / SSAA} поддерживать развитие эмбриона теперь показывает, что фосфорирование Ser ⁷⁴⁴ / Ser ⁷⁴⁸ важно для функции PKD1 in vivo . Данные также показывают, что изоформы PKD1 и PKD2 обладают уникальными функциями in vivo : потеря экспрессии PKD1 [24] или каталитической функции (настоящее исследование) приводит к ранней эмбриональной летальности.Напротив, потеря экспрессии PKD2 или каталитической функции in vivo не влияет на нормальное эмбриональное развитие. Более того, взрослые мыши, у которых аллели PKD2 дикого типа удалены или заменены каталитически неактивными мутантами PKD2, являются жизнеспособными и фертильными.

Основной целью настоящего исследования было выяснить, есть ли какая-то уникальная роль PKD2 in vivo . Поразительным открытием настоящего исследования является наше открытие, что PKD2 является основной изоформой PKD, экспрессируемой в Т- и В-лимфоцитах мышей; PKD1 не экспрессируется в этих клетках, тогда как PKD3, по-видимому, экспрессируется только на очень низких уровнях в первичных лимфоидных клетках мыши. Более того, каталитическая активность PKD2 была важна для продукции эффекторных цитокинов после вовлечения TCR. PKD2 также важен для оптимальной индукции ответа антител на модельный антиген. Таким образом, PKD2 играет уникальную роль у взрослых мышей в контроле функции лимфоидных клеток.

PKD являются высококонсервативными ферментами, но эволюция множества изоформ, по-видимому, связана с эволюцией позвоночных, следовательно, амфибии, рыбы и птицы экспрессируют две изоформы PKD, тогда как млекопитающие экспрессируют три члена семейства PKD.PKD беспозвоночных, обнаруженная у Drosophila , наиболее близко гомологична изоформе PKD3 млекопитающих; вторая изоформа PKD, обнаруженная у рыб и земноводных, наиболее похожа на PKD1; напротив, PKD2, по-видимому, эволюционировал у млекопитающих. Настоящие данные показывают, что существует дифференциальная экспрессия изоформ PKD в различных тканях, в частности уникальная экспрессия PKD2 в первичных и вторичных лимфоидных тканях. Какие именно клеточные механизмы контролируют уровни дифференциальной экспрессии различных изоформ PKD в разных тканях и на разных стадиях развития, остается неясным. Почему лимфоциты будут экспрессировать PKD2, а не PKD1, если они обладают общей субстратной специфичностью и регулируются идентичными внутриклеточными механизмами передачи сигналов, также неясно. Тем не менее, неспособность Т-клеток экспрессировать PKD1 позволяет PKD2 играть уникальную неизбыточную роль в Т-клетках, опосредуя индуцированную TCR продукцию основных цитокинов IL-2 и IFNγ.

Индукция продукции IL-2 и IFNγ в ответ на вовлечение TCR опосредуется сигнальными путями DAG и PKC, особенно PKCα и PKCθ [39–41]. Исследования in vitro также показали, что несколько различных изоформ PKC могут фосфорилировать Ser ⁷⁰⁷ и Ser ⁷¹¹ в PKD2, тем самым активируя киназу [36], но важность этого пути для регуляции PKD in vivo не была ранее известный. Неспособность Т-лимфоцитов PKD2 ^{SSAA / SSAA} эффективно продуцировать IL-2 и IFNγ, таким образом, показывает, что PKD функционирует ниже PKC, чтобы контролировать продукцию цитокинов в Т-клетках. Цитокины IL-2 и IFNγ играют решающую роль в адаптивных иммунных ответах, и, таким образом, настоящее исследование также предоставляет доказательства того, что PKD2 играет уникальную неизбыточную роль в контроле функций Т-клеток во время адаптивных иммунных ответов.Роль PKD2 в адаптивных иммунных ответах млекопитающих интригует, потому что DKF-2, PKD Caenorhabditis elegans, действует ниже DAG и PKC, чтобы регулировать врожденный иммунитет у нематод [44]. Следовательно, участие PKD в механизмах, контролирующих иммунные ответы, является консервативным.

Таким образом, наши данные in vivo подтверждают функциональную важность PKC-опосредованных сайтов фосфорилирования серина, расположенных в каталитическом домене PKD, для активации PKD1 и PKD2 и последующей передачи сигналов.Они также предоставляют дополнительные доказательства того, что изоформы PKD могут действовать как нижестоящие эффекторы DAG-регулируемых ферментов PKC in vivo .

ВКЛАД АВТОРА

Шэрон Мэтьюз, Мария Наварро, Линда Синклер, Элизабет Эмсли и Кармен Фейжу-Карнеро провели эксперименты; Шэрон Мэтьюз, Мария Наварро и Дорин Кантрелл разработали эксперименты и проанализировали результаты; Газету написали Шэрон Мэтьюз и Дорин Кантрелл.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим сотрудников отдела ресурсов биологических служб за заботу о мышах и сотрудников лаборатории Кантрелла за критическое прочтение статьи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Этот проект был поддержан стипендией Wellcome Trust (в округе Колумбия) и грантом программы [номер гранта 065975 / Z / 01 / A].

Ссылки

1. Розенгурт Э., Рей О., Уолдрон Р. Т. Передача сигналов протеинкиназы D. J. Biol. Chem. 2005; 280: 13205–13208. [PubMed] [Google Scholar] 2. Спиталер М., Эмсли Э., Вуд С. Д., Кантрелл Д. Локализация диацилглицерина и протеинкиназы D во время активации Т-лимфоцитов. Иммунитет. 2006; 24: 535–546. [PubMed] [Google Scholar] 3.Мэтьюз С. А., Иглесиас Т., Розенгурт Э., Кантрелл Д. Пространственная и временная регуляция протеинкиназы D (PKD) EMBO J. 2000; 19: 2935–2945. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 4. Мэтьюз С. А., Лю П., Спиталер М., Олсон Э. Н., МакКинси Т. А., Кантрелл Д. А., Шаренберг А. М. Важная роль киназ семейства протеинкиназ D в регуляции класса II гистоновые деацетилазы в В-лимфоцитах. Мол. Клетка. Биол. 2006; 26: 1569–1577. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Боссард К., Брессон Д., Полищук Р. С., Мальхотра В. Димерная PKD регулирует деление мембраны с образованием транспортных носителей в TGN. J. Cell Biol. 2007; 179: 1123–1131. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Ли Дж., О’Коннор К. Л., Хеллмич М. Р., Грили Г. Х., младший, Таунсенд К. М., младший, Эверс Б. М. Роль протеинкиназы D в опосредованной секреции нейротензина протеинкиназой C-α / -δ и киназой Rho / Rho. J. Biol. Chem. 2004. 279: 28466–28474. [PubMed] [Google Scholar] 7. фон Вихерт Г., Эденфельд Т., фон Блюм Дж., Krisp H., Krndija D., Schmid H., Oswald F., Lother U., Walther P., Adler G., Seufferlein T. Протеинкиназа D2 регулирует секрецию хромогранина A в нейроэндокринных опухолевых клетках BON человека. Клетка. Сигнализация. 2008; 20: 925–934. [PubMed] [Google Scholar] 8. Йеман К., Аяла М. И., Райт Дж. Р., Бард Ф., Боссард К., Анг А., Маеда Ю., Сеуферлейн Т., Меллман И., Нельсон В. Дж., Малхотра В. Протеин киназа D регулирует выход белков базолатеральной мембраны из транс -сети Гольджи. Nat. Cell Biol. 2004. 6: 106–112.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Ли Дж., Чен Л. А., Таунсенд С. М., младший, Эверс Б. М. PKD1, PKD2 и их субстрат Kidins220 регулируют секрецию нейротензина в линии эндокринных клеток человека BON. J. Biol. Chem. 2008. 283: 2614–2621. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10. Михайлович Т., Маркс М., Ауэр А., Ван Линт Дж., Шмид М., Вебер С., Зеуферлейн Т. Протеинкиназа D2 опосредует активацию ядерного фактора κB с помощью Bcr-Abl в Bcr-Abl ⁺ миелоиде человека лейкозные клетки. Cancer Res.2004. 64: 8939–8944. [PubMed] [Google Scholar] 11. Сторц П., Допплер Х., Токер А. Протеинкиназа Cδ селективно регулирует протеинкиназу D-зависимую активацию NF-κB при передаче сигналов окислительного стресса. Мол. Клетка. Биол. 2004. 24: 2614–2626. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 13. Steiner T. S., Ivison S. M., Yao Y., Kifayet A. Протеинкиназы D1 и D2 участвуют в высвобождении хемокинов, индуцированном Toll-подобными рецепторами 2, 4 и 5. Cell. Иммунол. 2010. 264: 135–142. [PubMed] [Google Scholar] 14. Фугманн Т., Hausser A., ​​Schoffler P., Schmid S., Pfizenmaier K., Olayioye M. A. Регулирование секреторного транспорта с помощью протеинкиназы D-опосредованного фосфорилирования белка-переносчика церамидов. J. Cell Biol. 2007; 178: 15–22. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 15. Watkins J. L., Lewandowski K. T., Meek S. E., Storz P., Toker A., ​​Piwnica-Worms H. Фосфорилирование киназы полярности Par-1 протеинкиназой D регулирует связывание 14-3-3. и мембранная ассоциация. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 2008 г .; 105: 18378–18383.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Динг Г., Сонода Х., Ю. Х., Каджимото Т., Гопараджу С. К., Джаханжеер С., Окада Т., Накамура С. Фосфорилирование, опосредованное протеинкиназой D, и ядерный экспорт сфингозинкиназы 2. J. Biol. . Chem. 2007. 282: 27493–27502. [PubMed] [Google Scholar] 17. Лю П., Шаренберг А. М., Кантрелл Д. А., Мэтьюз С. А. Ферменты протеинкиназы D незаменимы для пролиферации, выживания и регулируемой антигенным рецептором активности NFκB в В-клетках позвоночных. FEBS Lett. 2007. 581: 1377–1382.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Юань Дж., Розенгурт Е. PKD, PKD2 и p38 MAPK опосредуют фосфорилирование серина-82 Hsp27, индуцированное нейротензином в клетках PANC-1 рака поджелудочной железы. J. Cell. Biochem. 2008. 103: 648–662. [PubMed] [Google Scholar] 19. Hausser A., ​​Storz P., Martens S., Link G., Toker A., ​​Pfizenmaier K. Протеинкиназа D регулирует везикулярный транспорт путем фосфорилирования и активации фосфатидилинозитол-4-киназы IIIβ в комплексе Гольджи. Nat. Cell Biol. 2005; 7: 880–886. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20.Остер Х., Абрахам Д., Лейтджес М. Экспрессия семейства протеинкиназ D (PKD) во время эмбриогенеза мыши. Паттерны экспрессии генов. 2006. 6: 400–408. [PubMed] [Google Scholar] 21. Sumara G., Formentini I., Collins S., Sumara I., Windak R., Bodenmiller B., Ramracheya R., Caille D., Jiang H., Platt K. A., et al. Регулирование PKD с помощью MAPK p38δ в секреции инсулина и гомеостазе глюкозы. Клетка. 2009. 136: 235–248. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 22. Park J. E., Kim Y. I., Yi A. K. Протеинкиназа D1 важна для MyD88-зависимого пути передачи сигналов TLR.J. Immunol. 2009. 182: 6316–6327. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 23. Джадали А., Газизаде С. Протеинкиназа D участвует в обратимой приверженности дифференцировке в первичных культурах кератиноцитов мышей. J. Biol. Chem. 2010; 285: 23387–23397. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Fielitz J., Kim M. S., Shelton J. M., Qi X., Hill J. A., Richardson J. A., Bassel-Duby R., Olson E. N. Потребность протеинкиназы D1 в патологических ремоделирование сердца. Proc. Natl. Акад.Sci. США, 2008 г .; 105: 3059–3063. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 25. Ван К. Дж. PKD на перекрестке передачи сигналов DAG и PKC. Trends Pharmacol. Sci. 2006. 27: 317–323. [PubMed] [Google Scholar] 26. Рей О., Юань Дж., Янг С. Х., Розенгурт Э. Протеинкиназа Cν / протеинкиназа D ₃ ядерная локализация, каталитическая активация и внутриклеточное перераспределение в ответ на агонисты рецепторов, связанных с G-белками. J. Biol. Chem. 2003; 278: 23773–23785. [PubMed] [Google Scholar] 27. Оанча Э., Мейер Т. Протеинкиназа C как молекулярная машина для декодирования сигналов кальция и диацилглицерина. Клетка. 1998. 95: 307–318. [PubMed] [Google Scholar] 28. Рей О., Синнет-Смит Дж., Жукова Е., Розенгурт Е. Регулируемый ядерно-цитоплазматический транспорт протеинкиназы D в ответ на активацию рецептора, сопряженного с G-белком. J. Biol. Chem. 2001; 276: 49228–49235. [PubMed] [Google Scholar] 29. Сторц П., Допплер Х., Токер А. Протеинкиназа D обеспечивает передачу сигналов от митохондрий к ядру и детоксикацию от активных форм кислорода митохондрий.Мол. Клетка. Биол. 2005. 25: 8520–8530. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30. Марклунд У., Лайтфут К., Кантрелл Д. Внутриклеточное расположение и контекстно-зависимая функция протеинкиназы D. Иммунитет. 2003; 19: 491–501. [PubMed] [Google Scholar] 31. Хао К., Ван Л., Чжао З. Дж., Тан Х. Идентификация протеинкиназы D2 как основного регулятора пролиферации, миграции и ангиогенеза эндотелиальных клеток. J. Biol. Chem. 2009. 284: 799–806. [PubMed] [Google Scholar] 32. Тан М., Хао Ф., Сюй X., Chisolm G. M., Cui M. Z. Лизофосфатидилхолин активирует новый PKD2-опосредованный сигнальный путь, который контролирует миграцию моноцитов. Артериосклер. Тромб. Васк. Биол. 2009. 29: 1376–1382. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Ван Линт Дж. В., Синнет-Смит Дж., Розенгурт Э. Экспрессия и характеристика PKD, сложного эфира форбола и сериновой протеинкиназы, стимулированной диацилглицерином. J. Biol. Chem. 1995; 270: 1455–1461. [PubMed] [Google Scholar] 34. Мэтьюз С. А., Дайалу Р., Томпсон Л. Дж., Шаренберг А.М. Регулирование протеинкиназы Cν рецептором B-клеточного антигена. J. Biol. Chem. 2003; 278: 9086–9091. [PubMed] [Google Scholar] 35. Мэтьюз С. А., Розенгурт Э., Кантрелл Д. Протеинкиназа D: селективная мишень для рецепторов антигена и последующая мишень для протеинкиназы С в лимфоцитах. J. Exp. Med. 2000; 191: 2075–2082. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Стурани С., Ван Линт Дж., Гилкрист А., Ванденхид Дж. Р., Адлер Г., Сеуферлейн Т. Механизм активации протеинкиназы D2 (PKD2) рецептором CCK _B / гастрина.J. Biol. Chem. 2002; 277: 29431–29436. [PubMed] [Google Scholar] 37. Мэтьюз С. А., Розенгурт Э., Кантрелл Д. Характеристика серина 916 как сайта аутофосфорилирования in vivo для протеинкиназы D / протеинкиназы Cμ J. Biol. Chem. 1999; 274: 26543–26549. [PubMed] [Google Scholar] 38. Pracht C., Minguet S., Leitges M., Reth M., Huber M. Ассоциация протеинкиназы C с рецепторным комплексом B-клеточного антигена. Клетка. Сигнализация. 2006; 19: 715–722. [PubMed] [Google Scholar] 39. Пфайфхофер К., Kofler K., Gruber T., Tabrizi N.G., Lutz C., Maly K., Leitges M., Baier G. Протеинкиназа Cθ влияет на мобилизацию Ca ²⁺ и активацию клеток NFAT в первичных Т-клетках мыши. J. Exp. Med. 2003; 197: 1525–1535. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 40. Pfeifhofer C., Gruber T., Letschka T., Thuille N., Lutz-Nicoladoni C., Hermann-Kleiter N., Braun U., Leitges M., Baier G. Дефектное переключение классов IgG2a / 2b в PKCα ^{— / —} мышей. J. Immunol. 2006; 176: 6004–6011.[PubMed] [Google Scholar] 41. Gruber T., Hermann-Kleiter N., Pfeifhofer-Obermair C., Lutz-Nicoladoni C., Thuille N., Letschka T., Barsig J., Baudler M., Li J., Metzler B., et al. PKCθ взаимодействует с PKCα в аллоиммунных ответах Т-клеток in vivo . Мол. Иммунол. 2009; 46: 2071–2079. [PubMed] [Google Scholar] 42. Ири А., Харада К., Цукамото Х., Ким Дж. Р., Араки Н., Нишимура Ю. Протеинкиназа D2 участвует либо в регуляции промотора IL-2, либо в индукции гибели клеток при стимуляции TCR в зависимости от его активности в Jurkat клетки.Int. Иммунол. 2006; 18: 1737–1747. [PubMed] [Google Scholar] 43. Иглесиас Т., Уолдрон Р. Т., Розенгурт Э. Идентификация in vivo сайтов фосфорилирования, необходимых для активации протеинкиназы D. J. Biol. Chem. 1998. 273: 27662–27667. [PubMed] [Google Scholar] 44. Ren M., Feng H., Fu Y., Land M., Rubin C.S. Протеинкиназа D является важным регулятором врожденного иммунитета C. elegans . Иммунитет. 2009. 30: 521–532. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Комбинированные услуги — Австралийская ассоциация спортивных стрелков (Квинсленд)

КЛАССИЧЕСКОЕ, а не пластиковое — вот что привлекает в соревнованиях SSAA Queensland’s Combined Services, где стрелки могут достать оружие прошлых лет и участвовать в соревнованиях по стрельбе по мишеням.

Будь то легендарная винтовка SMLE Mk III * .303, которую Австралия и Британская империя пережили две мировые войны, шведские винтовки Маузер M96 или M38, ценимые за их точность, прочная винтовка Мосина-Нагана M91 / 30, которая использовалась Советским Союзом во время Вторая мировая война или даже однозарядная учебная винтовка 22-го калибра — все они приветствуются на матче Объединенной службы.

Ключевым компонентом соревнования является матч с тремя позициями (3P) Core, который включает в себя поражение целей на дистанциях 100, 200 и 300 ярдов соответственно, переключаясь между положениями стоя, с колена и лежа.

Другие матчи, снятые в рамках соревнований по комбинированным видам обслуживания, включают в себя умышленное возгорание на дистанции 300 м (только прицельные приспособления!), Соревнования по скоростной стрельбе и соревнования «Действие M», которые включают смену позиций несколько раз во время каждого боя.

В то время как винтовки со скользящим затвором времен Первой и Второй мировых войн, безусловно, являются наиболее часто встречающимся огнестрельным оружием в соревнованиях комбинированных видов вооружений, существуют категории мушкетов, оружия с черным порохом, закаленных или модифицированных винтовок и даже современной полиции. военные и тактические винтовки с оптическим прицелом.

У снайперских винтовок

Vintage также есть свое собственное событие, как и у их современных аналогов.

По общему правилу, огнестрельное оружие должно быть либо «в том виде, в каком оно было выпущено», либо должно быть точным воспроизведением, причем спортивное, улучшенное или модифицированное огнестрельное оружие должно относиться к отдельным категориям выпущенного огнестрельного оружия.

Дисциплина комбинированной службы — это не только длинное оружие, пистолеты также являются важным элементом соревнований.

Пистолеты делятся на пять классов:

• Class One (Военный выпуск)
• Второй класс (вопрос полиции)
• Класс третий (модифицированные / улучшенные пистолеты первого или второго класса)
• Четвертый класс (версии пистолетов с кольцевым воспламенением первого, двух или трех классов)
• Class Five (военные пистолеты с черным порохом)

Полный список разрешенных пистолетов можно найти здесь.

Несколько отделений SSAA по всему штату проводят соревнования по комбинированным видам спорта, и это одна из самых популярных дисциплин для стрелков всех возрастов.

Государственные титулы проводятся ежегодно, обычно в течение долгих выходных, и всегда есть увлекательное множество старинного огнестрельного оружия, которое попадает на линию огня и по-прежнему действует так же точно, как и при первом выпуске — в некоторых случаях более чем век назад.

Комбинированный CSD | silverdalepistolclub

Комбинированные услуги

Комбинированная дисциплина стрельбы из винтовки и пистолета, направленная на поощрение организованной соревновательной стрельбы с целью улучшения знаний о безопасном обращении и надлежащем уходе за военным или служебным огнестрельным оружием.Дисциплина включает в себя более десятка классов служебной винтовки и служебного пистолета, в которых участники используют оригинальные или точные репродукции винтовок с кольцевым воспламенением, центрального огня и черного пороха, а также военные и другие служебные винтовки, карабины, револьверы и самозарядные пистолеты, стреляющие по бумажным мишеням разных размеров и с разных расстояний и позиций.

Основной матч из пистолета — это стрельба из 36 раундов на 3 дистанции. В своде правил есть несколько дополнительных матчей, самый большой из них имеет те же правила и курс стрельбы, что и из обычного служебного пистолета.

Пистолет классов

Пистолеты

должны соответствовать государственному законодательству об огнестрельном оружии для государства проживания участника, который также должен иметь соответствующую лицензию на огнестрельное оружие и регистрацию. 3-позиционное базовое совпадение используется для получения оценки участника. Книга правил содержит множество различных матчей для пистолета, некоторые из которых оцениваются как оцененные, а остальные считаются открытыми.

Пистолеты

, используемые в соревнованиях по стрельбе из комбинированного оружия, должны относиться к одному из следующих классов.

Класс 1

Пистолеты

класса 1 (оборонные) включают оригинальные или точные репродукции служебных пистолетов центрального огня с измененной длиной ствола или калибром только в соответствии с национальными законами и законами штата. Участники могут использовать револьверы или самозарядные пистолеты, которые регулярно выдаются в армию, флот или военно-воздушные силы.

Класс 2

Пистолеты

класса 2 (для правоохранительных органов / полиции) включают в себя оригинальные или точные репродукции служебных пистолетов для центрового огня с измененной длиной ствола или калибром только в соответствии с национальными законами и законами штата.Участники могут использовать револьверы или самозарядные пистолеты, которые являются или были предметом обсуждения для оборонных или правоохранительных организаций. Пистолет класса 1 не может считаться пистолетом класса 2.

Класс 3

Пистолеты

класса 3 (уточненные / модифицированные / прицельные) включают любой служебный пистолет класса 1 или 2 с центральным огнем или его точную копию, которая была изменена по сравнению с исходной спецификацией, либо после производства, либо на заводе, и может иметь регулируемую прицельную стрельбу. прицельные приспособления, рукоятки, изготовленные вручную, стволы, спусковые механизмы, спусковые крючки или компенсаторы.

Класс 4

К пистолетам

класса 4 (с кольцевым воспламенением) относятся любые пистолеты с кольцевым воспламенением, которые в значительной степени воспроизводят функции пистолетов класса 1, 2 или 3.

Класс 5

Пистолеты

lass 5 (Black Powder) включают любой оригинальный выпуск или точную копию военного пистолета с черным порохом, будь то револьвер или однозарядный пистолет, который в основном использовался в армии, флоте, полиции или военизированных силах.

Мишени

Мишени, используемые в соревнованиях по стрельбе из винтовки, включают стандартную мишень SSAA 1200 x 1200 мм для военной / служебной винтовки (Core Target), которая имеет большую черную точку прицеливания.Была разработана мини-мишень Core Target размером 600×600 мм, которая доступна для определенных матчей, но также может использоваться для моделирования больших расстояний на дистанциях с ограничениями по дальности. Подсчет баллов осуществляется по целевому значению, при этом центральная буква «V» используется для определения равных баллов. Выстрел, касающийся линии, оценивается выше.

Мишени, используемые в соревнованиях по стрельбе из пистолета, включают военную мишень для пистолета SSAA 2001. Подсчет очков осуществляется по целевому значению, а центральный значок «X» используется для определения равного счета.Еще раз, выстрел, который касается линии, оценивается по более высокому значению.

Боеприпасы

Combined Services разрешает использование любых боеприпасов, разрешенных законом и одобренных для использования на данном конкретном полигоне. Во время соревнований должны использоваться одинаковые боеприпасы, тип и зарядка. Дух и цель этой дисциплины воплощены в использовании стандартных нагрузок военного назначения. Например, если пистолет имеет маркировку .357, то необходимо использовать патроны .357.Это обеспечивает полную отдачу такого огнестрельного оружия и восстановление прицеливания для последовательных выстрелов.

Пистолетные снаряды могут быть из свинцового сплава с круглым носом, полусвязывающими пулями из свинцового сплава или боеприпасами с рубашкой, в зависимости от разрешенных диапазонов. Зарядные устройства или заряженные магазины могут использоваться на огневой позиции во время соревнований, если это разрешено конкретными правилами матча.

Другая информация о пистолете

Комбинированный пистолет для соревнований разрешает использование пистолета с усилием спускового крючка не менее 1.36кг. Обе ступени спускового крючка двойного действия на револьверах должны соответствовать обеим ступеням. Используемые кобуры должны быть практичными, безопасными, исправными и подходящими для пистолета. В дополнительных соревнованиях, когда требуется вытаскивать из кобуры, стрелок должен иметь квалификацию своего штата или территории, а кобура должна быть такого типа, который закрывает спусковой крючок. Использование перчаток или рукавиц запрещено, за исключением случаев, когда это необходимо по медицинским показаниям. Использование оптических средств, таких как телескопические прицелы, прицелы с красной точкой и оптические прицелы, зрительные трубы или бинокли, во время соревнований запрещено, за исключением случаев, когда они находятся под руководством назначенного официального лица для проверки цели.Стрелку запрещается использовать или носить какие-либо оптические приспособления или устройства любого типа, которые предоставляют ему несправедливое преимущество.

Main Match 3 Range Core Event

25 ярдов (12 выстрелов)

6 выстрелов стоя без опоры за 30 секунд

6 выстрелов сидя без опоры за 30 секунд

10 ярдов (12 выстрелов)

6 выстрелов стоя без поддержки Strong Hand всего за 20 секунд

6 выстрелов Положение на коленях без опоры за 20 секунд

7 ярдов (10 ударов)

• Две серии по шесть выстрелов.

• 6 выстрелов стоя без опоры за 5 секунд

• 6 выстрелов Сильная рука без опоры на коленях всего за 10 секунд

Класс 353–360 Великий магистр

340-352 Мастер

320-339 А Марка

300-319 B Марка

299> Класс C

MATCH 12 — 90 раундов, матч

50 ярдов (24 выстрела)

6 выстрелов лежа в мишень 1 — перезарядка

6 выстрелов сидя или на коленях по мишени 2 — перезарядка

6 выстрелов с правой стороны баррикады по цели 3 — перезарядка

6 выстрелов Левая сторона баррикады на мишени 4

25 ярдов (36 выстрелов)

6 выстрелов с правой стороны баррикады по мишени 4 за 15 секунд

6 выстрелов с левой стороны баррикады по мишени 3 за 15 секунд

6 выстрелов Левая сторона баррикады Цель 1 — перезарядка — 6 выстрелов Правая сторона баррикады за 35 секунд

3 выстрела Цель 1 — 3 выстрела Цель 2 за 6 секунд

2 выстрела Мишень 2-2 выстрела Мишень 3-2 выстрела Мишень 4 за 6 секунд

10 ярдов (18 ударов)

6 выстрелов Цель 4 за 4 секунды

3 выстрела Только левой рукой — 3 выстрела Только правой рукой Цель 3 за 8 секунд

3 выстрела Цель 2 — 3 выстрела Цель 1 за 4 секунды

7 ярдов (12 ударов)

• Одна серия из 12 выстрелов общей продолжительностью 25 секунд — «незрячая» серия (пистолет должен держаться ниже уровня плеча)

• 6 выстрелов в створ 1 — перезарядка — 6 выстрелов в створ 2

Комбинированные услуги | SSAWA

Combined Services — это винтовка и
дисциплина стрельбы из пистолета, направленная на поощрение организованных соревнований
стрельба с целью лучшего знания безопасного обращения и правильного
уход за боевым или служебным огнестрельным оружием.Дисциплина охватывает больше, чем
дюжина классов служебных винтовок и служебных пистолетов, в которых участники используют
оригинальная или точная копия Rimfire, Centrefire и Black Powder Military
и другие служебные винтовки, карабины, револьверы и самозарядные пистолеты стреляют
для очков по бумажным мишеням разного размера и с разного расстояния и
позиции.

Видео о комбинированных услугах здесь

Целью «Комбинированных услуг» является поощрение организованной стрельбы на соревнованиях с целью улучшения знаний о безопасном обращении и надлежащем уходе за служебным огнестрельным оружием.Цель состоит в том, чтобы позволить любому довольно дешево заняться спортом и соревноваться на равных.

Классы винтовок

Стандартные военные винтовки являются обычным делом в этих соревнованиях, а 3-позиционное ядро ​​(на основании которого определяется оценка участника) является основным выстрелом в соревнованиях. Самыми популярными винтовками, используемыми на соревнованиях, являются SMLE и шведские Mausers, также используются P14, M17 и K98.

Список событий был добавлен в последние годы, и популярность использования этого огнестрельного оружия возросла, скорее всего, из-за более низкой стоимости боеприпасов и проблемы использования малокалиберного огнестрельного оружия.

Винтовки, используемые в соревнованиях по стрельбе из комбинированной винтовки, должны относиться к одному из следующих классов.

• Класс A — Короткоствольные (21 «) карабинные винтовки с коротким стволом (100 м).
• Класс B- Средняя дальность (от 200 до 300 м), ручная стрельба по центру ствола или рычага. управляемые или самозарядные многозарядные винтовки
• Класс C- Длинноствольные винтовки для стрельбы на дальние дистанции (более 500 м), включая старинные военные винтовки.
• Класс D- винтовки с затворным патроном, такие как однозарядные ружья с центральным выстрелом с черным порохом и винтовки с центральным выстрелом с падающим блоком.
• Класс E Дульные, однозарядные и не патроны с казенником, включая старинные военные винтовки.
• Класс F Винтовки класса F (снайперские) состоят из двух подклассов. Класс F1 включает в себя винтажные снайперские винтовки подлинных неизмененных в том виде, в каком они были выпущены, и точные репродукции, как до 1 января 1946 года, тогда как класс F2 включает снайперские винтовки в подлинном неизмененном состоянии в том виде, в котором они были выпущены, и точные копии, как после 2 января 1946 года.Винтовки класса F могут использоваться только на соревнованиях, организованных для их класса или комбинации классов.
• Класс H- Класс H (модифицированный / точный) винтовки включают в себя винтовки служебного происхождения и калибра с модификациями, выходящими за рамки служебных спецификаций (например, пластиковая ложа, плавающий ствол, ствол со стеклянной ложей, облегченный спусковой механизм и т. Д.), Или модификация для повышения точности сверх спецификации оригинальной винтовки, предназначенной для регулярного использования, и принятая или оцененная для использования оборонной или правоохранительной организацией для специального выпуска для целей, отличных от винтовки класса F.Винтовки класса H могут использоваться только на соревнованиях, организованных для их класса или комбинации классов.
• Класс J- Винтовки с оптическим прицелом класса J (модифицированные / уточненные) включают винтовки класса H, оснащенные оптическими прицелами. Винтовки класса J могут использоваться только на соревнованиях, организованных для их класса или комбинации классов.
• Класс T Винтовки класса T (тактические) включают винтовки служебного происхождения, оснащенные телескопическим прицелом с дальномерной сеткой, которые могут использоваться Объединенными службами, предназначенными для прицельной стрельбы на расстоянии от 25 до 600 метров.Такие винтовки могут быть подлинными «снайперскими» винтовками в том виде, в каком они были выпущены, или могут быть винтовкой, созданной для удовлетворения этих требований, начиная с 1 января 1991 года. Винтовки класса T могут использоваться только на соревнованиях, организованных для их класса или комбинации классов.
• Класс TR Класс TR (учебные винтовки) включает, помимо прочего, учебные винтовки .22 и .310 Martini Cadet, при условии документального подтверждения права винтовки.

Другая информация о винтовке

Комбинированная винтовка для соревнований разрешает использование любой стандартной военной повязки (оригинальной или точной репродукции).Однако он должен быть прикреплен к оригинальной стропе на винтовке, а не прикреплен пуговицами или ремнями к телу или одежде стрелка или к каким-либо внешним механическим опорам, таким как стойка или поручень. Можно использовать одноточечный ремень, если он является стандартным для данной винтовки. Спусковой механизм винтовки должен быть стандартным военным спусковым крючком с усилием отрыва не менее 2,64 фунта (1,2 кг). Приклад винтовки может быть укорочен, но не «спортивен», и ничего (например, пистолетная рукоятка или насадка) не может быть добавлено, если только винтовка не будет реклассифицирована и не будет отнесена к классу F, H или J.Можно использовать противооткатную накладку, если она надвигается и не имеет выступающих крючков. Использование противооткатных накладок является скорее исключением, чем правилом, и их предполагаемое применение должно соответствовать духу соревнований. Тесьма или ремни, на которых держатся подсумки для журналов, нельзя использовать в качестве поддержки, а куртки для стрельбы не должны иметь каких-либо устройств, укрепляющих или ограничивающих тело. Ремень для винтовки ни в коем случае не должен крепиться к одежде. Кожаные куртки специально исключены. Разрешены пальто с подплечниками или налокотниками.Использование перчаток или рукавиц запрещено, за исключением случаев, когда это необходимо по медицинским показаниям. Использование оптических средств, таких как зрительная труба или бинокль, во время соревнований запрещено, за исключением случаев, когда они находятся под руководством назначенного официального лица для проверки цели.

Классы пистолетов

Пистолеты должны соответствовать государственному законодательству об огнестрельном оружии для государства проживания члена, который также должен иметь соответствующую лицензию на огнестрельное оружие и регистрацию. 3-позиционное базовое совпадение используется для получения оценки участника.Книга правил содержит множество различных матчей для пистолета, некоторые из которых оцениваются как оцененные, а остальные считаются открытыми.

Пистолеты

, используемые в соревнованиях по стрельбе из комбинированного оружия, должны относиться к одному из следующих классов.

Класс 1- Пистолеты Класса 1 (Оборонные) включают оригинальные или точные репродукции служебных пистолетов центрального огня с измененной длиной ствола или калибром только в соответствии с национальными законами и законами штата. Участники могут использовать револьверы или самозарядные пистолеты, которые регулярно выдаются в армию, флот или военно-воздушные силы.

Класс 2- Пистолеты класса 2 (правоохранительные органы / полиция) включают оригинальные или точные репродукции служебного огнестрельного оружия с измененной длиной ствола или калибром только в соответствии с национальными законами и законами штата. Участники могут использовать револьверы или самозарядные пистолеты, которые являются или были предметом обсуждения для оборонных или правоохранительных организаций. Пистолет класса 1 не может считаться пистолетом класса 2.

Класс 3- Пистолеты Класса 3 (Accurized / Modified / Target) включают любой служебный пистолет класса 1 или 2 или точную копию, которая была изменена по сравнению с исходной спецификацией, либо после производства, либо на заводе, и может включать регулируемые прицельные приспособления для стрельбы по мишеням, рукоятки, стволы, спусковые механизмы, спусковые крючки или компенсаторы, настраиваемые вручную.

Класс 4- Пистолеты класса 4 (с кольцевым воспламенением) включают любой пистолет с кольцевым воспламенением, который в значительной степени воспроизводит функции пистолета класса 1, 2 или 3.

Класс 5- Пистолеты класса 5 (черный порох) включают любой оригинальный выпуск или точную копию военного пистолета с черным порохом, будь то револьвер или однозарядный пистолет, который в основном использовался в армии, флоте, полиции или парашютистах. военные силы.

В дополнительных соревнованиях, где требуется вытаскивать из кобуры, стрелок должен иметь квалификацию своего штата или территории, а кобура должна быть такого типа, который закрывает спусковой крючок.Использование перчаток или рукавиц запрещено, за исключением случаев, когда это необходимо по медицинским показаниям. Использование оптических средств, таких как телескопические прицелы, прицелы с красной точкой и оптические прицелы, зрительные трубы или бинокли, во время соревнований запрещено, за исключением случаев, когда они находятся под руководством назначенного официального лица для проверки цели. Стрелку запрещается использовать или носить какие-либо оптические приспособления или устройства любого типа, которые предоставляют ему несправедливое преимущество.

Член S.S.A.A? — Форум серых кочевников