Способ применения протеина: Как принимать протеин для набора массы и похудения

Способ применения протеина. Виды протеина и цель применения

Протеин — научный термин, применяется для обозначения белка. Состав белка человеческого тела включает в себя 20 аминокислот.

Эти аминокислоты делятся на две группы: заменимые и незаменимые. Заменимые аминокислоты организм способен синтезировать самостоятельно из других элементов. Незаменимые аминокислоты должны поступать в организм с пищей или добавками. Если аминокислот не хватает в теле человека, то построение белка невозможно. Это плохо, ведь белок жизненно необходим. Виды, цель применения протеина и рекомендации к употреблению вы найдете ниже. Чем примечательно данное вещество?

Польза

Для чего нужен протеин спортсменам? Одной из функций белка является «моторная функция» — обеспечение сокращения и роста мышц. То есть при грамотно разработанной программе тренировок, без необходимого спортивного питания, мышцы расти не будут. Рекомендуется обеспечить организм теми самыми 10 незаменимыми аминокислотами. Для этого необходим прием вещества. Срок годности протеина для набора мышечной массы зависит от вида продукта.

Инструкция по применению

Как употреблять протеин? В человеческом организме находится большое количество белка, необходимого для жизни, усиливающего иммунную систему, придающего выносливости спортсменам на тренировках. Протеин — незаменимый источник белка.

Как пользоваться протеином? О том, что это нужно спортсменам, знают многие, но что это за вещество и как его принимать — интересуются далеко не все. Для каждого человека предназначена своя порция протеина, учитывая индивидуальные особенности организма, поэтому не стоит забывать о противопоказаниях.

Способ применения протеина: употребляют вещество примерно три раза в день. Выпивают протеиновый коктейль за один час до тренировки. Нормой считается 30-60 г в день. Добавлять можно в воду, сок, молоко, плавно помешивая. Не стоит использовать кипяток, который уничтожает полезные свойства белка. Дневную порцию можно делить на несколько приемов.

Важно! Чтобы набрать мышечную массу, протеин надо принимать между приемами пищи, а также после тренировки для восстановления и наращивания мышц. Для похудения протеином можно заменить несколько приемов пищи, что восполнит белок в организме. В день рекомендуется выпивать не более трех коктейлей. Протеин необходимо принимать в правильном количестве. Такой подход обеспечит необходимое поступление белка в организм и защитит от противопоказаний.

Рейтинг производителей протеина

В спортивном питании спортсменов и любителей бодибилдинга, заинтересованных в наращивании мышечной массы, протеины занимают ведущее положение. В мире существует много производителей этого нужного продукта, но среди спортсменов, употребляющих эти препараты, установлен негласный рейтинг, определяемый спросом. Общий рейтинг устанавливается также в соответствии с мнением различных спортивных изданий и определением соотношения цена-качество.

При выборе предпочтений той или иной фирме учитываются, прежде всего, легкость усвоения, эффективность выпускаемой продукции, оцениваемой по способности вызывать рост мышечной массы, продолжительность их действия в течение и после тренировки, вкусовые качества. Кроме того, ценятся такие свойства, как нейтрализация молочной кислоты, провоцирующей болевые ощущения после тренировки, положительное влияние на гормональный статус и обменные процессы, уменьшение подкожной жировой прослойки, рост иммунитета.

К отрицательным свойствам относят чаще всего высокую стоимость, наличие в составе красителей, подсластителей и ароматизаторов, негативное влияние на пищеварение и другие внутренние органы.

Анализируя рынок с учетом спроса и положительных отзывов покупателей, фирмы-производители протеинов можно расположить в следующем порядке:

1. Optimum Nutrition.
2. Nutrabolics.
3. SAN.
4. MusclePharm.

Порядок рейтинга этих ведущих фирм может меняться в зависимости от характера выпускаемого продукта. Срок годности протеина для набора мышечной массы находится в пределах трех недель.

Кроме того, при выборе фирмы-производителя необходимо учитывать, что каждая компания производит продукты со своими особенностями, преимуществами и недостатками. Поэтому при выборе стоит вначале детально ознакомиться с описанием, инструкцией и правилами приема протеина. Особенно внимательным должен быть подход к наличию противопоказаний и аллергенных свойств у продукта.

Концентрат сывороточного протеина

Сывороточный концентрированный протеин представляет собой подвид пищевой добавки, который состоит из концентрированных субфракций белка. Глобулярные белки получают из молочной сыворотки. Любые суфракции белка (альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин), которые получают из сыворотки, имеют поистине уникальный набор биологических свойств.

Концентрат сывороточного протеина – это наиболее доступная и выгодная форма современного сывороточного белка. Изготавливаемое из сывороточных протеинов спортивное питание очень популярно среди профессиональных атлетов, бодибилдеров и других людей, которые стремятся подтянуть свое тело. Данная пищевая добавка способствует сушке мышц, а также дает возможность быстро восстановить мышечную массу и привести их в нормальное состоянии, воздействуя на рычаги их развития и роста. Уникальным свойством сывороточного концентрированного протеина является его способность воздействия на уровень глутатиона — антиоксиданта и важного элемента трипептида, регулирующего функционирование иммунной системы. В результате выведения из сыворотки белка, в концентрате нередко могут оставаться жиры и лактоза. Это способствует снижению стоимости концентрата сывороточного протеина.

Казеин

Казеин представляет собой разновидность протеина – это особый белок, который имеет молочное происхождение. Данное вещество состоит из минералов, витаминов и аминокислот, которые нужны организму, регулярно подвергающемуся интенсивным тренировкам и нагрузкам. Кальций – это строительный материал, многосоставной белок, желеобразная масса, которая получается из-за створаживания молока ферментами.

Проще говоря, казеин – это разновидность спортивного питания, которое незаменимо при усиленных нагрузках. Это основной компонент спортпита, который используется в качестве специального вяжущего вещества. Он помогает довольно быстро получить удовлетворительный результат, постепенно совершенствуя и улучшая внешний вид тела. Попадая в желудок, казеин превращается в сгусток, который благодаря блокировке желудочного сока долго усваивается, на протяжении длительного времени обеспечивая организму необходимое количество аминокислот, а также чувство сытости.

Принимая казеин, важно учитывать его действие. Это даст возможность не допустить развития нежелательных и даже опасных последствий. Превышение указанной дозировки может привести к расстройству, появлению тошноты и некоторых заболеваний желудка. Также казеин не рекомендуется принимать людям, имеющим индивидуальную непереносимость, дабы не допустить возникновения аллергии, болей, диареи, вздутия и заболеваний желудка.

Гидролизат белка

Гидролизат белка — это простейшие компоненты белковой структуры, которые получены опытным путем на производстве. Их создание и выпуск относится к классу медицинских разработок и показан для введения через зонд, для парентерального питания.

К основным разновидностям гидролизированных продуктов относят протеин, способ применения которого разный:

1. Гидролизин (Л-103) – получают из сыворотки крупного рогатого скота. Гидролиз ведется с применением соляной кислоты, которая разделяет компоненты кровяных сгустков на азотистое основание и минеральные соли, необходимые живому организму для полноценной жизнедеятельности.
2. Гидролизат казеина (ЦОЛИПК) – этот компонент можно встретить почти в каждой адаптированной сухой смеси для детей. Он создается путем кипячения белка казеина и серной кислоты. После фильтрации с участием ионизирующих компонентов продукт получает новую форму, содержащую все основные микроэлементы: кальций, магний, железо, натрий, калий.
3. Аминопептид – готовится из ферментов поджелудочной железы крупного рогатого скота. По своим питательным свойствам аналогичен всем вышеуказанным видам гидролизированного белка. Аминопептид назначается только тем людям, которые перенесли сложную операцию и не способны усваивать более сложные белковые компоненты даже в расщепленном виде.

Изолят сывороточного протеина

Изолят сывороточного протеина считается спортивной добавкой, образованной посредством обработки молочного белка. Эта сыворотка — не что иное, как второстепенный провиант процесса изготовления сыра и других снежных товаров питания. Сывороточный изолят протеина с целью питания в большинстве случаев получают ультра-микрофильтрационным методом. Используется, в основном, для набора массы и качественного роста мышц.

Основные группы

Сывороточный белок делится на три основные группы:

• Сывороточный изолят – форма с высокой степенью очистки (свыше 86 % чистого белка), в которой практически не присутствует жир, холестерин и углеводы.
• Сывороточный концентрат — выделяется малой стоимостью из-за легкости производства, включает в себя 61-86 % белка. Несмотря на это, нет фактов, указывающих на отставание по анаболическому воздействию и иным полезным характеристикам от изолятов.
• Гидролизат — изготавливают путем уничтожения (гидролизации) изолята для того, чтобы увеличить скорость усваивания организмом. Имеет максимальные анаболические свойства, но и, естественно, высокую стоимость. Изолят сывороточного белка довольно быстро перерабатывается организмом и имеет высокое содержание аминокислот, которые доминируют в метаболизме мышечной массы.

Соевый протеин

Соевый протеин является наиболее бюджетным и доступным видом протеина. Его основными характеристиками является доступная цена, концентрация белка, а также наличие в данной добавке жиров, углеводов и лактозы. Это лучший вид протеинов для спортсменов, поскольку он способствует стимуляции роста мышечной массы. Регулярное потребление соевого протеина способствует снижению содержания жиров. Этот фактор необходимо учитывать в питании для формирования подкожного жира. Кроме того, соя снижает высокий уровень холестерина, который может приводить к появлению тромбоза. Потреблении соевого белка заметно снижает риск развития атеросклероза.

Данный вид протеина представляет собой популярный источник очень важных для организма аминокислот, причем их содержание здесь намного выше, нежели в яичном или сывороточном протеине. В соевом белке много аргинина, обеспечивающего укрепление иммунитета. Из-за низкого содержания в составе соевого протеина метионина производители дополнительно обогащают данный белок питательными смесями. Так, соевое питание для спортсменов по своему эффекту и качеству незначительно уступает яичному или молочному протеину.

В бодибилдинге соевый белок используют для сжигания лишнего жира и наращивания мышц. Максимальным эффектом обладают изоляты. Осуществляя обработку сырья, производители спортивных смесей в минимальном количестве используют антинутриенты – антипитательные вещества. Соевый протеин очень удобно использовать, и в нем содержатся белки, которые по своей пищевой ценности и питательности не уступают животным белкам. Способ применения протеина зависит от желаемого результата. В наше время производители выпускают протеин, который не содержит фитоэстрогенов.

Яичный протеин

Самым привычным и знакомым источника белка для людей, занимающихся силовыми видами спорта, являются куриные яйца. В этом продукте содержится животный белок, который прекрасно усваивается, помимо этого в состав куриных яиц входят аминокислоты и различные микроэлементы, которые тоже способствуют росту мышечной массы. Производители спортивных добавок предложили спортсменам более эффективный продукт — яичный протеин, благодаря которому мышечная масса наращивается гораздо быстрее. Яичный протеин представляет собой специальную пищевую добавку в виде порошка, которую получают из натурального куриного белка. Причем в процессе производства такой добавки из куриного белка удаляется жир и остальные лишние компоненты, а также уничтожаются все микробы под воздействием высоких температур. После такой переработки остается лишь чистый протеин, состоящий только из белка.

Достоинства яичного протеина

Эта пищевая добавка практически полностью и быстро усваивается. Кроме того, этот продукт можно использовать для сушки, а также для увеличения сухой мышечной массы. Женщины, которые хотели бы довести до идеала в спортзале свою фигуру, могут принимать эту пищевую добавку, которая поможет ускорить рост мышц в нужных местах.

Противопоказания к употреблению яичного протеина

Существуют некоторые противопоказания, которые нужно учесть тем, кто хочет принимать яичный протеин. В первую очередь, с большой осторожностью следует принимать такой продукт людям, имеющим индивидуальную непереносимость к белку. Кроме того, яичный протеин могут использовать те, кто активно занимается спортом, так как при нехватке физической активности избыточное количество протеина будет способствовать росту не мышечной массы, а жировых тканей.

Изолят молочного белка

Различные виды изолятов белка представляют собой выделенный из различных субстанций и очищенный от посторонних примесей белок. Такие продукты являются одним из главных компонентов спортивного питания. Белок в очищенном виде полезен при наращивании мышечной массы. Какие существуют способы применения протеина данного вида?

Один из лучших продуктов спортивного питания этой категории — изолят молочного белка. Этот продукт получают из натурального цельного молока с помощью специального приема ультрафильтрации, обеспечивающем удаление воды, жиров и углеводов. Конечный продукт содержит 85 % молочного белка, не отягощенного лишними калориями, включающим в себя около 80 % казеина и 20 % полезных для здоровья фракций молочной сыворотки, с благотворным воздействием на иммунную систему человека. Принимая во внимание тот факт, что, несмотря на всю полезность молока, его употребление в натуральном виде является проблематичным для взрослых людей, неоценимой является польза такого препарата, содержащего его главные компоненты в форме изолята.

Таким образом, изолят молочного белка может удовлетворить потребность спортсмена в белковом питании. Он способен заменить употребление цельного молока с его некоторыми негативными качествами, сохраняя самые полезные его свойства.

Как принимать протеин | BBR

В этой статье мы рассмотрим, как принимать протеин и какие бывают его разновидности. Дадим ответы на некоторые популярные вопросы, например: Как правильно принимать протеин для набора мышечной массы или похудения, какие виды протеина самые востребованные.

В этой статье мы рассмотрим, как принимать протеин и какие бывают его разновидности. Дадим ответы на некоторые популярные вопросы, например: Как правильно принимать протеин для набора мышечной массы или похудения, какие виды протеина самые востребованные.

Протеин (от латинского слова «белок») – биологически активная добавка, которая служит дополнением к основному рациону питания. В основном применяется в спорте, но так же и в обыденной жизни, с целью обогащения своего рациона, белком высокого качества.

Существует множество разновидностей протеина, животного и растительного происхождения. Самыми популярными видами считаются: сывороточный, казеиновый, многокомпонентный. На второй план уходят: растительные, яичный и говяжий.

Казеиновый протеин – долгоиграющий протеин, полностью усваивается за 6-8 часов. Идеальный выбор протеина для приема коктейля перед сном, тем самым подавляя катаболизм и обеспечив себя необходимыми аминокислотами во время сна. Казеиновый протеин целесообразно пить в любой период тренировок, он незаменим! Как для набора массы, так и при похудении. Представляем некоторые варианты из нашего ассортимента:

— Protein Fusion 85 2270g, BioTech

— Real Casein 100 1800g, Real Pharm

— Micellar Casein 700g, OstroVit

Комплексный протеин – представляет собой сочетания нескольких видов в одном. Принимая порцию такого протеина, он усваивается ступенчато, от самого быстрого до самого медленного, таким образом, организм получает все необходимые аминокислоты на протяжении длительного времени, ещё и с разных источников белка. Обычно включают свой состав: сывороточный, молочный, казеиновый, яичный и говяжий виды протеина. В бюджетных вариантах, вместо яичного и говяжьего, используют растительные виды. Комплексный протеин пользуется большей популярностью при наборе массы.

Как пить комплексный протеин для набора массы?

Рекомендуется принимать в первой половине дня, в связи с поэтапным усвоением: утром, в середине дня между приемами пищи. Так же можно выпить после тренировки. Одну порцию размешать на 200-300мл воды или молока.
Представляем некоторые варианты из нашего ассортимента:

— Protein Fusion 85 2270g, BioTech

— Syntha 6 2270g, BSN

— Protein Power 1kg BioTech

Сывороточный протеин – самый популярный и востребованный вид протеина, который делится на 3 вида: концентрат, изолят и гидролизат. Между собой, они отличаются степенью очистки и в зависимости от этого – процентным содержанием белка, количеством углеводов, жиров и самым главным – скоростью усвоения.

Как принимать сывороточный протеин? Его нужно пить в течение дня, как дополнительный источник быстроусвояемого белка. Утром, перед тренировкой и после, между приемами пищи. При похудении, рекомендуется пить изолят или гидролизат сыворотки. В таком случае можно принимать добавку в вечернее время, ведь она практически полностью очищена от нежелательных примесей и максимально быстро усваиваются. Представляем некоторые варианты из нашего ассортимента:

— AllWhey Gold 2270g, AllMax

— 100% Whey Protein Professional 2350g, Scitec Nutrition

— Iso Whey Zero Lactose Free 500g bag, BioTech

— Economy WPC 80 700g, OstroVit

Как правильно пить протеин для набора мышечной массы

В период набора массы, нужно потреблять белка 1,5-2г на 1 кг собственного веса. Получать нужное количество белка становится проблематично и здесь на помощь приходит протеин. С его помощью, станет гораздо проще добирать количество белка за сутки и в дальнейшем прогрессировать. У новичков сразу же появляется стандартные вопросы: как правильно употреблять протеин ? Какой лучше выбрать протеин ? Как пить протеин для набора массы?

При наборе массы, рекомендуем первым делом добавить к своему рациону сывороточный протеин и пить его в течение дня. К нему можно подключить казеиновый протеин, который пить только на ночь, перед сном.

Как принимать сывороточный протеин? – Всё очень просто. Приведем основные нюансы по приему белковых коктейлей:

Обязательно принимать после тренировки, спустя 20-30 минут. Лучше размешивать на воде, что бы быстрее усваивался.За 60 минут до тренировки, что бы обеспечить организм аминокислотами.Утром, после пробуждения. С целью подавления катаболизма мышечной ткани, вызванного голоданием организма во время сна (Без приема казеина).
Размешивать на молоке или воде, по желанию. Следует лишь учитывать, что на воде, преимущественно, он будет быстрее усваиваться, а на молоке – будет иметь более насыщенный вкус, повысится содержания белка, углеводов и жиров.

Как правильно пить протеин для похудения

В период диеты (сушки), калории, потребляемые за день, значительно снижаются. Основной закон любой, грамотно составленной диеты для похудения, гласит: В течение дня, потреблять калорий нужно меньше, нежели вы их тратите. С рациона питания убирается всё мучное, сладкое, жаренное и т.д. Оставляем лишь большое количество белка 2-3г на 1кг массы тела, немного сложных углеводов, куда так же входит много клетчатки и обязательно должны присутствовать полезные, ненасыщенные жиры.

В период похудения, выбор падает на сывороточные протеины, а именно изолят и гидролизат, в связи с их максимальной очисткой и высокой биологической ценностью. Съедать настолько большое количество белка становится проблематично, к тому же не всегда есть время на готовку и регулярные приемы судочков с пищей. По этой причине, данные виды протеина – незаменимы!

Давайте разберемся, как принимать сывороточные протеины во время похудения, и какие есть основные нюансы по приему:

В тренировочные дни, обязательными приемами должны быть перед тренировкой и после.Можно принимать утром, но больший приоритет стоит отдать второй половине дня, когда в вашем рационе отсутствуют углеводы, не считая салатов, как источник клетчатки и остается только белковая пища. На замену филе курицы или яичным белкам, можно выпить сывороточный протеин, в размере 1-2 порций.Коктейли, во время похудения, размешивать исключительно на воде. Молочку вообще рекомендуется исключить из своего рациона, в связи с высокой калорийностью и содержанием натрия, из-за которого задерживается вода в организме.

Творог, который обычно потребляют перед сном, рекомендуется заменить казеиновым протеином, ведь он уже очищенный и не будет задерживать воду. Существует 2 вида казеина: казеинат кальция и мицеллярный казеин. Предпочтение стоит отдать второму виду, Мицеллярный казеин дольше усваивается и имеет более высокую биологическую ценность, благодаря щадящей технологии производства.

Надеемся, что эта статья была полезна, и теперь у вас не осталось вопросов, как принимать сывороточный протеин или же, как правильно принимать протеин для набора мышечной массы или похудения.

Протеин, применение протеинов, протеины для мышц и роста

Протеин — Применение протеинов

Экспериментально доказано, что добавление сывороточного протеина в диету людей, уже потребляющих достаточно белка, обязательно приводит к росту мышечной массы тела. Читайте подробнее…

Главное условие мышечного роста — избыток белкового сырья в вашем желудке!

Вы не раз и не два слышали, что культуристу надо есть много натуральных белковых продуктов — мяса, рыбы, яиц и пр. Все это так, не буду спорить, однако у такой позиции есть один уязвимый пункт. Все природные продукты попутно содержат много холестерина. Ну а холестерин, сами знаете, первый враг сердца. Так что высокобелковая диета запросто может выйти вам боком.

С другой стороны, у нас в арсенале есть концентрированные белковые смеси. В них совсем нет холестерина, так что без всякого вреда вы можете принимать их сколько угодно. Тем не менее, многие опытные качки предпочитают порошкам натуральный белок — мол, эффект совсем не тот. А почему? Да потому, что повышенную потребность в белке нельзя покрывать за счет абы какого-протеина. Каждый вид белка имеет свои плюсы и минусы. В этом смысле разработка рациона питания в чем-то напоминает игру в шахматы; здесь нужно двинуть вперед королеву, там — увести из-под удара ладью. Это я к тому, что белковое питание — целая стратегия, которая состоит из неизбежных тактических компромиссов.

Сыворотка или казеин?

Знаете, в чем наша беда? Научное изучение воздействия белка на организм человека началось совсем недавно. И каждый новый эксперимент опрокидывает наши прежние «аксиомы».

Привычно мы считаем лучшим белком сывороточный. Больше того, производители сворачивают производство других белков и скоро на рынке, похоже, не останется ничего другого. Да, сывороточный белок усваивается куда быстрее любого другого. Да, он быстрее насыщает кровь аминокислотами. Но вот научный сюрприз! Быстрое усвоение вовсе не синоним высокого анаболизма, т.е. мышечного роста! Чтобы сывороточный протеин «заработал», его надо есть часто, очень часто — каждые полчаса!

Вот результаты опыта, который поставили на качках французские ученые. Первая группа раз в день получала молочный белок казеин, который, как известно, медленно переваривается в желудочно-кишечном тракте. Вторая группа — аминокислоты в свободной форме, тоже раз в день. Третья — сывороточный белок (раз в день). И четвертая — сывороточный белок, но небольшими порциями 13 раз каждые 20 минут. Спустя 7 часов после приема белка испытуемые обследовались на предмет лейцинового баланса — этот показатель характеризует уровень анаболизма.

Так вот, анаболизм был выше в первой группе, чем во второй. Казеин оказался лучше аминокислот. В третьей группе анаболизм был самым низким. Понятно почему. Сывороточный белок быстро усваивается, но так же быстро покидает кровь. В итоге остаток дня мышцы живут на голодном пайке — аминокислот в крови по минимуму. Ну а самым высоким был анаболизм в четвертой группе, где испытуемые получали сывороточный белок часто.

Итак, все ясно. Ученые, казалось бы, точно установили, какой белок и какой способ его приема наиболее эффективны с точки зрения прироста мышечной массы. Однако, речь идет о выводах науки, а в жизни все по-другому. Вот смотрите.

Сценарий первый. Допустим, вам предстоит напряженный учебный или рабочий день без обеденного перерыва. В этом случае лучший выход — «нагрузиться» казеином под завязку еще утром, до начала работы или учебы. Разовый прием сывороточного протеина посреди дня, вы уже знаете, вас не спасет. А вот казеин помалу будет отдавать в кровь аминокислоты, поддерживая относительно ровный уровень анаболизма.

Сценарий второй. Перед сном тоже лучше всего «заправиться» казеином. Если вы примете сывороточный протеин, то он «действует» от силы несколько часов. А вот казеин — это «долгоиграющий» белок. Он поддержит ваши мышцы до самого пробуждения.

Сценарий третий. Сразу после тренировки необходимо «вкачать» в мускулатуру побольше аминокислот. В данном случае принять надо сывороточный протеин. Тут мощный кратковременный аминокислотный всплеск как раз кстати.

Сценарий четвертый. Если вы ведете, так сказать, свободный образ жизни, то принимать надо сывороточный протеин, и как можно чаще. Разделите дневную норму белка на малые порции и составьте график частого приема порций. Промежуточный интервал — не дольше 3 часов.

Сценарий пятый. Если вы знаете, что в течение ближайших нескольких часов поесть не удастся, примите опять же казеиновый, а не сывороточный белок.

Главное — анаболизм!

По сути дела, все проблемы питания в бодибилдинге упираются в «раскрутку» анаболизма. Наша задача — любой ценой поддерживать организм в анаболическом состоянии. Ясно как день, что одного-единственного универсального белка, отвечающего нашей задаче, не существует. Как мы только что выяснили, каждая схема белкового питания хороша для какого-нибудь одного конкретного случая. Однако кроме основной, «анаболической» функции белки выполняют и другую роль. Например, сывороточный белок содержит (правда, в минимальных количествах) различные пептиды (вещества, также относящиеся к классу белковых соединений). Это альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин, иммунно-глобулины и лактоферрин. У каждого из этих пептидов в организме своя, полезнейшая, задача, Например, лактоферрин осуществляет антиокислительное и противомикробное действие.

Как показали опыты с животными, сывороточный белок способствует укреплению иммунитета. Он также повышает уровень глютатиона — а это один из самых главных антиоксидантов в организме человека. Экспериментально доказано, что добавление сывороточного протеина в диету людей, уже потребляющих достаточно белка, обязательно приводит к росту мышечной массы тела.

Соевый белок также имеет дополнительные преимущества. Соя оказывает антираковое действие и, по мнению ученых, может также способствовать мышечному росту. Например, эксперименты на животных показали, что содержащиеся в соевом белке изофлавоны оказывают ощутимый анаболический эффект.

Итак, подведем итоги. Выбор конкретного белка зависит от разных факторов. Казеин рекомендуется тем, кто ест урывками. Если можете позволить себе есть часто, выбирайте сывороточный белок. И не забывайте о других белках: их разнообразие позволит вам полностью удовлетворить «анаболические» потребности мышц. Кроме того белки, каждый по отдельности и все вместе, укрепят ваше здоровье.

Автор: Хосе Антонио

Спасибо за предоставленный материал Юрию Плеханову (Пресс Аташе Российской гребли).

Протеин сывороточный Mutant Whey 900 гр от Mutant (PVL)

908 гр

Размер порции: 36 гр

Порций в упаковке: ~26

В одной порции   % РДН * Калории 140 ккал 8% Белки 22 г 50% Углеводы 5 г 10%    в т.ч. сахар 2 г   Жиры 3 г 38%    в т.ч. насыщенные жиры 0,2 г   Натрий 70 мг 3% Калий 110 мг 5% Кальций   10% Железо   2% Фосфор   8% Магний   4% Примечание: количество указано из расчета на 1 порцию (36 гр)

† Дневная норма не установлена

* Рекомендуемые дневные нормы основаны на 2000 ккал диете

Оригинальный состав NitroSerum™: (Уникальный профильтрованный через мембраны сывороточный концентрат/комплекс фосфолипидов), микрофильтрованный сывороточный концентрат, сывороточный изолят холодной фильтрации, гидролизованные био-активные пептиды сывороточного изолята ActiNOS®, гидролизованный сывороточный изолят, комплекс контроля дисперсии (инулин, ксантановое гумми, цельный овес, порошок соевых бобов), пептиды глютамина (из гидролизованного пшеничного белка), натуральные и искусственные ароматизаторы, цитрат калия, ацесульфам калия, сукралоза, соевый лецитин.

Способ применения: Размешайте 2 мерные ложки в 250-450 мл холодной воды. Количество порций в день зависит от вашей потребности в белке.

Противопоказания: индивидуальная непереносимость компонентов продукта, беременным и кормящим женщинам. Перед применением проконсультироваться со специалистом.

Примечание: не является лекарственным средством.

Условия хранения: хранить в закрытом состоянии в сухом, прохладном месте. Срок реализации указан на упаковке.

Сывороточный протеин Mutant Whey от ранее известной марки PVL со 100% уверенностью можно сказать, одна из лучших протеиновых формул из всех, которые вы ранее пробовали.

Известно, что сывороточный изолят усваивается очень быстро, однако это не гарантирует того, что они всасываются мышечными рецепторами равномерно. Поэтому в белковой формуле Mutant Whey используется уникальный фосфолипидный комплекс концентрата сывороточного протеина фильтрованный по уникальной мембранной технологии NITROSERUM™. Эта форма сыворотки способствует большему мышечному росту, сохранению и отклику гормона роста. Она усваивается в более стабильном темпе, обеспечивая постоянную поставку белков к мышцам. Помимо этого, в NITROSERUM содержатся натуральные фосфолипиды и больший объем факторов роста (ИФР-1, ИФР-2).

Состав дополнительно обогащен аминокислотами BCAA (лизин, изолейцин, валин), которые усваиваются непосредственно мышечными клетками, миную стадию переработки печенью, поступая сразу же сюда после всасывания в пищеварительном тракте. Аналогично, включенные в состав продукта пептиды практически моментально усваиваются и поступают в кровь, насыщая ее столь необходимыми аминокислотами. Таким образом, Mutant Whey – уникальный препарат для закрытия белкового окна сразу же после тренировки.

Также в состав Mutant Whey входит глютамин, условно-незаменимая аминокислота, жизненно необходимая для роста мышечной ткани. Наши мышцы состоят не менее чем на 60% из глютамина. Понятно, что любой его недостаток станет непреодолимым препятствием на пути роста мышечной массы. Попутно глютамин служит целям укрепления именной системы, что учитывая российский климат, может рассматриваться не только в качестве дополнительного бонуса, но и характеристики, имеющей собственную ценность. Особый способ обработки сырья позволяет сохранить в сывороточном протеине Mutant Whey гораздо больше иммуноглобулина, чем в иных марках сывороточного протеина, что также благоприятно сказывается на иммуностимулирующих свойствах продукта.

Состав Mutant Whey разработан таким образом, чтобы все компоненты усваивались в максимально сжатые сроки, пока мышцы испытывают острую нехватку аминокислот (иначе говоря – пока открыто белковое окно), в максимальном количестве. В Mutant Whey используется комплекс ActiNOS®, состоящий из гидролизованных биологически активных пептидов сывороточного изолята. Они характеризуются тем, что быстрее усваиваются, стимулируют выработку синтазу оксида озота на 950%, увеличивая, тем самым, кровяное русло и накачку.

Также Mutant Whey способствует задержке азота в мышцах, благодаря многоступенчатой системе очистки практически лишен лактозы. Это не только повышает его эффективность для набора мышечной массы, но практически полностью исключает возникновение побочных эффектов (нарушений работы пищеварительного тракта, аллергических реакций), за исключением крайне редких случаев индивидуальной непереносимости.

• Пятикомпонентная сывороточная смесь, улучшающая синтез мышечного белка
• Усилен глютамином
• Без аспартама, подсластитель – сукралоза
• Привычный вкус, отлично подходит для постоянного приема
• Половина от холестерина сыворотки других брендов
• Уменьшено количество лактозы
• Прекрасно размешивается
• Удобные мешки по 5 фунтов

КРЕАТИН И ПРОТЕИН. Как принимать вместе

как принимать вместе

Креатин и протеин ‒ самые популярные спортивные пищевые добавки, каждая разработана для наращивания мышц в рамках силовых упражнений. Хотя обе служат несколько различным целям: первая снабжает мышцы энергией и белками, помогая подпитывать процессы их роста и восстановления, вторая ‒ это белок, благодаря которому формируются мышцы. Они прекрасно дополняют друг друга, хорошо работают вместе в процессе наращивания мышечной ткани. Использование этих пищевых добавок одновременно делает посещение тренировочного зала более насыщенным и эффективным.

Для того чтобы употребление данных препаратов принесло максимальную пользу, атлеты, исходя из особенностей своего организма, разрабатывают специальный график их приема. Знание того, как ваше тело отреагирует на каждую из этих пищевых добавок, поможет вам определить, следует ли их использовать вместе или отдельно, и следует ли их употреблять перед тренировкой или после нее. Идеально принимать креатин до начала тренировки. В таком случае он снабжает организм энергией для проведения силовых упражнений. Однако, принимаемый после, он будет обеспечивать энергию, необходимую вашему телу для роста мышц.

Среди атлетов используются три способа:

• Первый способ. Такой способ лучше применять если вы только начинаете употреблять креатин. Суточная доза должна быть 20 грамм, то есть по 5 грамм данного препарата в каждый прием. Продолжительность ‒ одна неделя. Затем препарат принимают по 5 грамм в сутки, приблизительно за час до начала тренировки. В дни свободные от тренировок пищевую добавку лучше принимать в первой половине дня. Продолжительность такого приема составляет 2-3 недели. Таким образом продолжительность курса ‒ один месяц. Затем следует перерыв в течение месяца.

• Второй способ. При этом способе креатин принимают по 3-5 грамм в день. Длительность употребления оставляет от месяца до шести месяцев. Далее следует перерыв один месяц.

• Третий способ. При этом способе принимать креатин следует чередуя неделю приема с неделей отдыха. Суточная доза приема составляет 20 грамм, по 5 грамм в каждый прием.

Протеин желательно употреблять по 25-30 грамм в сутки, за 20-30 минут до начала тренировки и сразу после завершения. Если тренировки не запланировано, необходимо принимать протеиновый коктейль утром, до первого приема пищи.

Креатин и протеин можно принимать одновременно. В период набора мышечной массы, оптимальная дозировка следующая: 3-5 г креатина+25-30 г протеина+сахар ‒ за час до тренировки и сразу после тренировки. Основой коктейля может быть молоко или сок. Добавление сахара необходимо для создания инсулинового скачка, тогда креатин хорошо усваивается. Для достижения рельефности мускулатуры, через полчаса после посещения тренажерного зала лучше выпить просто протеиновый коктейль на молоке.

 

Креатин не имеет противопоказаний, а лишний ‒ просто выводится из организма.

 

Лучшие сочетания протеина и креатина

 

_______________________________

 

Это все на сегодня, надеюсь вы найдете в моих словах, что-то важное и полезное для себя.

Чтобы не пропустить новые статьи о том, как улучшать свои спортивные результаты с помощью спортивного питания и избегать наиболее распространенных ошибок при его употреблении, присоединяйтесь к нашей официальной странице в Facebook, следите за обновлениями, комментируйте, задавайте вопросы, делитесь своими результатами и достижениями, пишите, о чем еще вам интересно было бы узнать.

Верьте в себя и в свои силы, и не останавливайтесь на достигнутом! Достигайте своих спортивных целей вместе с нами!

 

С верой в ваши результаты,

Сергей Ярмак

и команда «Рowerlifting Мafia»

Как принимать протеин Whey Gold Standard

Тем, кто стремится увеличить объем мышечной ткани и получить рельефную мускулатуру, кроме занятий спортом, необходимо также в достаточном количестве употреблять протеин. Он обеспечивает качественное формирование мышечной ткани и повышает общую выносливость организма, а также ускоряет процесс его восстановления после физической нагрузки. Однако получить протеин в том количестве, которое необходимо для спортсмена, из продуктов питания практически невозможно. В таком случае на помощь приходят спортивные добавки, помогающие восполнить недостаток белка.

Сегодня на рынке биодобавок представлен огромнейший выбор спортивного питания на основе протеина, так что весьма сложно разобраться в их многообразии. Однако самым известным среди них по праву считается протеин 100% Whey Gold Standard, который производится корпорацией Optimum Nutrition. Это действительно качественный и эффективный продукт, способствующий росту мышечных клеток.

Для чего нужен протеин 100% Whey Gold Standard?

Протеин 100% Whey Gold Standard станет отличным выбором для атлетов, которые стремятся увеличить объем мышечной ткани. Данный вид спортивного питания содержит большое количество белков и значительно меньшее – углеводов и жиров, что способствует наращиванию сухой мышечной массы атлета. 100% Whey Gold Standard подходит не только новичкам. Его потребляют и профессиональные бодибилдеры.

Этот продукт содержит исключительно белки, глютамин и ВСАА, которые необходимы для организма спортсмена, что позволит культуристу достичь желаемого результата и получить красивое телосложение, не навредив при этом своему здоровью.

Преимущества протеиновой добавки

100% Whey Gold Standard – это самый известный протеин, занимающий первые позиции в рейтинге спортивного питания по всему миру. Данная пищевая добавка не только отлично выполняет все свои функции, но и благотворно влияет на организм спортсмена:

• 
  способствует ускоренному набору объемов мышечной ткани;

• 
  отлично усваивается;

• 
  питает организм необходимыми микроэлементами и аминокислотами;

• 
  способствует повышению внимательности и улучшению памяти;

• 
  укрепляет иммунитет;

• 
  предотвращает распад мышечных белков;

• 
  способствует ускорению анаболических процессов;

• 
   является источником энергии.

Состав протеиновой добавки 100% Whey Gold Standard

Спортивный продукт 100% Whey Gold Standard создан на основе изолята сывороточного белка, глютамина и аминокислот, а также гидролизованных пептидов сыворотки.

Состав протеина 100% WheyGoldStandard на 1 порцию (30,4 г)

основоположный ингредиент	сывороточный протеин
калорийность	120 ккал
углеводы	4 г
протеин	24 г
жиры	1 г
кальций	140 мг
натрий	210 мг

Благодаря тому, что этот продукт быстро усваивается человеческим организмом, после его приема у спортсмена не возникают проблемы с пищеварением. Для насыщения организма необходимым количеством белков и аминокислот достаточно выпивать всего несколько протеиновых коктейлей в день. Отличная растворимость порошка позволит без труда развести его любой жидкостью.

Рекомендации по применению

Поскольку 100% Whey Gold Standard производится в виде порошка, для потребления его нужно развести в достаточном количестве жидкости. Для этих целей подойдет вода, молочные и кисломолочные продукты или сок.

Итак, одну мерную ложку, а это около 31-го грамма, которая содержится в упаковке продукта, нужно растворить в 200 мл жидкости. Перемешивать до полного растворения. Напиток можно пить в охлажденном виде. Кроме того, для улучшения вкусовых качеств протеинового коктейля можно добавить мед или фрукты, предварительно измельченные до однородной массы.

Рекомендуется принимать первый коктейль натощак. Помните, что завтрак – это основной прием пищи за целый день, так что спустя полчаса после приема добавки плотно позавтракайте. Следующую порцию необходимо выпить перед тренировкой, а еще одну – после ее завершения. В дни отдыха от физических нагрузок принимайте протеиновый коктейль в течение дня.

Добавку также можно использовать в качестве полезного дополнения к любимым продуктам. Например, добавить порошок в кексы или прочую выпечку, которую готовите сами. Таким образом вы сможете насладиться потреблением протеина.

Отзывы о добавке

100% Whey Gold Standard, являясь одним из наиболее известных видов спортивного питания на основе протеина, вызывает множество обсуждений. Отзывы об этом продукте на спортивных форумах являются положительными, что свидетельствует о высоком доверии спортсменов к добавке. Атлеты отмечают, что после приема продукта не возникает проблем с пищеварением, а сам протеин отлично усваивается организмом.

Часто возникает вопрос о том, с каким вкусом выбрать добавку. Ведь если не угадать со вкусом, то потребление порошка будет вызывать только негативные
ассоциации. По мнению большинства культуристов, наибольшим спросом пользуется 100% Whey Gold Standard со вкусом шоколада.

Какие бывают виды протеина и зачем его принимать? – Москва 24, 01.12.2018

Обозреватель портала Москва 24, фитнес-эксперт и телеведущий Эдуард Каневский рассказывает, какие существуют виды протеина. Так что читаем и подбираем тот, который подойдет именно нам.

Фото: depositphotos/Wavebreakmedia

У профессиональных тренеров есть такое выражение: мышцы растут на диване. Любой новичок или человек, который вообще никогда не занимался в тренажерном зале, сначала воспринимает данные слова с изумлением, а потом и энтузиазмом. Это так здорово – лежать, ничего не делать, а вместо живота будут расти мышцы!

Расти-то они действительно будут, но при соблюдении одного важного правила: сначала нужно как следует потренироваться, создать условия для роста мышц, а уже потом во время отдыха они восстанавливаются и увеличиваются в объемах. И этот процесс не такой быстрый, как хотелось бы многим новичкам, но если заниматься регулярно, результат не заставит себя ждать.

Чтобы в период «диванного» отдыха мышцы восстанавливались и становились больше, важно вовремя и в нужном количестве употреблять главный «строительный материал» для них, а именно – белки, или протеины.

И их должно быть много, до 1,5-2 граммов протеина на килограмм веса. И те, кто хотя бы раз пытались «набрать» такое количество белка из обычных продуктов, знают, что в таком случае приходится постоянно есть. Вот именно с целью уменьшения количества приемов пищи и более быстрого усвоения белка и был придуман такой вид спортивного питания, как протеины.

Что же это такое, не «химия» ли это? Вопрос уместный, поэтому нам важно не только разобраться, что же такое протеины, но и какие их виды бывают вообще и какой может подойти именно вам.

Фото: depositphotos/KostyaKlimenko

Протеин – это белок в такой концентрации, что за один прием вы получаете количество, необходимое для подпитки ваших мышц после тренировки, во время сна или в период, когда у вас большие перерывы между приемами пищи. Собственно, мы сейчас сразу и разобрались, когда пить протеин. Как правило, это одна-две порции в день.

Так как же его получают? Если это хороший бренд (так как на рынке спортивного питания так же попадаются некачественные марки), то протеин получают заводским способом, путем отделения (фильтрации) от чистого белка балластных веществ: углеводов, жиров и прочих соединений. То есть остается практически чистый белок (концентрат). И в дальнейшем протеин могут обогащать разными питательными веществами, витаминами, а также добавляют ароматизаторы для улучшения вкусовых свойств. Сам протеин смешивают с водой, молоком или соком в шейкере или взбивают в блендере.

Каким бывает протеин?

Сывороточный – это самый распространенный вид, делают его из сыворотки молока. Он бывает нескольких видов:

– обычный сывороточный протеин (как правило, на банках пишут Whey protein). Его особенностью является то, что в составе, помимо белка, есть небольшое количество углеводов и жиров. Такой протеин идеально подходит как дополнительный источник белка в промежутках между приемами пищи.

– сывороточный изолят (Iso whey). Это протеин, полностью очищенный от других веществ. Особенностью такого белка является скорость его усвоения: она максимально большая, в отличие от обычного протеина. Данный вид белка идеально подходит для приема сразу после тренировки.

– казеиновый протеин (casein). Это вид белка, особенностью которого является скорость усвоения: благодаря более сложной молекулярной структуре, белок расщепляется дольше обычного протеина, постоянно подпитывая ваши мышцы. Такой тип идеально подходит для приема перед сном.

Фото: depositphotos/Syda_Productions

– часто взрослые люди имеют так называемую непереносимость лактозы (молочный сахар, который может вызывать и аллергические реакции). Для таких людей был выпущен безлактозный сывороточный протеин, который будет являться отличной альтернативой обычному протеину по полезным свойствам без проблем для здоровья.

Поговорим про яичный протеин (egg protein) на основе яичного белка. Доказано, что аминокислотный состав яичного белка наилучшим образом усваивается нашим организмом. Именно по этой причине профессиональные бодибилдеры употребляют яичные белки десятками в сутки. Плюс, в яичном протеине нет жиров и углеводов, что делает его полезнее. Единственным минусом такого протеина является цена, ведь он гораздо дороже протеина на сывороточной основе.

Есть и соевый протеин (soy protein) – отличный вид протеина для вегетарианцев, которых, в том числе, среди спортсменов, становится все больше.

Кнопляный протеин (hemp protein) – еще экзотичный, но уже продающийся в России вид протеина. Несмотря на название, данный протеин является отличным вариантом и конкурентом другим видам. И не зря! Ведь помимо хорошо усвояемого белка, в конопляном протеине много витаминов, минералов, омега-3 и омега-6 жиров, что делает его по-настоящему полезным.

И, наконец, говяжий протеин (beef protein) – пожалуй, самый необычный вид, который я пробовал лично. Производители утверждают, что такой вид белка отлично усваивается и дает лучше результат в приросте мышечной массы, в отличие от других видов протеина. Все возможно, но лично меня сильно смутил вкус, который активно «разбавляют» разного рода ароматизаторами. Только представьте себе говядину со вкусом малины! И, действительно, когда делаешь себе такой напиток, вкусовые свойства кажутся очень странными, даже неприятными. Но, это мое мнение, возможно, именно вам понравится данный вид протеина, и с ним ваши результаты станут лучше.

Определение белка — имеет значение метод

3.2. Непрямое определение белка

3.2.1. Содержание белка на основе определения азота

Некоторые из наиболее часто используемых методов определения пищевого белка основаны на анализе общего содержания азота в образцах. Примерами таких методов являются метод Дюма [21] и метод Кьельдаля [15]. В обоих методах общий азот в образце выделяется при высокой температуре. В методе Кьельдаля азот выделяется в сильную кислоту, и ее содержание измеряется после нейтрализации и титрования.В методе Дюма азот выделяется в газообразной форме и определяется детектором теплопроводности после удаления углекислого газа и водных аэрозолей. В качестве примера этого аналитического принципа в данном исследовании был выбран метод Кьельдаля, поскольку он до сих пор признан официальным методом определения пищевого белка Международной организацией по контролю за пищевыми продуктами [14]. После определения азота содержание сырого протеина рассчитывается с использованием коэффициента пересчета. Первоначальный и до сих пор часто используемый коэффициент преобразования 6.25 основан на предположении, что общее содержание азота в пищевых белках составляет 16% и что весь азот в пищевых продуктах связан с белками. Это, однако, довольно грубые предположения, поскольку относительное содержание азота варьируется между аминокислотами, а аминокислотный состав варьируется между пищевыми белками [22]. Кроме того, широкий спектр других соединений, таких как нитрат, аммиак, мочевина, нуклеиновые кислоты, свободные аминокислоты, хлорофиллы и алкалоиды, содержат азот. Эти соединения называются небелковым азотом, и их относительное содержание в овощах часто выше, чем в продуктах животного происхождения [5].На протяжении многих лет было доказано, что коэффициент преобразования 6,25 в большинстве случаев переоценивает содержание белка, и для корректировки этих изменений было предложено несколько коэффициентов преобразования для конкретных видов [6,7,16,22], что делает преобразование азота в белок более точное.

3.2.2. Сравнение аминокислотного анализа и метода Кьельдаля

Приведены результаты аминокислотного анализа и анализа Кьельдаля сырья.Представлены как традиционный коэффициент преобразования 6,25, так и соответствующие коэффициенты преобразования для конкретных видов. Для рыбы, креветок и муки в этих расчетах использовались видоспецифические факторы, представляющие собой средние коэффициенты пересчета, предложенные Mariotti et al. [7], а именно 5,6 для рыбы и креветок и 5,4 для злаков. Коэффициент преобразования, используемый для dulse, — это коэффициент, предложенный Lourenço et al. [16] как среднее значение для красных водорослей, а именно 4,59.

Таблица 1

Содержание белка по результатам аминокислотного анализа и анализа азота по методу Кьельдаля в треске, лососе, креветках, белой и цельнозерновой муке и дульсе (красные водоросли).

Сырье
Виды	Аминокислотный анализ	Кьельдаль (фактор 6,25)	Кьельдаль (факторы, зависящие от вида)
Треска	111,6 ± 9,1 35 a 185,7 ± 15,0 b	166,4 ± 13,4 b (5,6)
Лосось	121,4 ± 6,3 a	208,1 ± 7,3 c	186.5 ± 6,6 b (5,6)
Креветки	83,8 ± 8,6 a	132,7 ± 4,7 c	117,8 ± 4,4 b (5,6)
Белая мука (пшеничная)	77,9 ± 6,5 a	117,6 ± 7,3 c	101,6 ± 6,3 b (5,4)
Цельная мука (пшеничная)	88,2 ± 3,8 a	133,4 ± 7,8 С	115.3 ± 6,8 b (5,4)
Дульсе (красные водоросли)	105,3 ± 9,1 a	152,1 ± 10,0 b	111,7 ± 7,3 a (4,59)

Как и ожидалось, все результаты Кьельдаля с использованием традиционного коэффициента преобразования были значительно выше, в диапазоне от 44% до 71% выше, чем соответствующие результаты аминокислотного анализа. Что еще более удивительно, за исключением красных водорослей, видоспецифические коэффициенты преобразования также дали значительно более высокое содержание белка, чем аминокислотный анализ.Одно из возможных объяснений может заключаться в том, что концентрация некоторых аминокислот в образце была снижена в результате процесса гидролиза перед анализом аминокислот, и что концентрация белка, рассчитанная на основе этого анализа, на самом деле была занижена. Другое возможное объяснение может заключаться в том, что «реальные» коэффициенты пересчета для этих видов на самом деле должны быть даже ниже, чем средние значения, указанные Mariotti et al. [7]. Расчет коэффициентов пересчета на основе результатов этого исследования дал коэффициент 4.9 для рыбы и креветок и 4,7 для муки соответственно.

Существуют риски, связанные с вычислением протеина по азоту и, как следствие, завышенной оценкой содержания протеина. Одним из них является возможность фальсификации продуктов питания, поскольку высокое содержание белка часто повышает экономическую ценность продукта [23]. Были случаи, когда производители для увеличения кажущегося содержания белка [24] и, следовательно, экономической ценности пищевого продукта добавляли небелковый азот, такой как меламин.Это может поставить под угрозу безопасность пищевых продуктов для потребителей, и, следовательно, важно, чтобы такая фальсификация пищевых продуктов была невозможна. Другой риск заключается в том, что потенциал использования и экономическая целесообразность «нового» сырья могут быть переоценены, поскольку белок является одним из компонентов продукта с потенциалом создания добавленной стоимости. Таким образом, переоценка может дать ложные предпосылки для создания новых производств. Например, за последние десятилетия значительно возрос интерес к промышленному использованию морских водорослей.Несколько исследований показали, что содержание белка в некоторых видах красных морских водорослей составляет 30–45% [25,26], тогда как при анализе с помощью аминокислотного анализа оно обычно колеблется от 10% до 20% [11,27,28]. Такая разница может иметь решающее значение для экономики малых предприятий.

3.2.3. Спектрофотометрические методы и экстракция белков

Третьим распространенным аналитическим методом анализа белков является спектрофотометрия. Здесь принцип заключается в том, что функциональные группы или области в белке поглощают свет в ультрафиолетовом или видимом диапазоне электромагнитного спектра (200-800 нм).Это поглощение считывается и сравнивается с известными стандартами белка. Примерами таких функциональных групп или областей являются основные группы, ароматические группы, пептидные связи или агрегированные белки.

Хотя и азотный, и аминокислотный анализ можно проводить без какой-либо предварительной обработки сырья, экстракция белков является предварительным условием перед отправкой материала на спектрофотометрический анализ. Также для экстракции белка существует множество методов. Наиболее распространенные протоколы экстракции белков основаны на воздействии на ткань слабых буферов или воды, что приводит к коллапсу клеток с последующим высвобождением внутриклеточных белков в ответ на возникающий гипотонический шок.Это очень эффективно для тканей, содержащих клетки без клеточных стенок (клетки животных), но не так эффективно для клеток с клеточными стенками (клетки растений). Последнее связано с клеточными стенками, защищающими клетку от коллапса [29]. В это исследование были включены как источники белка животного происхождения, так и источники белка растительного происхождения, чтобы оценить эти различия.

Одним из наиболее распространенных методов экстракции белков, особенно перед электрофорезом, является использование так называемых буферов Гуда, ряда буферов, впервые описанных в 1966 г. Good et al.[8]. Эти буферы содержат химические вещества с цвиттерионными свойствами вместе с одним или несколькими детергентами и, как известно, хорошо совместимы с биологическими анализами. Они хорошо растворимы в воде, обладают низким солевым действием и минимальным вмешательством в биологические функции [10]. Основным недостатком этих протоколов является то, что они включают в себя несколько дорогостоящих химикатов, и некоторые из них предположительно наносят вред здоровью. В этом исследовании смесь HEPES (цвиттерионный агент) и CHAPS (детергент) была выбрана в качестве примера этого принципа.

Белки часто делятся на четыре основных класса в зависимости от их свойств растворимости. Четыре класса — это водорастворимые альбумины, глобулины, растворимые в слабых ионных растворах, глютелины, растворимые в слабокислых или основных растворах, и проламины, растворимые в 70% этаноле. Большинство пищевых продуктов представляют собой сложные матрицы, вероятно, содержащие несколько из этих классов белков и объединение нескольких растворенных веществ, вероятно, оптимизирует выход экстракции. В Mæhre et al. [9] было показано, что объединение H ₂ O, 0.1 M NaOH и 3,5% NaCl при повышенной температуре увеличивали выход экстракции по сравнению с традиционными методами экстракции, поэтому в данном исследовании этот метод был выбран в качестве примера более простого метода экстракции белка.

In, выходы экстракции двух различных методов экстракции представлены как содержание белка по отношению к соответствующему сырью, рассчитанное после аминокислотного анализа. Как видно, экстракция белков с использованием протокола HEPES / CHAPS была совершенно неэффективной, что приводило к очень низким выходам для всего сырья.Было показано, что солевая / щелочная экстракция дает значительно более высокие выходы для всего сырья. Кроме того, было показано, что протокол «соль / щелочь» был очень эффективным для экстракции белков животного происхождения, позволяя извлечь более или менее 100% белка. Он также был достаточно эффективным для извлечения белков из высоко переработанного растительного сырья (белой муки), давая выход около 80%. Однако выход экстракции был ниже в менее обработанных и более сложных растительных материалах, таких как цельнозерновая мука и дульсе, последнее сопоставимо с результатами предыдущего исследования [9].

Таблица 2

Выходы экстракции белка рассчитаны на основе аминокислотного анализа трески, лосося, креветок, белой и цельнозерновой муки и дульса.

Сырье
Виды	Выход экстракции Соль / щелочь	Выход экстракции HEPES / CHAPS
Треска	106,8 ± 11,2 b	13,8 ± 3,0 a 900
Лосось	99.9 ± 13,3 b	31,9 ± 2,1 a
Креветки	113,3 ± 17,0 b	14,4 ± 2,2 a
Белая пшеничная мука	78,5 ± 11,1 b	15,0 ± 3,7 a
Цельнозерновая мука	66,1 ± 20,9 b	20,4 ± 3,2 a
Dulse (красные водоросли)	34,9 ± 6.7 b	12,0 ± 1,6 a

Одно из различий между двумя выбранными методами экстракции состояло в том, что солевую / щелочную экстракцию проводили при 60 ° C, а HEPES / CHAPS проводили на льду, и это могло вносят свой вклад в разницу в выходе экстракции. Экстракция на льду, вероятно, защищает белки от разложения, тогда как термическая обработка может ускорить это. Таким образом, метод экстракции следует выбирать исходя из цели дальнейшего использования.Однако в этом исследовании цель состояла в том, чтобы просто изучить различия в выходе экстракции белка между методами, и, таким образом, деградация белка не анализировалась.

После экстракции было протестировано определение белка с использованием двух различных спектрофотометрических методов, метода Брэдфорда [18] и модифицированного метода Лоури [17], которое сравнивалось с аминокислотным анализом. В методе Брэдфорда краситель Кумасси G-250 реагирует с ионизируемыми группами на белке, нарушая третичную структуру белков и обнажая гидрофобные карманы.За этим следует связывание красителя с гидрофобными аминокислотами с образованием стабильных комплексов, которые можно считывать при 595 нм [3]. Модифицированный метод Лоури представляет собой комбинацию метода Биурета, где ионы меди реагируют с пептидными связями в белке, и реакции между реагентом Фолина-Чокальтеу и кольцевой структурой ароматических аминокислот. Полная реакция образует стабильный комплекс темно-синего цвета, который можно прочитать при 650–750 нм [3].

3.2.4. Сравнение аминокислотного анализа и спектрофотометрических методов

In результаты определения белка с помощью аминокислотного анализа, метода Брэдфорда и модифицированного метода Лоури показаны для солевых / щелочных экстрактов, а в тех же анализах показаны для HEPES / CHAPS. экстракты.В солевых / щелочных экстрактах как метод Брэдфорда, так и модифицированный метод Лоури дали более высокие оценки белка, чем аминокислотный анализ белков животного происхождения. То же самое наблюдалось при использовании модифицированного метода Лоури для растительных белков, в то время как метод Брэдфорда давал такие же или более низкие оценки белка, чем аминокислотный анализ. В экстрактах HEPES / CHAPS было невозможно получить какие-либо результаты с использованием модифицированного метода Лоури. Метод Брэдфорда дал более высокие оценки белка, чем аминокислотный анализ для всего сырья, за исключением дульса.

Таблица 3

Содержание белка рассчитано на основе аминокислотного анализа, анализа Брэдфорда и модифицированного анализа Лоури в солевых / щелочных белковых экстрактах трески, лосося, креветок, белой и цельнозерновой муки и дульсе.

Солевые / щелочные белковые экстракты
Виды	Аминокислотный анализ	Брэдфорд	Модифицированный Лоури
Треска	118,8 ± 9,8 a	198.7 ± 24,1 b	194,5 ± 11,4 b
Лосось	120,9 ± 13,9 a	234,6 ± 10,6 c	211,9 ± 9,2 b
Креветки	93,9 ± 7,8 a	165,5 ± 10,3 b	151,2 ± 8,2 b
Белая мука (пшеничная)	60,9 ± 8,1 b	45,0 ± 6,6 a	85 .7 ± 12,3 c
Цельная мука (пшеничная)	58,2 ± 18,6 a	46,2 ± 18,5 a	88,8 ± 27,3 b
Dulse (красные водоросли)	36,9 ± 9,1 a	48,4 ± 3,9 a	89,5 ± 15,9 b

Таблица 4

Содержание белка рассчитано на основе аминокислотного анализа, анализа Брэдфорда и модифицированного анализа Лоури в белке HEPES / CHAPS экстракты трески, лосося, креветок, белой и цельнозерновой муки и дульсе.

Белковые экстракты HEPES / CHAPS
Виды	Аминокислотный анализ	Брэдфорд	Модифицированный Лоури
Треска	15,3 ± 2,7 a	39,4 ± 7,5 b 900	н.о.
Лосось	38,7 ± 3,3 a	98,4 ± 3,1 b	n.a.
Креветки	11.9 ± 0,7 a	25,7 ± 1,6 b	нет данных
Мука белая (пшеничная)	11,6 ± 2,7 a	18,5 ± 3,9 b	n.a.
Цельная мука (пшеничная)	18,0 ± 2,8 a	30,0 ± 5,0 b	n.a.
Дульсе (красные водоросли)	12,5 ± 1,4 b	7,8 ± 1,3 a	n.а.

Метод Лоури широко используется для определения белка в течение многих десятилетий благодаря своей простоте и доступности. Однако, помимо ароматических аминокислот, с реагентом Фолина – Чокальтеу вступает в реакцию целый ряд других соединений [30]. В сложных пищевых матрицах, содержащих несколько мешающих соединений, это обычно приводит к завышению содержания белка, что также показывают результаты солевой / щелочной экстракции. Одним из соединений, которое, как было показано, мешает протоколу Лоури, является HEPES [31].В этом исследовании реакция между буфером HEPES / CHAPS и реагентом Лоури дала очень сильный фоновый цвет как в стандартах, так и в экстрактах, что сделало невозможным получение точных результатов по белку. Обычно считается, что метод Брэдфорда менее подвержен таким помехам. Однако результаты этого исследования показывают, что также для некоторых видов сырья оценки белка очень высоки по сравнению с аминокислотным анализом, что указывает на то, что может быть какое-то вмешательство.Возможным объяснением также может быть разница в эффективности экстракции разных аминокислот. В анализе Брэдфорда основные аминокислоты вносят больший вклад в окончательный цвет, чем другие аминокислоты [3], в то время как ароматические аминокислоты вносят больший вклад в развитие цвета в модифицированном методе Лоури. Как видно на фиг., Имелись некоторые существенные различия в эффективности экстракции между гидрофобными (пролин, глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин и фенилаланин), ароматическими (тирозин, фенилаланин, триптофан и гистидин) и основными (лизин, гистидин и аргинин) аминокислоты.Однако этот эффект варьировался между видами, и единственный значительный эффект при рассмотрении всех материалов заключался в том, что метод HEPES / CHAPS, по-видимому, извлекал гидрофобные аминокислоты более эффективно, чем другие методы.

Таблица 5

Относительное количество гидрофобных, ароматических и основных аминокислот (АК) в сырье и белковых экстрактах после экстракции с использованием HEPES / CHAPS и соли / щелочи в треске, лососе, креветках, белой пшеничной муке, цельнозерновой муке и dulse, как и у всех видов.

		Сырье	HEPES / CHAPS	Соль / щелочь
Треска	Гидрофобный AA	37,8 ± 0,9 ab	42,8 ± 3,2 b	35,7 ± 1,3 a
	Ароматический АА	9,3 ± 1,7	9,4 ± 2,4	8,0 ± 2,7
	Основной АА	19,6 ± 0,3	19,2 ± 1,2	18.7 ± 0,6
Лосось	Гидрофобный AA	39,4 ± 1,0 a	44,3 ± 1,0 b	39,5 ± 1,6 a
	Ароматический AA	10,1 ± 1,4	9,0 ± 3,3	8,7 ± 3,0
	Basic AA	20,0 ± 0,2	18,2 ± 1,4	20,0 ± 3,1
Креветки	Гидрофобные AA	38,4 ± 0,4 a	47.3 ± 1,2 b	38,0 ± 2,5 a
	Ароматический AA	10,2 ± 0,9 b	4,2 ± 0,9 a	8,7 ± 2,1 b
	Базовый AA	19,8 ± 0,2 b	17,6 ± 1,1 a	19,8 ± 0,7 b
Белая мука (пшеничная)	Гидрофобная AA	41,2 ± 0,9 b	40.5 ± 1,4 b	37,4 ± 0,6 a
	Ароматический AA	8,9 ± 1,1 a	9,4 ± 2,7 ab	11,5 ± 0,5 b
	Basic AA	8,6 ± 0,3 a	11,0 ± 0,5 b	7,9 ± 0,7 a
Цельная мука (пшеничная)	Гидрофобный AA	40,9 ± 0,5 b	38.6 ± 0,6 a	40,0 ± 1,7 ab
	Ароматический AA	9,4 ± 1,1	10,6 ± 0,3	8,1 ± 2,2
	Basic AA	10,2 ± 0,2 b	12,4 ± 0,5 c	8,4 ± 0,4 a
Dulse (красные водоросли)	Hydrophobic AA	43,5 ± 1,4 b	34,6 ± 2,7 a	46,3 ± 2.3 b
	Ароматический AA	10,3 ± 0,5 b	1,6 ± 0,2 a	9,3 ± 1,8 b
	Basic AA	14,0 ± 1,7 c	4,4 ± 0,8 a	6,9 ± 0,7 b
Все виды	Гидрофобный AA	40,2 ± 2,1 ab	41,4 ± 4,5 b	39,5 ± 3,8 a
	Ароматический AA	9.7 ± 1,2	7,4 ± 3,8	9,1 ± 2,3
	Basic AA	15,4 ± 4,8	13,8 ± 5,4	13,6 ± 6,2

Простое описание методов выделения и очистки белков

Endocrinol Metab (Сеул). 2017 Март; 32 (1): 18–22.

Чанг-Хун Ли

Школа бакалавриата, Колледж трансдисциплинарных исследований, Институт науки и технологий Тэгу Кёнбук (DGIST), Тэгу, Корея.

Школа бакалавриата, Колледж трансдисциплинарных исследований, Институт науки и технологий Тэгу Кёнбук (DGIST), Тэгу, Корея.

Автор, ответственный за переписку: Чанг-Хун Ли. Школа бакалавриата, Колледж трансдисциплинарных исследований, Институт науки и технологий Тэгу Кёнбук (DGIST), 333 Techno jungang-daero, Hyeonpung-myeon, Dalseong-gun, Daegu 42988, Корея. Тел .: + 82-53-785-6612, Факс: + 82-53-785-6609, rk.ca.tsigd@hceel

Поступила в редакцию 31 декабря 2016 г .; Пересмотрено 16 января 2017 г .; Принято 8 февраля 2017 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), которая разрешает неограниченное некоммерческое использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.

Abstract

На летнем семинаре Корейского эндокринного общества, состоявшемся в 2016 году, некоторые примеры экспериментов с белками обсуждались на сессии под названием «Все о работе с белками.«В отличие от того, что предполагало название, было нереалистично всесторонне обсуждать все методы анализа белков. Таким образом, цель состояла в том, чтобы обрисовать экспериментальные методы белка, которые могут быть полезны в исследованиях или лабораторных работах. Однако в беседах с клиницистами я всегда чувствовал, что у исследователей, которые не занимаются лабораторной наукой, другие требования, чем у тех, кто этим занимается. Инструменты исследования белков, полезные в лабораторных исследованиях, могут оказаться не очень полезными или эффективными в диагностической области.В этой статье я представлю общий обзор методов анализа белков, которые используются в фундаментальных научных исследованиях, и опишу, как их можно применить в диагностической области.

Ключевые слова: Хроматография, молекулярная визуализация, иммуноферментные методы

ВВЕДЕНИЕ

В качестве простого примера давайте подумаем о том, как получить интересующий белок. Белки можно получить из самых разных образцов. Для диагностических целей они могут быть получены из клеток или тканей пациента, тогда как для экспериментального использования на стенде белки могут происходить из микроорганизмов или из клеточных линий, полученных от насекомых, позвоночных животных или растений.В любом случае эндогенные белки, которые нам не нужны, присутствуют в гораздо большем количестве, чем те, которые нам нужны. Независимо от источника выделить конкретный белок непросто по нескольким причинам, некоторые из которых представлены ниже.

Во-первых, никакое обобщенное свойство не может применяться при очистке белков. В случае нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) можно использовать методы селективной адсорбции с использованием остатков диоксида кремния с положительными зарядами, поскольку нуклеиновые кислоты имеют отрицательные заряды от своих фосфодиэфирных связей.Разработка специализированных методов очистки нуклеиновых кислот, таких как miniprep и midiprep, стала возможной благодаря тому факту, что все молекулы нуклеиновых кислот имеют высокий отрицательный заряд. Напротив, применение селективной адсорбции к белкам ограничено по нескольким причинам. Гидрофобность или специфические электростатические свойства могут быть обнаружены в разнообразном диапазоне молекул, включая липиды, нуклеиновые кислоты и сахара. Однако некоторые белки могут иметь сильные поверхностные заряды или специализированные функциональные группы, которые могут быть полезны для очистки.Например, метод очистки с помощью фосфоцеллюлозы использовался для ДНК-связывающих белков, которые имеют много положительно заряженных остатков. Тем не менее, это не гарантирует высокую чистоту или очистку без потерь. В отличие от ДНК, очистка белка требует нескольких этапов, а не простой одноэтапной процедуры. Как будет описано позже, фракционирование во время процесса выделения и использование колонки подходящего типа во время процесса очистки обеспечивают успешную очистку [ ¹ ].

Во-вторых, количество интересующего белка обычно довольно мало. Известно, что внутриклеточные концентрации белка находятся в диапазоне 300 мг / мл. Однако это значение относится к общему количеству белков в клетке. Поскольку количество активных белков в клетках исчисляется десятками тысяч, большинство белков присутствует в незначительных количествах, за исключением некоторых продуктов генов домашнего хозяйства. В некоторых случаях целевые белки могут присутствовать в пикомолярных или фемтомолярных концентрациях. Белки, такие как кератины, могут использоваться в качестве биомаркеров для диагностики рака, потому что они сверхэкспрессируются.Типичные аналитические инструменты, используемые в биофизике, менее чувствительны, чем можно было бы подумать. Для спектроскопических или калориметрических методов обычно требуются образцы белка с концентрацией от 0,01 до 1 мМ (или до десятков мг / мл). Следовательно, большинство белков, полученных непосредственно из живых организмов, невозможно проанализировать с помощью этих методов. В масс-спектрометрии можно анализировать образцы в единицах фемтограмм. Однако масс-спектрометрия не является панацеей, поскольку эффективность ионизации может быть недостаточно высокой для получения полезного сигнала в зависимости от природы пептидных фрагментов.

В-третьих, нет возможности амплифицировать белки. В случае нуклеиновых кислот возможна амплификация до такой степени, что даже следовые количества, полученные в биологическом образце, можно использовать для дальнейшего анализа. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) усиливает последовательности ДНК, и последовательности РНК также могут быть амплифицированы с помощью ПЦР с обратной транскрипцией. Напротив, если белок не продуцируется в избытке в начале эксперимента, он может постоянно теряться во время эксперимента до такой степени, что его нельзя будет обнаружить на заключительном этапе анализа.

В-четвертых, проблемы с загрязнением неизбежны. Это связано со второй и третьей проблемами, о которых говорилось выше. В частности, определенные белки составляют исключительно большую долю белков, присутствующих в клетках. Промежуточные белки филаментов и гистоны — это белки, которые появляются как примеси при анализе следов белков с помощью масс-спектрометрии. Образцы от пациентов-людей создают особенно серьезные проблемы. Эти образцы могут быть прикреплены к кровеносным сосудам или могут быть смесью поражений и здоровой ткани.Молекулы липидов, клетки крови и / или плазма крови могут уже присутствовать в избытке. Белки, которые классифицируются как шум, присутствуют в гораздо больших количествах, чем целевой белок, что часто затрудняет анализ данных.

В-пятых, белки нестабильны. Хорошо известно, что РНК быстро разлагается, но белки также разлагаются ферментами как in vivo , так и in vitro . Нелегко заблокировать всю протеолитическую активность, добавляя ингибиторы протеазы в пробирку.Если температура, pH или концентрация соли не подходят, белки могут быть денатурированы. Если экспериментальные условия буфера не оптимальны, белки могут агрегировать до или после анализа. В белках с остатками цистеина структура может быть разрушена из-за нежелательных окислительно-восстановительных реакций. Специалисты, знакомые с очисткой белков, подчеркивают, что исследователи не должны надолго оставлять белки в холодильнике, потому что белки являются нестабильными макромолекулами.

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Самый простой способ решить все вышеперечисленные проблемы для исследователей — использовать сверхэкспрессию или обогащение. Основное правило экспериментов с белками — получить как можно больше белка в начале эксперимента. Как обсуждалось выше, белки неизбежно теряются в ходе эксперимента из-за их химической и / или биологической нестабильности. Учитывая эти практические ограничения, важно получить как можно больше белка в начале процесса.

Имея это в виду, давайте начнем обсуждение выделения белков с рассмотрения методов высокоэффективного выделения белков с небольшими потерями [ ² ]. Выбор наилучшего метода выделения белка зависит от свойств исходного образца (например, от того, является ли образец жидким или твердым). Предполагая, что твердый образец содержит большое количество клеток, необходимо использовать процесс для гомогенизации тканей и лизиса клеток. В случае образцов тканей полезны методы механической гомогенизации.Способы лизиса клеток варьируются от физических методов, таких как термическая обработка и обработка ультразвуком, до химических методов, таких как обработка раствором детергента.

Детергенты, повышающие растворимость белков, могут быть использованы наиболее эффективно, если принять во внимание условия экспериментальной среды, особенно буфера. Используя подходящие детергенты, белки, которые трудно извлечь (мембранные белки или ядерные белки), также могут быть получены в желаемых количествах. Кроме того, для повышения эффективности экстракции можно использовать хаотропные реагенты, такие как мочевина и гидрохлорид гуанидина, поскольку они разрушают структуру белка и хорошо растворяются в воде.Однако обработка хаотропными реагентами обычно требует высоких концентраций соли. Следовательно, если не удалить с помощью мембранного диализа, высокая концентрация соли может вызвать проблемы на дальнейших этапах эксперимента. Сам процесс удаления соли может привести к потере белка. При разработке методики эксперимента следует учитывать как преимущества, так и недостатки использования хаотропных реагентов.

В случае жидких образцов необходимо принять решение о том, получать ли растворенный белок или извлекать его из клеток, в которых он содержится.Чтобы извлечь белок из клеток, в которых он присутствует, необходимо изолировать клетки центрифугированием. В частности, центрифугирование с использованием сред с различной плотностью может быть полезным для выделения белков, экспрессируемых в конкретных клетках. Например, чтобы получить только иммунные клетки из жидкостей организма или отделить адипоциты или кератиноциты от ткани кожи, центрифугирование жидкости, содержащей клетки, в среде с высокой плотностью может осаждать желаемые клетки в зависимости от плотности каждой составляющей клетки.Ультрацентрифугирование в градиенте плотности дополнительно применимо для удаления нежелательных клеточных примесей или получения определенных клеточных органелл.

Если растворимый белок получают из жидкостей организма, его обрабатывают аналогично клеточному лизату из твердых образцов. При анализе белковые растворы обычно разбавляются. Таким образом, необходимо выполнить процесс обогащения, такой как концентрирование или осаждение. Преимущество традиционных методов высаливания и тепловой денатурации состоит в том, что они очень просты.Кроме того, осажденный белок очень стабилен, а это означает, что этот процесс можно использовать как средство увеличения срока хранения белка. Высаливание — это метод снижения растворимости белков за счет конкурирующей растворимости в воде с использованием солей, которые более растворимы в воде, таких как сульфат аммония. Поскольку белки осаждаются при определенной концентрации соли, эта процедура также имеет то преимущество, что желаемые белки могут быть отделены от других белков и осаждены.

Вместо использования солей может быть желательно использовать изоэлектрическое осаждение путем понижения pH.Изоэлектрическое осаждение может быть выполнено, когда pH достигает изоэлектрической точки (pI) целевого белка. Каждый белок имеет различное значение pI, что означает, что изоэлектрическое осаждение также можно использовать в качестве метода фракционирования. Как правило, этот метод также очень прост, поскольку минеральную кислоту или трихлоруксусную кислоту (ТСА) титруют до тех пор, пока целевой белок не будет получен путем осаждения. Когда изменение pH или высаливание нежелательно, для ускорения осаждения можно использовать полимеры, такие как полиэтиленгликоль, или органические растворители, такие как метанол или ацетон.При необходимости может быть разработан коктейль из осаждающих реагентов (например, смесь ацетона и TCA).

Однако метод выделения следует выбирать с учетом метода анализа, поскольку этап выделения может вызвать денатурацию белка или потребовать дополнительных этапов, таких как удаление соли. Метод центробежного мембранного концентрирования является полезным одностадийным методом концентрирования белка. Однако важно иметь в виду, что этот метод может вызывать проблемы, связанные с засорением, при использовании с высококонцентрированными белками, и такие проблемы снижают эффективность процедуры концентрирования и увеличивают потери белка.

ОЧИСТКА И АНАЛИЗ

После обогащения необходима очистка. Белки для аналитических экспериментов должны быть достаточно чистыми, чтобы иметь высокое отношение сигнал / шум. Способы очистки целевых белков из грязных смесей широко варьируются, но очистка на уровне подготовки чаще всего достигается с помощью хроматографии [ ^{1 , 2} ]. Поскольку, как обсуждалось выше, белки не имеют общего метода очистки (в отличие от нуклеиновых кислот), тип используемой хроматографии полностью зависит от физических и химических свойств целевого белка.Белки обычно очищают с помощью жидкостной хроматографии (ЖХ), и можно выбрать быструю ЖХ протеинов и высокоэффективную ЖХ в зависимости от того, является ли целью подготовка или количественный анализ. Для белков можно использовать следующие методы либо в одну стадию, либо последовательно: колоночная хроматография с гидрофобным взаимодействием, эксклюзионная хроматография, ионообменная колоночная хроматография и аффинная хроматография.

Если нет необходимости готовить большое количество целевого белка, можно провести электрофорез.Электрофорез разделяет белки по размеру их молекул. Если молекулярная масса целевого белка известна, приблизительное положение полосы на геле можно вырезать и использовать для дальнейшего анализа, такого как масс-спектрометрия. Как правило, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) обеспечивает одномерные (1D) результаты при анализе белков по размеру. Вместо прямой загрузки образца белка при выполнении SDS-PAGE можно выполнить 2-мерный (2D) электрофорез, выполнив изоэлектрическое фокусирование и загрузив полученную гелевую пробирку белками, разделенными в соответствии с их значениями pI.Гели, разработанные в 2D, имеют гораздо лучшее разрешение, чем гели, разработанные в 1D, что делает этот метод излюбленным в протеомике.

Если целевой белок слишком мал для того, чтобы полоса (1D) или пятно (2D) легко окрашивалась после электрофореза, можно провести вестерн-блоттинг с использованием антител. Для проведения вестерн-блоттинга необходимо иметь антитело, специфичное к целевому белку. В последние годы вестерн-блоттинг стал возможен в большинстве случаев благодаря коммерческой доступности очень широкого спектра антител.

Также можно разделять и очищать белки с помощью антител. Иммунопреципитация — хороший метод обогащения белков. Поскольку связывание антител является специфическим, большинство конечных продуктов получают только из целевого белка антитела. В большинстве случаев можно использовать агарозу, конъюгированную с белком A, или агарозу, конъюгированную с белком G, которая связывается с большинством антител, а это означает, что для получения небольшого количества целевого белка с помощью нескольких раундов центрифугирования можно применять практически любой вид антител.

Иммуноферментный анализ (ELISA) — это чувствительный метод анализа с использованием антител. ELISA — это реакция с ферментативной амплификацией на антигены, присутствующие в следовых количествах в жидкостях организма. С помощью ELISA можно получить как наличие целевого белка, так и количественную информацию о нем без очистки. Конечно, если присутствует достаточно антител, можно определить количество и расположение белков в тканях и клетках in situ с помощью иммуногистохимии или иммунофлуоресцентного мечения.

Антитела обычно получают от крыс или кроликов. Если антитело получено от верблюдовых, может быть получен уникальный белок антитела, известный как одноцепочечное антитело или нанотело [ ^{3 , 4} ]. Типичное антитело обычно состоит из четырех полипептидных цепей на молекулу, тогда как антитело верблюда имеет две цепи на молекулу антитела. Поскольку антигенсвязывающий сайт антитела верблюда состоит из одной цепи, клонирование и процесс производства проще, чем у обычных антител.По мере развития исследований дизайна антител использование одноцепочечных антител станет более распространенным.

Вместо использования антител может быть желательно использовать аптамер для целевого белка [ ⁵ ]. Аптамеры — это молекулы нуклеиновых кислот, которые специфически связываются со своими белками-мишенями. Аптамеры могут быть получены путем скрининга макромолекул РНК или ДНК на предмет связывания с молекулами-мишенями (обычно с помощью метода, известного как SELEX [систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения]).Аптамеры, вероятно, заменят антитела, потому что они очень легко синтезировать in vitro .

В последние годы стали очень распространены методы идентификации белков-мишеней, в которых сочетаются масс-спектрометрия и ЖХ. Конечно, масс-спектрометрия ограничена только качественным анализом. Метаболическая маркировка может использоваться для количественного анализа, но только в контролируемых условиях культивирования в лабораторных условиях. Тем не менее, он становится точным и надежным методом анализа белков, поскольку информацию о последовательности можно получить даже из следовых количеств целевых белков.Недавно масс-спектрометрическая визуализация (также известная как визуализирующая масс-спектрометрия) была изучена как способ обнаружения и анализа белков непосредственно в определенных местах в клетках или тканях путем визуализации профилей масс (или карт) на 2D-образцах [ ^{6 , 7} ]. Этот метод очень похож на поиск нейротрансмиттера в определенном участке мозга с помощью магнитно-резонансной томографии. Если этот метод обобщен, можно будет обнаружить присутствие или отсутствие целевого белка in situ , просто посмотрев на ткань или клетку.Другими словами, может стать возможным быстро и точно определить присутствие или отсутствие желаемого биомаркера даже в сложной ситуации (например, когда подходящего антитела не существует или образец представляет собой смесь нормальной ткани и ткани поражения).

ВЫВОДЫ

Еще предстоит проделать большую работу по сбору и анализу белков, что потребует значительных исследований со стороны научных сотрудников. Пока белки продолжают использоваться в качестве основных биомаркеров для диагностики заболеваний, ученые будут прилагать все усилия для разработки более простых методов исследования белков.Я уверен, что общение как между лабораторными учеными, так и между лабораторными учеными и клиницистами станет основной движущей силой будущих исследований белка.

Сноски

КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ: О потенциальном конфликте интересов, относящемся к этой статье, не сообщалось.

Ссылки

1. Берджесс Р.Р., Дойчер М.П. Методы в энзимологии: руководство по очистке белков. 2-е изд. Vol. 436. Сан-Диего: Academic Press; 2009. [Google Scholar] 2. Janson JC.Очистка белков: принципы, методы высокого разрешения и приложения. Хобокен: Джон Уайли и сыновья; 2011. [Google Scholar] 3. Ван И, Фан З, Шао Л., Конг Х, Хоу Х, Тиан Д. и др. Наборы инструментов нанобиотехнологии на основе нанотел для различных биомедицинских и биотехнологических приложений. Int J Nanomedicine. 2016; 11: 3287–3303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 4. Коннинг Д., Зелонка С., Гжещик Дж., Эмптинг М., Валлдорф Б., Кра С. и др. Однодоменные антитела верблюдов и акул: структурные особенности и терапевтический потенциал.Curr Opin Struct Biol. 2016; 45: 10–16. [PubMed] [Google Scholar] 5. Озалп ВК, Каврук М, Дилек О, Байрак АТ. Аптамеры: молекулярные инструменты для медицинской диагностики. Curr Top Med Chem. 2015; 15: 1125–1137. [PubMed] [Google Scholar] 6. Швамборн К., Кригсманн М., Вайхерт В. Масс-спектрометрия с визуализацией MALDI: от стола до постели. Biochim Biophys Acta. 2016 Oct 31; DOI: 10.1016 / j.bbapap.2016.10.014. [Epub] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Петрас Д., Джармуш А.К., Доррестейн П.С. От отдельных клеток до нашей планеты — последние достижения в использовании масс-спектрометрии для метаболомики с пространственным разрешением.Curr Opin Chem Biol. 2017; 36: 24–31. [PubMed] [Google Scholar]

методов экстракции белков — BioChain Institute Inc.

Белок — это макромолекула, состоящая из цепочки аминокислотных остатков, которые выполняют жизненно важные функции в организме. От репликации ДНК до катализатора химических реакций и обеспечения структурной поддержки белки выполняют бесконечные задачи в организме, необходимые для выживания организма. Белки часто классифицируются по их структуре, которая учитывает, сколько цепочек аминокислот образуют его физическую форму и структуру.Это изображено на рисунке 1. Каждый аспект тела, начиная с отдельных клеток, заканчивая тканями и целыми органами, требует точного баланса белков для оптимального функционирования. В результате белки невероятно важны для изучения в биотехнологии.

Рисунок 1: Четыре порядка белковых структур (Академия Хана)

Изучение белков происходит по трем основным направлениям:

• In vivo : этот метод изучает белки в организме в целом, в частности, чтобы отслеживать, как они взаимодействуют с другими частями тела, а также белок-белковые взаимодействия. Исследования in vivo являются необходимым аспектом любого клинического испытания.
• In vitro : Белки очищаются и изучаются в контролируемой среде, например в лаборатории или клинике. Это помогает изолировать любые мешающие эффекты, которые могут возникнуть во время исследования. Исследования in vitro жизненно важно завершить перед использованием живых моделей из-за потенциальных рисков, особенно при тестировании на наркотики.
• In Silico : Более новый метод исследования белков с использованием компьютерного моделирования.Использование компьютерных моделей сокращает время, ресурсы и рабочую силу, необходимые для выполнения определенных проектов. Клеточный анализ, включая секвенирование генома и сворачивание белков, значительно выигрывает от моделей in silico . Образец модели in silico изображен на рисунке 2.

Рисунок 2: In Silico Методы могут использовать вычислительное моделирование (Profacgen)

Есть определенные белки, которые чаще используются в исследованиях из-за того, насколько они важны для организма.Их можно сгруппировать по определенным категориям. Белки внеклеточного матрикса обеспечивают структурную поддержку клеток, такую ​​как эластин и коллаген. Глобулярный белок относится к образцу сворачивания и включает несколько разновидностей белков с различными функциями. Ниже приведены некоторые из наиболее распространенных типов глобулярных белков.

Методы изучения белков почти всегда включают необходимость очистки белка от других клеточных компонентов с последующим его выделением. Исторически этот процесс требовал много времени и усилий.Две основные причины, по которым белки очищаются, — это либо для препаративного использования (производство больших количеств одного и того же белка для использования, такого как инсулин или лактаза), либо для аналитического использования (извлечение небольшого количества белка для использования в структурных или функциональных исследованиях).

Использование изолированных белков

Экстракция белка, как одна из наиболее широко изучаемых молекул в биологических исследованиях, находит широкое применение. От коммерческих продуктов до исследований — первый шаг, как правило, состоит в полной очистке белка.Процесс очистки белка требует многих этапов, прежде чем белок станет пригодным для использования, как показано на Рисунке 3.

Рисунок 3: Достижение высоких уровней чистоты (Руководство)

Обнаружение присутствия белков является сложной задачей из-за их небольшого размера. Методы определения общего белка включают поглощение с использованием амидного черного или коллоидного золота, определение азота и такие анализы, как протеин Брэдфорда. Конкретные методы определяют количество присутствующего отдельного белка.Главными из них являются спектрометрия и методы, зависимые от антител.

В клинической практике выделение белков можно использовать для диагностики заболеваний. Например, наличие инсулина в моче может быть индикатором диабета. Кроме того, очищенные белки часто имеют жизненно важное значение для лечения заболеваний или косметических процедур, таких как использование коллагена для ухода за кожей.

В исследованиях есть несколько последующих применений к очистке белков, которые требуют высококачественных полированных экстрактов, некоторые из которых являются методами обнаружения.

• Иммунопреципитация ( IP ): Этот процесс создает антиген из иммобилизованных белковых антител и отверждает его из раствора с использованием твердой подложки. Первоначально этот метод был разработан с использованием агарозной смолы, но в современных процедурах очистки используются магнитные шарики из-за повышенной скорости, удобства и автоматизации. IP часто является первым шагом перед методами анализа или блоттинга.
• Протеомика : Протеом организма описывает полный набор белков, которые он может создавать или использовать.Исследования протеомики на людях сосредоточены на идентификации всех белков, присутствующих в организме человека, а также их количества, функции и структуры. Это помогает быстрее находить интересующие белки.
• Ферментный анализ : наиболее часто выполняемые либо для выявления присутствия определенного фермента, либо для определения общего / определенного количества присутствующих ферментов, анализы жизненно важны для измерения ферментативной активности. Эксперименты могут быть непрерывными или прерывистыми, и часто необходимо контролировать точные вмешивающиеся факторы, такие как pH или температура, как показано на рисунке 4.

Рис. 4. Эксперименты с ферментной активностью — обычное использование белков (Science Direct)

Анализы классифицируются отдельно:

• Initial Rate Experiments: Начальная скорость специфических реакций ферментов, смешанных с субстратами.
• Эксперименты с кривой прогресса: Используемый в кинетике ферментов, он изучает ферментативные реакции после начальной реакции.
• Эксперименты с переходной кинетикой: Этот сложный эксперимент изучает поведение ферментов от начальной реакции до достижения устойчивого состояния.
• Эксперименты по релаксации: Эти эксперименты нарушают равновесие раствора фермента для анализа реакций, происходящих по мере того, как раствор возвращается в состояние равновесия.
• Вестерн-блот: Вестерн-блот, также известный как иммуноблот белков, использует гель-электрофорез для обнаружения одного конкретного белка в образце ткани или клеток. Применение Вестерн-блоттинга варьируется от обнаружения белков после клонирования до отслеживания запрещенных веществ у спортсменов и диагностики заболеваний на основе наличия антител.
• Гель-электрофорез : Это метод разделения и анализа белка в зависимости от его размера и заряда. Используя гелевую основу, такую ​​как полиакриламид, можно анализировать белки. Распространенными типами методов являются SDS-PAGE, QPNC-PAGE и 2-D гель-электрофорез.

• Поиск биомаркеров: Биомаркеры — это индикаторы определенных биологических процессов, которые имеют место, например, отслеживание болезни или измерение терапевтического вмешательства.Хотя месторождение все еще находится в стадии разработки, процесс от открытия до коммерциализации является инновационным, но дорогостоящим, как показано на Рисунке 5.

Рисунок 5: Трубопровод биомаркеров (MDPI)

Наборы для экстракции белка BioChain

Набор для экстракции белков в компартментах CNMCS : Этот тщательно протестированный набор изготовлен с использованием самых высоких стандартов чистых химикатов. Набор BioChain содержит достаточно реагентов для извлечения белков из 5 граммов тканей или 125 миллионов клеток.Набор тестируется на эффективность с использованием методов SDS-PAGE и иммуноблоттинга на различных типах маркерных белков, присутствующих в организме человека. Кроме того, все четыре фракции экстрагированных белков подвергаются дальнейшему электрофорезу и иммуноблоттингу для проверки качества. Набор извлекает четыре типа белков:

• Цитоплазма: эти белки присутствуют в цитозоле цитоплазмы клетки. Эта жидкая область отвечает за такие процессы, как гликолиз или деление клеток.
• Ядерный: это относится к белкам, присутствующим внутри ядра клетки, включая те, которые образуют хромосомы.
• Мембрана: эти белки образуют внешние слои клеток и тканей. Их функции включают транспортировку / связь между внутренней и внешней средой клетки и прикрепление к липидному бислою других белков.
• Цитоскелет: белки этого компартмента состоят из структуры клетки, например, для поддержки, транспорта и деления.

Разделение сложных белковых смесей часто является сложным и трудоемким процессом. Этот набор упрощает процесс за счет использования готовых реагентов и удобного для пользователя эффективного протокола.Этот рентабельный метод обеспечивает высококачественные последовательные экстракции, которые можно использовать во многих последующих приложениях, включая SDS-PAGE, вестерн-блоттинг, IP, анализ подвижности геля и анализы белков.

Запатентованный протокол

BioChain способствует согласованности и стандартизации и может использоваться со свежими или замороженными клетками. Рабочий процесс с образцом для набора CNMCS обычно включает несколько простых шагов, поскольку для извлечения различных типов белков требуются уникальные уровни обработки.

Комплект CNMCS: извлечение из тканей . Из-за неравномерной концентрации белков на разных участках важно выбирать ткани, которые будут иметь более высокое распределение белков для максимальной экстракции. Первым шагом при извлечении из ткани является измельчение ткани и ее гомогенизация перед лизисом. Это механическое нарушение разрушает поверхность и структуру ткани. После центрифугирования ткани первым доступным белком является цитоплазматический .Затем, используя химические буферы при ледяных температурах и дальнейшее центрифугирование, становятся доступными ядерных белков . Добавляется еще химический буфер, и третье вращение центрифуги обеспечивает мембранных белков . Наконец, с помощью дополнительного буфера оставшийся осадок можно центрифугировать в последний раз для белков цитоскелета .

CNMCS: извлечение из культуральных клеток . Этот метод отличается от экстракции из тканей, поскольку клеткам требуется только лизис внешней мембраны для извлечения белков, что сокращает некоторые этапы.Сначала культуральные клетки центрифугируют с ледяным буфером, затем пропускают через основание иглы, чтобы разрушить клеточную мембрану и высвободить ядра клеток. Следует использовать микроскоп, чтобы контролировать уровень разрушения. Затем вращайте клеточную смесь, чтобы высвободить цитоплазматических белков . Осадок клеток снова суспендируют в ледяном буфере и несколько раз центрифугируют, чтобы высвободить ядерных белков . При использовании другого буфера и центрифугирования доступно мембранных белков .Наконец, использование теплого буфера и вращение при комнатной температуре высвобождает белков цитоскелета .

Упрощение задач экстракции белков. Экстракция белков — сложный процесс, который часто требует точного управления. Часто во время процесса лизиса клеток белки могут денатурироваться из химических буферов, и это может приводить к бесполезным белкам, которые не могут повторно складываться или складываться в неправильную форму. Присутствие протеиназ также может вызывать переваривание белка; это необходимо учитывать при очистке.Перекрестное заражение также имеет тенденцию быть серьезной проблемой. Комплект BioChain CNMCS Kit тщательно разработан и проверен на качество, чтобы избежать этих проблем, а подробные инструкции по устранению неисправностей включены в руководство.

Набор для экстракции общего белка : В этот набор входит расширенный протокол, разработанный для максимальной экстракции белка. Последующие применения высококачественного белка включают SDS-PAGE, 2-мерное разделение гелей, изоэлектрическое фокусирование, вестерн-блоттинг, анализ сдвига подвижности геля, исследования взаимодействия ДНК-белок, выработку антител, анализы ферментативной активности, исследования взаимодействия белок-белок, IP, и тканеспецифический анализ экспрессии белка.

Рекомендуемый минимальный образец для экстракции может составлять всего 0,1 г ткани или 2,5 миллиона клеток, но в некоторых случаях использование меньшего количества реагента может быть эффективным с образцом еще меньшего размера. Набор Total Protein Extraction Kit поставляется с коктейлем из ингибиторов протеазы для предотвращения деградации белка. Белки, извлеченные из набора, не повреждены и могут иметь массу более 200 кДа. Замораживание, оттаивание или обработка ультразвуком не требуются.

Dr.P Kit: выделение РНК, ДНК и белка : BioChain’s Dr.P Kit — это эффективная система, которая может изолировать РНК, ДНК и белок из одного и того же участка ткани одновременно до 150 раз. Набор может использоваться для экстракции до 5 граммов ткани и обеспечивает общий белок, который можно использовать для вестерн-блоттинга.

[cta id = ”10109 ″ vid =” 0 ″]

Объяснение методов анализа белков

— ATA Scientific

Объяснение белков

Белки, также известные как полипептиды, представляют собой органические соединения, состоящие из аминокислот.Это большие сложные молекулы, которые играют в организме множество важных ролей.

Белки состоят из сотен тысяч более мелких единиц, которые расположены в линейную цепочку и свернуты в глобулярную форму. Существует 20 различных типов аминокислот, которые можно комбинировать для создания белка, и последовательность аминокислот определяет уникальную трехмерную структуру каждого белка и его конкретную функцию.

Белки выполняют большую часть работы в клетках и необходимы для структуры, функции и регулирования тканей и органов организма.Важнейшие части организмов, они участвуют практически во всех процессах внутри клеток. Многие белки представляют собой ферменты, катализирующие биохимические реакции и жизненно важные для метаболизма. Размер белка — важная физическая характеристика, и ученые часто используют анализаторы размера частиц в своих исследованиях, чтобы обсудить размер или молекулярную массу белка.

СТРУКТУРА БЕЛКОВ

Чтобы иметь возможность выполнять свою биологическую функцию, белки складываются в одну или несколько конкретных пространственных конформаций, управляемых рядом нековалентных взаимодействий, таких как водородные связи, ионные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобная упаковка.Это понимание является темой научной области структурной биологии, которая использует традиционные методы, такие как рентгеновская кристаллография, ЯМР-спектроскопия и спектрометрия кругового дихроизма для определения структуры белков.

Большинство белков складываются в уникальные трехмерные структуры. Форма, в которую белок складывается естественным образом, называется его нативной конформацией. В то время как большинство белков могут сворачиваться без посторонней помощи благодаря химическим свойствам своих аминокислот, другим требуется помощь молекулярных шаперонов.Есть четыре различных аспекта структуры белка:

• Первичная структура : аминокислотная последовательность.
• Вторичная структура : Регулярно повторяющиеся локальные структуры, стабилизированные водородными связями.
• Третичная структура : Общая форма отдельной белковой молекулы; пространственное отношение вторичных структур друг к другу.
• Четвертичная структура : Структура, образованная несколькими белковыми молекулами, которые функционируют как единый белковый комплекс.

Белковые структуры имеют размер от десятков до нескольких тысяч аминокислот. По физическому размеру белки классифицируются как наночастицы от 1 до 100 нм. Очень большие агрегаты могут быть образованы из белковых субъединиц. Например, многие тысячи молекул актина собираются в микрофиламент.

ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА БЕЛКОВ

Белки отличаются друг от друга по типу, количеству и последовательности аминокислот, составляющих основу полипептида.Следовательно, они имеют разные молекулярные структуры, питательные свойства и физико-химические свойства.

Существует три основных метода анализа белков: разделение белков, вестерн-блоттинг и идентификация белков.

1. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Электрофорез белков — это процесс разделения или очистки белков путем помещения их в гелевый матрикс и последующего наблюдения за подвижностью белка в присутствии электрического поля. Это важный подход к изучению функции белка и влияния конкретного белка на развитие или физическую функцию путем введения его в организм.

Наиболее часто используемым методом разделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Белки можно разделить по растворимости, размеру, заряду и сродству связывания. SDS-PAGE разделяет белки в основном на основе молекулярной массы, а не на основе заряда или фолдинга. Этот метод широко используется в биохимии, судебной медицине, генетике и молекулярной биологии.

Другие методы включают:

• Изоэлектрическая фокусировка : В этом методе разные молекулы разделены разницей их электрических зарядов.Этот метод представляет собой тип зонного электрофореза, который обычно проводится в геле и использует тот факт, что заряд молекулы изменяется в зависимости от pH окружающей среды.
• Хроматические методы : Для разделения белков часто используются два хроматических метода — высокоэффективная жидкостная хроматография и тонкослойная хроматография. Оба эти метода являются особенно полезными дополнениями к подходам на основе геля. Хотя хроматография — распространенный метод в биохимических лабораториях, используемый для очистки, идентификации и количественного определения белковых смесей, лазерная дифракция традиционно используется для определения размера предколонок и управления полидисперсностью.
• Двумерный гель-электрофорез : это мощный метод на основе геля, обычно используемый для анализа сложных образцов с целью характеристики всего диапазона белков в образце, а не только нескольких конкретных белков.

2. ЗАПАДНОЕ БЛОТТИНГ

Метод вестерн-блоттинга использует три элемента для идентификации конкретных белков из сложной смеси белков, извлеченных из клеток: разделение по размеру, перенос на твердую основу и маркировку целевого белка с использованием подходящих первичных и вторичных антител для визуализации.

Самая распространенная версия этого метода — иммуноблоттинг. Этот метод используется для обнаружения конкретных белков в заданном образце гомогената или экстракта ткани. Образец белков сначала подвергается электрофорезу с помощью SDS-PAGE для разделения белков на основе молекулярной массы. Затем белки переносятся на мембрану, где они исследуются с помощью антител, специфичных к целевому белку.

3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКА

Существует два метода, которые обычно используются для идентификации белков: деградация по Эдману и масс-спектрометрия.

Деградация по Эдману, разработанная Пером Эдманом, представляет собой метод секвенирования аминокислот в пептиде. Здесь аминоконцевой остаток помечен и отщеплен от пептида без разрыва пептидных связей между другими аминокислотными остатками.

Масс-спектрометрия белка

— это аналитический метод, который измеряет отношение массы к заряду заряженных частиц для определения массы частиц и элементного состава образца молекул, а также для выяснения химической структуры молекул, таких как пептиды.Масс-спектрометрия белков — важный метод точного определения массы и характеристики белков, и для его многочисленных применений были разработаны различные методы и приборы. Применение масс-спектрометрии для изучения белков стало популярным в 1980-х годах после разработки MALDI и ESI. Эти методы ионизации сыграли важную роль в идентификации белков. Идентификация может быть произведена по телефону:

• Фингерпринт массы пептидов использует массы протеолитических пептидов в качестве входных данных для поиска в базе данных предсказанных масс, которые возникают в результате переваривания списка известных белков.Основное преимущество этого метода заключается в том, что он не зависит от секвенирования белков для идентификации белков. Ограничение этого метода состоит в том, что он требует, чтобы в базе данных был белок, который уже охарактеризован для другого организма.
• De novo пептидное секвенирование выполняется без предварительного знания аминокислотной последовательности. Этот метод позволяет получить пептидные последовательности без базы данных белков и использует вычислительные подходы для определения последовательности пептида непосредственно из экспериментальных спектров МС / МС.Его можно использовать для несеквенированных организмов, антител, пептидов с посттрансляционными модификациями (PTM) и эндогенных пептидов.

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА БЕЛКОВ

Комплексный анализ белков включает обширную интерпретацию структуры и функций белков, которые присутствуют в сложных биологических образцах. Хотя современные методы анализа белковых комплексов эффективны для определения структуры белковых комплексов, существуют некоторые ограничивающие факторы.

Постоянно растущее число альтернативных способов обнаружения белок-белковых взаимодействий (ИПП) красноречиво свидетельствует о творческом подходе ученых к поиску оптимальной техники.Современные методы постоянно позволяют нам изучать белок более эффективно, действенно и с меньшими затратами и включают:

1. РАССЕЯНИЕ СВЕТА

Методы рассеяния света особенно чувствительны к более крупным молекулам в препаратах из более мелких молекул. Любое увеличение размера белка, скорее всего, будет результатом образования агрегатов. Чувствительность измерения светорассеяния к более крупным белкам означает, что самые ранние стадии денатурации, ведущие к образованию нескольких агрегатов, приведут к изменениям среднего гидродинамического размера.

Пакетное динамическое рассеяние света (DLS): Измерение размера — это первичное измерение белков, которое может выполняться с помощью пакетного режима DLS. Поскольку белки имеют очень постоянный состав и складываются в плотные структуры, гидродинамический размер предсказуемо связан с молекулярной массой. Активность и функция белка тесно связаны с правильной укладкой и структурой. Таким образом, активность также напрямую связана с размером белка, что означает, что размер также может использоваться в качестве предиктора активности.DLS — наиболее чувствительный метод обнаружения небольших количеств агрегатов в препаратах. В программном обеспечении Zetasizer есть модель, позволяющая прогнозировать молекулярную массу белка по его гидродинамическому размеру с помощью DLS. Запросить демо.

Статическое рассеяние света (SLS): Следуя измерениям DLS, измерения SLS также могут быть выполнены для белков. Часто для измерения молекулярной массы с использованием SLS следует использовать многие образцы белков высокой степени очистки, если их концентрации точно известны.Путем измерения количества света, рассеянного при различных концентрациях образца, молекулярная масса, которая пропорциональна количеству рассеянного света, может быть рассчитана путем создания графика Дебая. Наклон линии на графике Дебая составляет 2x 2-й вириальный коэффициент (мера молекулярного взаимодействия в растворе), поэтому этот метод также может быть полезен для изучения условий кристаллизации. Сильно положительное значение указывает на хорошую растворимость, а строго отрицательное значение указывает на склонность к агрегированию.Запросить демо.

Заряд и дзета-потенциал: Используя подходящие чувствительные инструменты, такие как Zetasizer Ultra, и соответствующий метод, такой как запатентованная техника диффузионного барьера, также возможно измерение дзета-потенциала белков. Значительное количество функциональных групп аминокислот может быть заряжено, и любая их комбинация может находиться в своем заряженном или незаряженном состоянии в белке. Это будет меняться в зависимости от условий в локальной среде, и важно отметить, что дзета-потенциал может отличаться от рассчитанного чистого заряда на основе вероятного состояния заряженных остатков в молекуле.

Заряд представляет особый интерес для химиков-протеинов, и дзета-потенциал должен быть в состоянии конкурировать с изоэлектрической фокусировкой, в настоящее время одним из основных методов определения заряда белка, поскольку он позволяет поддерживать белок в условиях, более близких к его естественному состоянию. . Однако следует отметить, что белки подвержены денатурированию под действием приложенного электрического поля, что может затруднить измерения дзета-потенциала. Метод диффузионного барьера — это метод, который используется для надежного измерения электрофоретической подвижности белков за счет снижения воздействия процесса измерения.Чтобы получить больше информации — свяжитесь с нами.

В целом, дзета-потенциал — это мера силы сил отталкивания между молекулами в растворе. Обычно это используется в качестве основного индикатора стабильности пробоподготовки. При высоком дзета-потенциале и, следовательно, высокой силе межмолекулярного отталкивания можно ожидать, что лекарственный или белковый препарат будет стабильным в течение более длительных периодов, чем аналогичный препарат с низким дзета-потенциалом. Запросить демо.

2. МУЛЬТИ-ОБНАРУЖЕНИЕ GPC / SEC

Хотя DLS можно использовать для характеристики олигомерного состояния белка, он не может разделить смесь олигомеров.Добавление возможностей SEC к детектору светорассеяния — это способ значительно улучшить его разрешение.

Система Malvern OMNISEC Resolve and Reveal разделяет молекулы в зависимости от их размера, что делает ее отличным партнером для светорассеяния. Разделив молекулы перед их измерением с помощью DLS или SLS, этот метод можно использовать для идентификации различных компонентов в смеси. При известных концентрациях, измеряемых показателем преломления или УФ-детектором, молекулярная масса может быть напрямую связана с количеством света, рассеянного молекулой.Это можно комбинировать с данными вискозиметра, который измеряет вязкость, позволяя определить размер и некоторые структурные аспекты. Таким образом, с помощью этого метода можно получить большой объем информации для одного образца белка.

Malvern OMNISEC также добавляет еще одно измерение к обнаружению агрегатов. Отделив их от первичного образца, можно дополнительно охарактеризовать и количественно оценить их. Производители белковых растворов обычно используют SEC в качестве заключительного этапа очистки.SEC используется для разделения образцов с целью удаления любых агрегатов, образующихся при пробоподготовке. То же самое верно и при очистке одного белка из биологических образцов. Запросите демо .

3. Спектрометрия кругового дихроизма

Круговой дихроизм (CD) — это метод абсорбционной спектроскопии, основанный на дифференциальном поглощении света с левой и правой круговой поляризацией. Оптически активные хиральные молекулы будут предпочтительно поглощать свет с круговой поляризацией в одном направлении.Разницу в поглощении света с левой и правой круговой поляризацией можно измерить и количественно оценить. УФ-КД используется для определения аспектов вторичной структуры белка. Вибрационный CD, IR CD, используется для изучения структуры небольших органических молекул, белков и ДНК. UV / Vis CD исследует переходы с переносом заряда в комплексах металл-белок.

Спектрометры

JASCO серии J1000 обеспечивают максимальное соотношение сигнал / шум в условиях высокого поглощения и низкой интенсивности света в дальней УФ-области спектра для исследования структуры и стабильности биомолекул.Он обеспечивает непревзойденные оптические характеристики и универсальную гибкость для расширенной биомолекулярной характеристики и стереохимического анализа. Монохроматор с двойной поляризационной призмой покрывает всю область, необходимую для рутинного анализа биомолекул, с отличным подавлением рассеянного света для получения точных результатов. Усовершенствованное измерение ультрафиолетового излучения в вакууме позволяет измерять спектр КД в вакуумном УФ-диапазоне, который может снижаться до 163 нм, что имеет решающее значение для биомолекул. Запросить демо

4.Изотермическая титровальная калориметрия

Изотермическая калориметрия титрования (ITC) — это физический метод, используемый для определения термодинамических параметров взаимодействий в растворе. Чаще всего он используется для изучения связывания небольших молекул (например, лекарственных соединений) с более крупными макромолекулами (белками, ДНК и т. Д.). Он состоит из двух ячеек, заключенных в адиабатическую рубашку. Исследуемые соединения помещаются в ячейку для образца, тогда как другая ячейка, эталонная ячейка, используется в качестве контроля и содержит буфер, в котором растворяется образец.

MicroCal PEAQ-ITC обеспечивает высочайшую чувствительность для безметочных измерений сродства связывания и термодинамики с низким расходом образцов для исследования биомолекулярных взаимодействий. Он обеспечивает прямое измерение всех параметров связывания в одном эксперименте и может анализировать связывающие вещества со слабым и высоким сродством, используя всего лишь 10 мкг образца. Полуавтоматическое обслуживание сводит к минимуму вмешательство оператора, а систему можно обновить до полностью автоматизированной системы MicroCal PEAQ-ITC Automated, что делает ее идеальной для лабораторий, где скорость, чувствительность и способность справляться с более высокими рабочими нагрузками в будущем имеют первостепенное значение.Запросить демо

ПРОСТОЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВ

Кристаллизация белков — необходимый шаг для выяснения их детальной трехмерной структуры. Кристаллизация — сложный процесс, который требует содержания высокоочищенного белка в идеальных условиях. В измерениях DLS полидисперсность является мерой чистоты образца. Образец белка с очень низкой полидисперсностью показывает, что он высокоочищен, что весь белок находится в одной конкретной олигомерной конформации и что его структура очень хорошо контролируется в этих условиях, все из которых необходимы для кристаллизации.Определив образец белка с самой низкой полидисперсностью, исследователь может найти наиболее подходящие условия для кристаллизации.

Размер также может быть использован в качестве предиктора активности, и четвертичная структура белка также может быть изучена. Когда белки олигомеризуются, их размер и молекулярная масса будут увеличиваться дискретными приращениями, соответствующими добавлению отдельных белков. Измеряя белок в различных условиях, можно оценить олигомерное состояние белка.Многие белки для своего функционирования полагаются на правильную четвертичную структуру, поэтому, опять же, гидродинамический размер может использоваться в качестве предиктора активности.

В неблагоприятных условиях, таких как экстремальные температуры и pH, белок становится денатурированным. Контролируя эти условия и измеряя гидродинамический радиус, можно установить точку плавления белка. Это связано со стабильностью белка и может использоваться в качестве предиктора срока годности.

Нужны подходящие инструменты для измерения? ATA Scientific предлагает комплексный набор инструментов для анализа белков различными способами, включая мультидетекционный GPC / SEC, круговой дихроизм (CD), микрокалориметрию (ITC / DSC), динамическое и статическое рассеяние света (DLS / SLS) и многое другое.Свяжитесь с нами сегодня, чтобы получить бесплатную консультацию и упростить анализ белка. Мы предоставляем инструменты и постоянную поддержку, чтобы вы были уверены в своих результатах.

Обзор методов анализа белков | Thermo Fisher Scientific

Количественное определение концентрации белка является неотъемлемой частью любого лабораторного рабочего процесса, включающего экстракцию, очистку, маркировку или анализ белка. Тесты Pierce Protein Assays предоставляют широкий спектр возможностей для точного определения концентрации белка на основе времени анализа, чувствительности, совместимости, линейности стандартной кривой и вариации от белка к белку.Хотя в этой статье в качестве примеров используются продукты Pierce Protein Assay, обсуждаемые принципы и химический состав в целом применимы к большинству доступных колориметрических или флуориметрических методов анализа белка.

Вступление

Количественное определение белка часто необходимо перед обработкой образцов белка для выделения, разделения и анализа с помощью хроматографических, электрофоретических и иммунохимических методов. В зависимости от требуемой точности, количества и чистоты доступного белка для определения концентрации белка подходят разные методы.

Самый простой и прямой метод определения концентрации белка в растворе — это измерение оптической плотности при 280 нм (УФ-диапазон). Аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи (т. Е. Тирозин, триптофан и фенилаланин), обладают сильным поглощением УФ-света. Белки и пептиды поглощают УФ-свет пропорционально содержанию в них ароматических аминокислот и общей концентрации. Другой метод, традиционно используемый в аминокислотном анализе с помощью ВЭЖХ, заключается в маркировке всех первичных аминов (т.е.е., N-конец и боковая цепь остатков лизина) цветным или флуоресцентным красителем, таким как нингидрин или о-фталевый альдегид (OPA). Подходы с прямым поглощением УФ-света и реагентами ВЭЖХ имеют особые недостатки, которые делают эти методы непрактичными для использования с типичными образцами белков в рабочих процессах протеомики. Метод УФ-поглощения не идеален для белковых смесей, поскольку разные белки имеют разное содержание ароматических аминокислот, что приводит к разным характеристикам поглощения. Кроме того, любое небелковое вещество, поглощающее УФ-свет, будет мешать измерениям.

Чтобы преодолеть эти недостатки, было разработано несколько колориметрических и флуоресцентных методик анализа белков на основе реагентов, которые используются почти в каждой лаборатории, занимающейся исследованиями белков. К реагенту добавляют образцы белка, вызывая изменение цвета или усиление флуоресценции пропорционально добавленному количеству. Концентрацию белка определяют по стандартной кривой, состоящей из известных концентраций очищенного эталонного белка. Эти методы анализа белка можно разделить на две группы в зависимости от типа химии.

Таблица 1. Типы, преимущества, недостатки и примеры методов определения белка.

Метод	Преимущества	Недостатки	Пример реагентов для анализа
Поглощение УФ-излучения	Простой, не требует никаких реагентов для анализа	с белком	смеси или сложные образцы (например, клеточные лизаты)
Биуретные методы: Хелатирование белка и меди и вторичное обнаружение восстановленной меди	Совместимость с большинством поверхностно-активных веществ (детергентов) Кривая линейного отклика (R2 > 0.95) Меньшая вариабельность белок-белок по сравнению с анализами на основе красителя Кумасси	Несовместимость с веществами, снижающими медь Несовместимость с обычными восстанавливающими агентами, такими как DTT	Анализ BCA Анализ Лоури 18
Методы на основе колориметрических красителей: Связывание белков с красителями и прямое определение изменения цвета	Быстрое и простое выполнение Выполняется при комнатной температуре Совместимо с большинством солей, растворителей, буферов, тиолов, восстанавливающих веществ, и металл-хелатирующие агенты	Несовместимость с поверхностно-активными веществами (детергентами) Высокая вариабельность белок-белок по сравнению с анализами на основе меди	Bradford (Coomassie)
Методы флуоресцентных красителей: -связывание красителя и прямое обнаружение увеличения флуоресценции как связаны со связанным красителем	Превосходная чувствительность, требуется меньше образца белка для количественного определения Время не является критическим фактором, поэтому анализы могут быть адаптированы для автоматизированной обработки в высокопроизводительных приложениях	Требуется специализированное оборудование	Флуоресцентный анализ EZQ Анализ белка Qubit

---

Выбор анализа белка

Ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка.У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Выбор среди доступных анализов белка обычно основан на совместимости метода анализа белка с образцами. Кроме того, необходимо учитывать потенциальные мешающие вещества, включенные в образцы, которые могут повлиять на определенные методы анализа, а также на точность, воспроизводимость и желаемое время инкубации. Следовательно, успешное использование анализов белка включает выбор метода, который наиболее совместим с анализируемыми образцами, выбор подходящего стандарта анализа, а также понимание и контроль конкретных допущений и ограничений, которые остаются.

Цель состоит в том, чтобы выбрать метод, который требует наименьшего количества манипуляций или предварительной обработки образцов для размещения веществ, которые мешают анализу. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Поскольку ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка для всех обстоятельств, большинство исследователей имеют в своих лабораториях более одного типа анализа белка.

Важными критериями для выбора анализа являются:

• Совместимость с типом образца и компонентами
• Диапазон анализа и требуемый объем образца
• Однородность белка к белку (см. Ниже)
• Скорость и удобство для количества образцов подлежит тестированию
• Наличие спектрофотометра или планшет-ридера, необходимого для измерения цвета (оптической плотности) при анализе

Некоторые распространенные вещества, которые потенциально мешают методам анализа белка, являются восстанавливающими агентами (например.я. DTT) и моющие средства (например, Triton X-100). Как правило, образцы, содержащие восстанавливающие агенты или хелатирующие медь агенты, предпочтительно анализируются с помощью анализов на основе красителя Кумасси (метод Брэдфорда). Это связано с тем, что анализы на основе красителя кумасси, такие как анализы Пирса Кумасси (Брэдфорд) и Пирса Кумасси Плюс (Брэдфорд), совместимы с восстановителями и не требуют реакций связывания медь-белок. Для тех образцов, которые содержат детергенты, лучше всего подходят анализы белков на основе меди, такие как анализ BCA Pierce Rapid Gold, поскольку они не ингибируются малыми или умеренными количествами детергента.

Помимо совместимости образцов, анализы белков также обычно группируются по диапазону концентраций белка, которые они могут обнаружить. Для образцов, в которых ожидается низкая концентрация белка (<20 мкг / мл), может потребоваться использование альтернативного протокола анализа на микропланшете или специализированного анализа, такого как анализ белка Pierce Micro BCA, который специально разработан для разбавленные образцы. Если общая концентрация белка в образцах высока (> 2000 мкг / мл), часто можно использовать разбавление образца для преодоления любых проблем с известными мешающими веществами.Иногда образец содержит вещества, которые делают его несовместимым с любым из методов анализа белка. Предпочтительный метод борьбы с этими типами мешающих веществ — просто удалить их.

Анализ белков BCA Pierce Rapid Gold и анализ белка Кумасси (Брэдфорд) дополняют друг друга и обеспечивают два основных метода анализа большинства образцов. Различные дополнительные реагенты и альтернативные версии этих двух анализов позволяют удовлетворить многие другие потребности в образцах.

---

Выбор стандарта белка

Поскольку белки различаются по аминокислотному составу, каждый из них по-разному реагирует на каждый тип анализа белка. Следовательно, лучший выбор для эталонного стандарта — это очищенная, известная концентрация белка, наиболее распространенного в образцах. Обычно этого невозможно достичь, и это редко бывает удобно или необходимо. Во многих случаях цель состоит в том, чтобы просто оценить общую концентрацию белка, и небольшая вариабельность между белками является допустимой.

Если высокоочищенная версия интересующего белка недоступна или слишком дорога для использования в качестве стандарта, альтернативой является выбор белка, который будет давать очень похожую кривую цветового отклика в выбранном методе анализа белка и легко доступны для любой лаборатории в любое время. Как правило, бычий сывороточный альбумин (БСА) хорошо подходит для стандарта белка, поскольку он широко доступен в высокой степени чистоты и относительно недорог. В качестве альтернативы, бычий гамма-глобулин (BGG) является хорошим стандартом при определении концентрации антител, поскольку BGG дает кривую цветового ответа, которая очень похожа на кривую иммуноглобулина G (IgG).

Для максимальной точности оценки общей концентрации белка в неизвестных образцах важно включать стандартную кривую каждый раз при проведении анализа. Это особенно верно для методов анализа белка, которые дают нелинейные стандартные кривые. Выбор количества стандартов и повторов, используемых для определения стандартной кривой, зависит от степени нелинейности стандартной кривой и требуемой степени точности. Как правило, требуется меньше точек для построения стандартной кривой, если цветовая характеристика является линейной.Обычно стандартные кривые строятся с использованием как минимум двух повторов для каждой точки кривой.

---

Подготовка проб для анализа белка

Перед анализом образца на содержание общего белка его необходимо растворить, обычно в забуференном водном растворе. Часто принимаются дополнительные меры предосторожности, чтобы подавить рост микробов или избежать случайного загрязнения образца посторонними предметами, такими как пыль, волосы, кожные или телесные масла.

В зависимости от исходного материала, который используется в процедурах перед проведением анализа белка, образец будет содержать множество небелковых компонентов.Знание этих компонентов имеет решающее значение для выбора подходящего метода анализа и оценки причины аномальных результатов. Например, ткани и клетки обычно лизируются буферами, содержащими поверхностно-активные вещества (детергенты), биоциды (антимикробные агенты) и ингибиторы протеаз. Также могут быть включены различные соли, денатурирующие агенты, восстанавливающие агенты и хаотропы. После фильтрации или центрифугирования для удаления клеточного мусора типичные образцы по-прежнему будут включать нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые соединения.

На каждый тип анализа белка неблагоприятно влияют вещества того или иного вида. Компоненты белкового раствора считаются мешающими веществами в анализе белка, если они искусственно подавляют ответ, усиливают ответ или вызывают повышенный фон на произвольно выбранную степень (например, на 10% по сравнению с контролем).

Неточность из-за небольшого количества мешающего вещества может быть устранена путем приготовления стандарта белка в том же буфере, что и анализируемый белок.Для более высоких, несовместимых уровней мешающих веществ необходимы другие стратегии:

• Выберите другой метод анализа белка или версию того же метода анализа, которая включает компоненты для преодоления помех.
• Диализируйте или обессолите образец для удаления мелких мешающих веществ (т.е. менее 1000 дальтон), таких как восстановители.
• Осаждают белок в TCA или другом подходящем реагенте, удаляют раствор, содержащий мешающий компонент, а затем повторно растворяют белок для анализа.На этой иллюстрации представлен обзор того, как методы диализа белка используются для удаления веществ, которые могут загрязнять образцы белка и мешать последующим применениям.

Рис. 1. На схеме показано, как диализную кассету можно использовать для очистки белка. 3 мл 1 мг / мл IgG в 0,1 М трис-буфере, pH 7, внутри диализной кассеты помещают в 1000 мл 100 мМ PBS, с pH 7,6. Старый диализат удаляют и заменяют 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7.6. IgG слишком велик для проникновения в поры мембраны; следовательно, количество IgG внутри кассеты остается постоянным. Концентрация Трис-буфера внутри кассеты падает ниже 0,01 М по мере диффузии Трис-буфера и диффузии буфера PBS. Опять же, старый диализат отбрасывается и заменяется 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7,6. IgG внутри кассеты остается постоянным. Уровень трис-буфера внутри кассеты падает почти до неопределяемого уровня. Буфер внутри кассеты представляет собой 100 мМ PBS с pH 7.6.

---

Различия между белками

Каждый белок в образце отвечает уникальным образом в данном анализе белка. Такое изменение от белка к белку относится к различиям в степени окраски (оптической плотности), полученной при одновременном анализе одной и той же массы различных белков одним и тем же методом. Эти различия в цветовой реакции связаны с различиями в аминокислотной последовательности, изоэлектрической точке (pI), вторичной структуре и присутствием определенных боковых цепей или простетических групп.

В зависимости от типа образца и цели проведения анализа, вариация от белка к белку является важным фактором при выборе метода анализа белка и при выборе подходящего стандарта анализа (например, BSA по сравнению с BGG). Методы анализа белков, основанные на аналогичном химическом составе, имеют схожие вариации от белка к белку.

Рисунок 2. Стандартные кривые. Примеры стандартных кривых с использованием очищенного BSA и BGG с набором для анализа белков Pierce BCA Protein Assay Kit, иллюстрирующие различия в интенсивности окраски двух разных белков.

---

Вариации белково-белковых анализов на белок

Протеиновые анализы различаются по своей химической основе для обнаружения специфичных для белков функциональных групп. Некоторые методы анализа обнаруживают пептидные связи, но ни один анализ не делает этого исключительно. Вместо этого каждый анализ белка обнаруживает одну или несколько различных конкретных аминокислот с большей чувствительностью, чем другие. Следовательно, белки с различным аминокислотным составом дают окраску с разной скоростью или интенсивностью в любом данном анализе белка.

В следующей таблице сравнивается вариабельность цветового ответа от белка к белку в нескольких анализах Thermo Scientific Pierce Protein Assays. Эти данные служат в качестве общего руководства для оценки различий в ответах между образцами белка. Однако, поскольку сравнения проводились с использованием одной концентрации белка и буфера, их не следует использовать в качестве точных калибровочных коэффициентов.

Эта информация о вариабельности полезна при выборе стандарта белка. Например, когда анализируемый образец представляет собой очищенное антитело, бычий гамма-глобулин (BGG, белок № 5) будет более точным стандартом, чем бычий сывороточный альбумин (BSA, белок № 1).Эти данные также указывают на важность определения того, какой стандарт анализа использовался при сообщении результатов анализа белка.

Для каждого из представленных здесь анализов белков было проанализировано 14 белков с использованием стандартного протокола пробирки. Было рассчитано чистое (скорректированное на холостое значение) среднее поглощение для каждого белка. Чистое поглощение для каждого белка выражается как отношение к чистому поглощению для BSA (например, отношение 0,80 означает, что белок дает 80% цвета, полученного для эквивалентной массы BSA).Все концентрации белка составляли 1000 мкг / мл, за исключением анализа Micro BCA, концентрация которого составляла 10 мкг / молоко.

Таблица 2. Обзор протеиновых анализов.

9

Результаты	BCA (Примечание 1)	Micro BCA	Модифицированный Lowry	Coomassie 936 936	Pierce 660 нм
Относительная однородность	Высокая	Высокая	Высокая	Средняя	Низкая (Примечание 2)	Низкая
Коэффициент вариации 14.7%	11,4%	11,9%	28,8%	38,2%	37%
Стандартное отклонение	0,15	0,12	0,13	0,21	0,26	19 0,27 936 900 Среднее соотношение	1,02	1,05	1,09	0,73	0,68	0,74
Протестированные белки
1. Альбумин, бычья сыворотка	1.00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
2. Альдолаза, мышца кролика	0,85	0,80	0,94	0,74	0,76	0,83 альфа-химотрипсиноген	1,14	0,99	1,17	0,52	0,48	—
4. Цитохром С, сердце лошади	0,83	1.11	0,94	1,03	1,07	1,22
5. Гамма-глобулин, крупный рогатый скот	1,11	0,95	1,14	0,58	0,56	0,51	9
1,21	1,12	1,29	0,63	0,58	—
7. IgG, человеческий	1,09	1,03	1,13	0,66	0.63	0,57
8. IgG, мышь	1,18	1,23	1,20	0,62	0,59	0,48
9. IgG, кролик	1,12	1,12	0,43	0,37	0,38
10. IgG, овцы	1,17	1,14	1,28	0,57	0,53	—
11. Инсулин, поджелудочная железа КРС.	11.08	1,22	1,12	0,67	0,60	0,81
12. Миоглобин, сердце лошади	0,74	0,92	0,90	1,15	1,19	. Яичный альбумин	0,93	1,08	1,02	0,68	0,32	0,54
14. Трансферрин человеческий	0,89	0,98	0.92	0,90	0,84	0,8
15. Альфа-лактальбумин	—	—	—	—	—	0,82
36 16. Лизоцим	—	—	—	—	0,79
17. Ингибитор трипсина, соя	—	—	—	—	—	0,38
Белковая вариация анализов Thermo Scientific Pierce Protein Assays Примечания: 1.Анализ совместимости с восстанавливающими агентами (BCA-RAC) также показал низкий коэффициент вариации. 2. Анализ протеинов Bio-Rad Bradford, протестированный с теми же белками, что и наш анализ Кумасси (Брэдфорд), дал очень высокий коэффициент вариации (46%), соответствующий очень низкой относительной однородности.

---

Расчеты и анализ данных

В большинстве анализов белка концентрации белка в образце определяют путем сравнения их результатов анализа с ответами на серию разведений стандартов, концентрации которых известны.Образцы белка и стандарты обрабатываются таким же образом, смешивая их с реагентом для анализа и используя спектрофотометр для измерения оптической плотности. Отклики стандартов используются для построения или расчета стандартной кривой. Затем значения абсорбции неизвестных образцов интерполируются на график или формулу для стандартной кривой для определения их концентраций.

Очевидно, что наиболее точные результаты возможны только тогда, когда неизвестные и стандартные образцы обрабатываются одинаково.Это включает их анализ в одно и то же время и в одних и тех же буферных условиях, если это возможно. Поскольку задействованы различные этапы дозирования, повторения необходимы, если кто-то хочет рассчитать статистику (например, стандартное отклонение, коэффициент вариации) для учета случайной ошибки.

Рис. 3. Сравнение стандартных кривых для двухточечной и линейной аппроксимации. Интерполяция и расчет для исследуемого образца, имеющего оптическую плотность 0,6, приводят к значительно разным значениям концентрации белка.В этом случае метод «точка-точка» явно обеспечивает более точную контрольную линию для расчета тестового образца.

Хотя большинство современных спектрофотометров и планшет-ридеров имеют встроенные программы для анализа данных анализа белков, некоторые факторы часто неправильно понимаются техническими специалистами. Потратив несколько минут на изучение и правильное применение принципов, задействованных в этих расчетах, можно значительно расширить возможности разработки анализов, дающих наиболее точные результаты (см. Соответствующие технические советы и ссылки).

Количественный анализ пептидов

Для рабочих процессов, использующих протеомику с использованием масс-спектрометрии, важно измерять концентрацию пептидов после этапов расщепления, обогащения и / или очистки C18, чтобы нормализовать вариации от образца к образцу. В частности, для экспериментов с использованием изобарической маркировки критически важно обеспечить маркировку равных количеств образца перед смешиванием, чтобы получить точные результаты.

Подобно методам анализа белков, доступны различные варианты определения концентрации пептидов.Исторически для измерения концентраций пептидов использовались методы анализа белков в УФ-видимой области (A280) или колориметрические, основанные на реагентах. Часто используются анализы BCA и микро-BCA. Хотя эти стратегии хорошо работают с образцами белков, эти реагенты не предназначены для точного определения пептидов. Альтернативно, количественные анализы пептидов — в колориметрическом или флуорометрическом формате — доступны для специфического количественного определения смесей пептидов. При выборе формата колориметрического или флуорометрического анализа на микропланшете для количественного анализа пептидов необходимо учитывать следующие важные критерии:

• Совместимость с типом образца, компонентами и рабочими процессами
• Диапазон анализа и требуемый объем образца
• Скорость и удобство для количество образцов для тестирования
• Наличие спектрофотометра или флуорометра, необходимого для измерения результатов анализа

Эти репрезентативные данные сравнивают результаты, полученные с помощью колориметрических и флуорометрических анализов.

Рис. 4. Количественное сравнение колориметрического и флуориметрического анализа пептидов. Триптические пептидные гидролизаты получали из двенадцати клеточных линий. Концентрации перевариваемых пептидов определяли с использованием количественного колориметрического анализа пептидов Thermo Scientific Pierce и наборов для количественного флуориметрического анализа пептидов Pierce в соответствии с инструкциями. Каждый образец анализировали в трех экземплярах, и концентрацию каждого гидролизата рассчитывали по стандартной кривой, построенной с использованием стандарта анализа протеинового переваривания.

---

Рекомендуемая литература

1. Брэдфорд, ММ. (1976) Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель. Аналитическая биохимия. 72, 248-254.
2. Смит П.К., Крон Р.И., Хермансон Г.Т. и др. (1987) Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты. Аналитическая биохимия. 150, 76-85.
3. Крон, Р.И. (2002). Колориметрическое определение и количественное определение общего белка, Current Protocols in Cell Biology, A.3H.1-A.3H.28, John Wiley & Sons, Inc.
4. Krohn, R.I. (2001). Колориметрическое определение общего белка, Текущие протоколы аналитической химии пищевых продуктов, B1.1.1-B1.1.27, John Wiley & Sons, Inc.
5. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., et al. (1951) Измерение белка с помощью реагента фолин-фенол. Журнал биологической химии. 193, 265-75.
6. Legler G, Müller-Platz CM, Mentges-Hettkamp M, et al. (1985) На химической основе определения белка Лоури.Аналитическая биохимия. 150, 278-87.

---

Статьи по Теме

Границы | Методы экстракции белков формируют большую часть экстрагированных протеомов

Белки, отсутствующие в протеомном анализе растений

В последнее время технические достижения, особенно в жидкостной хроматографии (ЖХ) и масс-спектрометрии (МС), улучшили чувствительность, охват, надежность и производительность протеомного анализа (Boersema et al., 2015). Новые методы протеомики, такие как таргетированная протеомика (Marx, 2013), деградомика (Stoehr et al., 2013), структурная протеомика (Walzthoeni et al., 2013), химическая протеомика (Rudolf et al., 2013) и микропротеомика (Kasuga et al., 2017) становятся важными инструментами для углубленного анализа биологических систем и такие явления, как рост, развитие растений и реакция на стрессовые факторы.

Количество растительных белков, обнаруженных с помощью протеомики на основе МС, остается намного ниже ожидаемого. Например, улучшенный эталонный геном кукурузы содержит 39 324 гена, кодирующего белок, в среднем 3.3 транскрипта на ген (Jiao et al., 2017), каждый из которых может продуцировать как минимум несколько разных белков. Более того, дополнительные белки могут быть синтезированы протеолизом других существующих белков. На сегодняшний день только 947 проверенных и 169 813 непроверенных записей о кукурузном белке собраны в UniProtKB (http://www.uniprot.org/uniprot/?query=organism:»maize ») (получено 6 февраля 2018 г.). Аналогичным образом, анализ записей UniProtKB для белков органелл кукурузы выявляет несколько проанализированных белков по сравнению с большим количеством непроверенных записей (дополнительная таблица 1).Важной причиной этого явления является то, что протеомные данные кукурузы не собирались и не собирались как аннотации непроверенных записей о белках. Определенно, многочисленные «отсутствующие (скрытые) белки», которые предсказываются на уровне транскриптов, остаются неидентифицированными на уровне белков у растений.

Хотя многие факторы способствуют отсутствию белков, одной из основных причин является использование неэффективных методов экстракции белков, особенно гидрофобных мембранных белков и белков с низким содержанием (LAP) (Thelen and Peck, 2007; Libault et al., 2017). Качество пробы имеет решающее значение для охвата, надежности и производительности протеомного анализа растений, хотя передовые подходы к обнаружению (особенно ЖХ-МС / МС) могут значительно повысить чувствительность и надежность идентификации белков. Здесь, с учетом текущих подходов и тенденций в протеомике растений, мы подчеркиваем важность использования нескольких методов экстракции белков для получения более полной картины протеома растений. Более того, чтобы способствовать выявлению большего количества «недостающих белков», мы обсуждаем ключевые аспекты методов экстракции белков на тканевом, одноклеточном и органеллальном уровнях.

Экстракция общих белков для сравнительного протеомного анализа

Сравнительный протеомный анализ в основном проводится с использованием общих белков, экстрагированных из тканей, органов или целых растений. Такие подходы эффективны для понимания активности растений на соответствующем уровне, но страдают от эффекта «разбавления», который маскирует уникальные биологические свойства отдельных клеток и типов клеток (Libault et al., 2017).

Основной проблемой протеомики растений является эффективное и всестороннее извлечение белков из тканей растений из-за высокого динамического диапазона растительных белков и высоких уровней мешающих веществ (например,g., фенолы, липиды, органические кислоты, углеводы, терпены и пигменты) (Wang et al., 2008). Поэтому для экстракции общего белка из тканей растений важно учитывать каждый из следующих шагов.

Во-первых, масштаб добычи должен быть определен на ранней стадии. Ткани растений можно легко гомогенизировать кварцевым песком в экстракционном буфере или измельчить с жидким N ₂ в ступке. Для протеомного анализа обычно достаточно небольшого количества растительного сырья (0,1–1,0 г сырой массы, в зависимости от типа ткани) (Wu et al., 2014а).

Во-вторых, удаление мешающих веществ необходимо для получения качественных образцов белка. С этой целью в настоящее время используются два подхода: основанный на осаждении ацетоном / TCA и на основе экстракции фенолом (Wang et al., 2008). Многие новаторские работы способствовали развитию, оценке и оптимизации этих подходов (Santoni et al., 2000; Giavalisco et al., 2003; Wang et al., 2003; Friso et al., 2004; Rose et al., 2004; Carpentier et al., 2005; Isaacson et al., 2006). Метод осаждения ацетон / TCA хорошо работает почти для тканей растений (Wang et al., 2008). После осаждения ацетоном / TCA органические растворимые вещества смываются, оставляя белки и другие нерастворимые вещества в осадке. Белки экстрагируются с использованием буфера, подходящего для разделения на основе 2DE, iTRAQ или LC. Метод экстракции фенолом работает путем избирательного извлечения белков из водных экстрактов во время разделения фаз (Wu et al., 2014a). Профили экстрагированного протеома сильно зависят от используемых буферов для экстракции (Chatterjee et al., 2012; Петриччионе и др., 2013; Wu et al., 2014b). Кроме того, при использовании этого подхода необходимо также учитывать температуру (Wu et al., 2014b), pH (Sari et al., 2015) и время экстракции (Feiz et al., 2006). Изменение любого из этих параметров повлияет на профиль извлеченного протеома (например, Sari et al., 2014, 2015; Zhang et al., 2014). Успех методов осаждения ацетоном / ТХК и экстракции фенолом зависит от полного измельчения растительной ткани (Wu et al., 2014a).

В-третьих, сложные образцы белков могут быть предварительно фракционированы для истощения белков с высоким содержанием, чтобы улучшить обнаружение «недостающих» белков с низким содержанием (LAP). Например, истощение запасов RuBisCO в листьях (Kim et al., 2013; Gupta, Kim, 2015) и запасных белков в семенах (Xiong et al., 2014) и клубнях (Wu et al., 2012; Kim et al. ., 2015; Lee et al., 2015; Gupta et al., 2016) значительно улучшили разделение и обнаружение LAP.

Наконец, каждый метод экстракции дает различные белковые комплементы.Следовательно, объединение применения различных методов экстракции улучшит покрытие протеомом. Действительно, важность использования нескольких методов экстракции белков для получения всестороннего протеомного покрытия подчеркивалась несколькими исследователями (например, Karthikaichamy et al., 2017; Takác et al., 2017).

Экстракция белка для протеомики органелл

Низкое содержание белков в определенных субклеточных участках может привести к их отсутствию в образцах белков тканей, органов или цельного растения (Libault et al., 2017). Таким образом, выделение чистых органелл позволяет анализировать LAP, которые специфически накапливаются в них.

Использование изолированных органелл для экстракции белка значительно снижает сложность экстрагированного протеома. Этот подход также обогащает фракцию LAP экстрактами белка, что позволяет улучшить их разделение и обнаружение. Обширные протеомные исследования очищенных органелл, таких как хлоропласты (Hall et al., 2011; Piro et al., 2015), ядер (Sikorskaite et al., 2013), митохондрии (Lang et al., 2011; Salvato et al., 2014) и гранулы крахмала (Xing et al., 2016) охарактеризовали ряд белков органелл и определили информацию об их локализации.

Предыдущие исследования клеточной биологии и биохимии разработали протоколы для выделения и очистки органелл, включая фильтрацию гомогената, дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в градиентах плотности (Таблица 1). Чистоту и целостность экстрагированных органелл можно проверить с помощью анализа активности ферментов, световой и электронной микроскопии, иммуноблоттинга и идентификации МС / МС.В отличие от измельчения растительной ткани для экстракции общего белка, экстракция белков органелл требует осторожного измельчения для получения чистых и / или интактных органелл перед экстракцией белка.

Таблица 1 . Примеры выделения органелл и анализа субпротеома у растений.

Некоторые органеллы относительно легко изолировать от других, особенно органеллы с запасающими функциями (например, липидные тела и гранулы крахмала) и крупные органеллы с мембранной структурой (например,g., хлоропласты и митохондрии). Постоянно разрабатываются новые методы выделения сложных органелл для субпротеомного анализа, например сочетание методов центрифугирования по плотности и разделения поверхностного заряда для выделения чистых мембран Гольджи (Parsons et al., 2012), центрифугирование в градиенте Перколла с последующим центрифугированием в градиенте сахарозы для выделения пероксисомы (Reumann and Singhal, 2014) и протокол простого (ультра-) центрифугирования в градиенте плотности для выделения интактных вакуолей (Ohnishi et al., 2018) из суспензионных культивированных клеток Arabidopsis.

После выделения органелл можно использовать стандартные методы экстракции белка. Состав буферов для экстракции белков может быть изменен в соответствии со свойствами целевых белков (например, растворимость, гидрофобность или гидрофильность, p I и степень, связанная с мембранами). Важно отметить, что для органелл с мембранной структурой мембраны необходимо разрушать измельчением, обработкой ультразвуком, ферментным расщеплением или лизисом детергента для высвобождения растворимых белков (Lang et al., 2011; Пиро и др., 2015).

Для органелл со сложной структурой раздельная экстракция белков из каждой фракции суборганелл позволяет получить более подробные профили субпротеома. Например, субпротеомный анализ, включающий выделение хлоропластов Arabidopsis в виде фракций стромы, тилакоидной мембраны и просвета (Hall et al., 2011) и раздельное выделение фракций внутренней и внешней митохондриальной мембраны (Duncan et al., 2011; Schikowsky et al. ., 2018) также предоставили информацию о специфической локализации белков внутри органелл.

Наконец, по сравнению с белками во внутриклеточных компартментах, основной технической проблемой при извлечении белков клеточной стенки (CWP) является приготовление чистого образца клеточной стенки. Это особенно сложно, потому что значительные количества внутриклеточных белков неизбежно связываются с клеточной стенкой в ​​процессе гомогенизации ткани или клеток (Rose and Lee, 2010). Оптимизированы методы выделения клеточной стенки (Feiz et al., 2006; Zhang et al., 2011; Printz et al., 2015), и в целом протеом клеточной стенки состоит из sensu stricto CWP, белков апопласта, секретируемых белки и белки ксилемного сока (Wu et al., 2018). Большинство слабосвязанных белков клеточной стенки можно растворить с использованием раствора с низкой ионной силой, в то время как прочно связанные белки клеточной стенки устойчивы к солевой экстракции (Jamet et al., 2008). Кроме того, важные достижения были достигнуты в экстракции и протеомном анализе белков апопласта, секретируемых белков и белков ксилемного сока (Soares et al., 2007; Kim et al., 2014).

Экстракция белка для протеомики на одноклеточном уровне

Другая причина того, что белки могут отсутствовать в протеомном анализе растений, заключается в том, что некоторые LAP (например,g., транскрипционные и регуляторные факторы) накапливаются в специализированных типах клеток или тканей и на определенных стадиях развития (Dubos et al., 2010). При анализе всего органа или всего растения присутствие этих белков часто маскируется присутствием белков с высоким содержанием. Следовательно, протеомика или микропротеомика на уровне отдельных клеток минимизирует клеточную сложность анализируемого образца (Libault et al., 2017). Однако методы подготовки образцов и экстракции белков для микропротеомного анализа тканей растений остаются сложной задачей.

Микропротеомные методы основаны на точном и точном отборе образцов, подготовке, удалении и экстракции белка (Feist and Hummon, 2015). Лазерная микродиссекция (LCM) является многообещающим методом отбора проб на клеточном уровне. LCM позволяет изолировать интересующие типы клеток от фиксированного образца при прямой микроскопической визуализации с помощью лазерного луча. LCM успешно использовался в протеомном анализе Arabidopsis (Schad et al., 2005), кукурузы (Dembinsky et al., 2007), ячменя (Kaspar et al., 2010) и томата (Zhu et al., 2016). Лучшим примером применения LCM в сочетании с катапультированием под давлением было изолирование ядерных выступов и клеток переноса эндосперма развивающегося зерна ячменя через 8 дней после цветения. Белковые экстракты анализировали с помощью разделения наноУПЖХ в сочетании с ESI-Q-TOF MS, которая успешно идентифицировала 137 и 44 белка в проекции нуцеллы и в клетках, переносящих эндосперм, соответственно (Kaspar et al., 2010). Кроме того, у Arabidopsis был разработан метод механического разделения эпидермальных, сосудистых и мезофилловых тканей листа (Falter et al., 2015), помидоры и маниока (Svozil et al., 2016), а отдельные образцы тканей можно использовать для количественного микропротеомного анализа с помощью LCM.

Для получения достаточного количества клеток из ограниченного количества образцов с помощью LCM требуется много времени и усилий. Следовательно, необходимо разработать методы экстракции белков на микромасштабах, совместимые с уменьшенным размером образца (100 мкг и менее), чтобы использовать их параллельно с этим подходом для создания высококачественных данных МС для «отсутствующих» LAP.

Заключительные замечания

Многие «недостающие» белки не были доказаны на уровне белка.Таким образом, мы подчеркнули важность оптимизации методов экстракции белков для улучшения обнаружения недостающих белков в протеомике растений. Конечно, одной протеомики на основе МС недостаточно для исследования и идентификации всех недостающих белков. Комплексные мультиомные подходы облегчат идентификацию многих недостающих белков (Chang et al., 2014).

Необходимо отметить, что цель этой статьи не в обзоре предыдущих исследований, а в том, чтобы подчеркнуть важность разработки новых подходов к установлению протеомов растений.Особое внимание всегда следует уделять разработке количественных, воспроизводимых и сопоставимых методологий протеомики растений. В частности, подходящие методы экстракции белков в сочетании с методами выделения органелл, конкретных клеток и тканей значительно улучшат протеомный анализ растений и позволят идентифицировать больше «недостающих белков». Хорошая экстракция белка — хороший протеом.

Авторские взносы

Все авторы участвовали в написании рукописи.LN и WW отредактировали рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы признательны за финансовую поддержку Национальному фонду естественных наук Китая (грант № 31230055) Программе инновационных исследований (в области науки и технологий) Университета провинции Хэнань (грант №15IRTSTHN015).

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018.00802/full#supplementary-material

Список литературы

Бансель, Э., Роньо, Х., Дебитон, К., Шамбон, К., и Бранлар, Г. (2010). Экстракция и протеомный анализ белков, связанных с гранулами крахмала, в зернах зрелой пшеницы ( Triticum aestivum L.). J. Proteome Res. 9, 3299–3310.DOI: 10.1021 / pr

25

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бурсема П. Дж., Кахраман А. и Пикотти П. (2015). Протеомика за пределами широкомасштабного анализа экспрессии белков. Curr. Opin. Биотех. 34, 162–170. DOI: 10.1016 / j.copbio.2015.01.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карпентье, С. К., Виттерс, Э., Лаукенс, К., Декерс, П., Свеннен, Р., и Панис, Б. (2005). Приготовление белковых экстрактов из непокорных тканей растений: оценка различных методов анализа с помощью двумерного гель-электрофореза. Proteomics 5, 2497–2507. DOI: 10.1002 / pmic.200401222

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chang, C., Li, L., Zhang, C., Wu, S., Guo, K., Zi, J., et al. (2014). Систематический анализ транскриптома, трансатома и протеома дает общее представление и потенциальную стратегию для C-HPP. J. Proteome Res. 13, 38–49. DOI: 10.1021 / pr4009018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чаттерджи, М., Гупта, С., Бхар, А., и Дас, С. (2012). Оптимизация эффективного протокола экстракции белка, совместимого с двумерным электрофорезом и масс-спектрометрией, из непокорных корней нута, богатых фенолами ( Cicer arietinum L.). Внутр. J. Proteomics 2012: 536963. DOI: 10.1155 / 2012/536963

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Daher, Z., Recorbet, G., Valot, B., Robert, F., Balliau, T., Potin, S., et al. (2010). Протеомный анализ пластид корня Medicago truncatula. Proteomics 10, 2123–2137. DOI: 10.1002 / pmic.200

5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дембинский Д., Волл К., Салим М., Лю Ю., Фу Ю., Борсук Л. А. и др. (2007). Транскриптомный и протеомный анализ клеток перицикла первичного корня кукурузы. Plant Physiol. 145, 575–588. DOI: 10.1104 / стр.107.106203

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Dubos, C., Stracke, R., Grotewold, E., Вайсхаар, Б., Мартин, К., и Лепиниц, Л. (2010). Факторы транскрипции MYB у Arabidopsis. Тренд. Plant Sci. 15, 573–581. DOI: 10.1016 / j.tplants.2010.06.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дункан, О., Тейлор, Н. Л., Кэрри, К., Юбель, Х., Кубишевски-Якубяк, С., Чжан, Б. и др. (2011). Множество доказательств локализуют механизмы передачи сигналов, морфологии и биосинтеза липидов на внешней мембране митохондрий Arabidopsis. Plant Physiol. 157, 1093–1113. DOI: 10.1104 / стр.111.183160

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фальтер К., Эллингер Д., фон Хюльсен Б., Хайм Р. и Фойгт К. А. (2015). Простая подготовка эпидермальной ткани растений для лазерной микродиссекции и последующего количественного протеомного и углеводного анализа. Фронт. Plant Sci. 6: 194. DOI: 10.3389 / fpls.2015.00194

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Файст, П., и Хаммон, А. Б. (2015). Протеомные проблемы: методы подготовки образцов для анализа содержания белка в микрограммах из биологических образцов. Внутр. J. Mol. Sci. 16, 3537–3563. DOI: 10.3390 / ijms16023537

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фейс, Л., Иршад, М., Понт-Лезика, Р. Ф., Канут, Х., и Жамет, Э. (2006). Оценка препаратов клеточных стенок для протеомики: новая процедура очистки клеточных стенок от гипокотилей Arabidopsis. Методы растений 2:10.DOI: 10.1186 / 1746-4811-2-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фризо, Г., Джакомелли, Л., Иттерберг, А. Дж., Пельтье, Дж. Б., Руделла, А., Сан, К., и др. (2004). Углубленный анализ протеома тилакоидной мембраны хлоропластов Arabidopsis thaliana: новые белки, новые функции и база данных протеомных пластид. Растительная клетка 16, 478–499. DOI: 10.1105 / tpc.017814

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джавалиско, П., Nordhoff, E., Lehrach, H., Gobom, J., and Klose, J. (2003). Извлечение белков из тканей растений для анализа методом двумерного электрофореза. Электрофор. 24, 207–216. DOI: 10.1002 / elps.2003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гупта Р., Ким С. Т. (2015). Истощение белка RuBisCO с использованием метода осаждения сульфатом протамина. Methods Mol. Биол. 1295, 225–233. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-2550-6_17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гупта, Р., Мин, К. В., Ван, Ю., Ким, Ю. К., Агравал, Г. К., Раквал, Р. и др. (2016). Ожидайте неожиданного обогащения «скрытого протеома» семян и клубней за счет истощения запасных белков. Фронт. Plant Sci. 7: 761. DOI: 10.3389 / fpls.2016.00761

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Холл М., Мишра Ю. и Шредер В. П. (2011). Подготовка фракций стромы, тилакоидной мембраны и просвета хлоропластов Arabidopsis thaliana для протеомного анализа. Methods Mol. Биол. 775, 207–222. DOI: 10.1007 / 978-1-61779-237-3_11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Isaacson, T., Damasceno, C. M., Saravanan, R. S., He, Y., Catal, á, C., Saladi, é, M., et al. (2006). Методы экстракции образцов для расширенного протеомного анализа тканей растений. Nat. Protoc. 1, 769–774. DOI: 10.1038 / nprot.2006.102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джайн Р., Катавич, В., Агравал, Г. К., Гузов, В. М., и Телен, Дж. Дж. (2008). Очистка и протеомная характеристика пластид развивающихся эмбрионов Brassica napus. Proteomics 8, 3397–3405. DOI: 10.1002 / pmic.200700810

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Жаме, Э., Албен, К., Боудар, Г., Иршад, М., Канут, Х., и Понт-Лезика, Р. (2008). Последние достижения в протеомике клеточных стенок растений. Proteomics 8, 893–908. DOI: 10.1002 / pmic.200700938

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Jiao, Y., Peluso, P., Shi, J., Liang, T., Stitzer, M.C., Wang, B., et al. (2017). Улучшенный эталонный геном кукурузы с использованием одномолекулярных технологий. Природа 546, 524–527. DOI: 10.1038 / природа22971

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Karthikaichamy, A., Deore, P., Rai, V., Bulach, D., Beardall, J., Noronha, S., et al. (2017). Пришло время использовать несколько методов экстракции в протеомике? сравнение трех методов экстракции белка у водоросли Eustigmatophyte Microchloropsis gaditana CCMP526. OMICS 21, 678–683. DOI: 10.1089 / omi.2017.0128

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каспар, С., Вейер, Д., Вешке, В., Мок, Х. П., и Матрос, А. (2010). Анализ белков микроткани, рассеченных с помощью лазерного захвата, выявил биологические функции конкретных типов клеток в развивающихся зернах ячменя. Анал. Биоанал. Chem. 398, 2883–2893. DOI: 10.1007 / s00216-010-4120-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Касуга, К., Като, Ю., Нагасе, К., и Игараси, К. (2017). Микропротеомика с микрофлюидной сортировкой клеток: применение к 1000 и 100 иммунным клеткам. Протеомика 17: 1600420. DOI: 10.1002 / pmic.201600420

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kim, J. Y., Wu, J., Kwon, S. J., Oh, H., Lee, S. E., Kim, S. G., et al. (2014). Протеомика риса и взаимодействие грибов Cochliobolus miyabeanus : понимание белков внутриклеточного и внеклеточного пространства. Протеомика 14, 2307–2318. DOI: 10.1002 / pmic.201400066

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Ю. Дж., Ли, Х. М., Ван, Ю., Ву, Дж., Ким, С. Г. и др. (2013). Истощение обильного растительного белка RuBisCO с использованием метода осаждения сульфатом протамина. Протеомика 13, 2176–2179. DOI: 10.1002 / pmic.201200555

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Ю. Дж., Ван, Ю., Гупта, Р., Ким, С.W., Min, C.W., Kim, Y.C., et al. (2015). Метод осаждения протаминовым сульфатом истощает обильные запасы белков семян растений: тематическое исследование бобовых растений. Протеомика 15, 1760–1764. DOI: 10.1002 / pmic.201400488

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kleffmann, T., Russenberger, D., von Zychlinski, A., Christopher, W., Sjölander, K., Gruissem, W., et al. (2004). Протеом хлоропласта Arabidopsis thaliana обнаруживает изобилие путей и новые функции белка. Curr. Биол . 9, 354–362. DOI: 10.1016 / j.cub.2004.02.039

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланде, Н. В., Субба, П., Баруа, П., Гайен, Д., Кешава Прасад, Т. С., Чакраборти, С., и др. (2017). Рассечение протеома хлоропластов нута ( Cicer arietinum L.) позволяет по-новому взглянуть на классические и неклассические функции. J. Proteomics 165, 11–20. DOI: 10.1016 / j.jprot.2017.06.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланг, Э.Г., Мюллер, С. Дж., Хернштейн, С. Н., Поранкевич-Асплунд, Дж., Вервлит-Шибаум, М., и Рески, Р. (2011). Одновременное выделение чистых и интактных хлоропластов и митохондрий из мха как основа субклеточной протеомики. Rep. Растительных клеток 30, 205–215. DOI: 10.1007 / s00299-010-0935-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Х. М., Гупта, Р., Ким, С. Х., Ван, Ю., Раквал, Р., Агравал, Г. К., и др. (2015). Обильное истощение запасного белка из белков клубней с использованием метода осаждения этанолом: пригодность для изучения протеомики. Proteomics 15, 1765–1769. DOI: 10.1002 / pmic.201400526

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Либо, М., Пинго, Л., Зогли, П., и Шифельбейн, Дж. (2017). Системная биология растений на одноклеточном уровне. Trends Plant Sci. 22, 949–960. DOI: 10.1016 / j.tplants.2017.08.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мальтман Д. Дж., Саймон В. Дж., Уиллер К. Х., Данн М. Дж., Уэйт Р. и Слабас А.Р. (2002). Протеомный анализ эндоплазматической сети развивающихся и прорастающих семян клещевины (Ricinus communis). Электрофорез 23, 626–639. DOI: 10.1002 / 1522-2683 (200202) 23: 4 <626 :: AID-ELPS626> 3.0.CO; 2- #

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Николовски Н., Шляха П. В., Гатто Л., Дюпри П. и Лилли К. С. (2014). Количественная оценка белка без этикеток для определения локализации и изобилия белка Гольджи в растениях. Plant Physiol. 166, 1033–1043. DOI: 10.1104 / стр.114.245589

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ohnishi, M., Yoshida, K., and Mimura, T. (2018). «Анализ протеома вакуолярной мембраны (тонопласта)», в Plant Membrane Proteomics Methods in Molecular Biology , Vol 1696, eds HP Mock, A. Matros, and K. Witzel (New York, NY: Humana Press), 107–116 .

Google Scholar

Парсонс, Х. Т., Кристиансен, К., Книрим, Б., Кэрролл, А., Ито, Дж., Батт, Т. С., и др. (2012). Выделение и протеомная характеристика Arabidopsis Golgi определяет функциональные и новые компоненты, участвующие в биосинтезе клеточной стенки растений. Plant Physiol. 159, 12–26. DOI: 10.1104 / стр.111.193151

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Петриччионе М., Ди Чекко И., Арена С., Скалони А. и Скортичини М. (2013). Протеомные изменения в побеге Actinidia chinensis во время системного инфицирования пандемией Pseudomonas syringae pv.actinidiae. J. Proteomics 78, 461–476. DOI: 10.1016 / j.jprot.2012.10.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пиро А., Серра И. А., Спадафора А., Кардилио М., Бьянко Л., Перротта Г. и др. (2015). Очистка интактных хлоропластов морских растений Posidonia oceanica подходит для протеомики органелл. Протеомика 15, 4159–4174. DOI: 10.1002 / pmic.201500246

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Принц, Б., Дос Сантос Мораис, Р., Винкооп, С., Сержант, К., Латтс, С., Хаусман, Дж. Ф. и др. (2015). Улучшенный протокол для изучения протеома клеточной стенки растений. Фронт. Plant Sci. 6: 237. DOI: 10.3389 / fpls.2015.00237

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Reumann, S., Babujee, L., Ma, C., Wienkoop, S., Siemsen, T., Antonicelli, G.E., et al. (2007). Протеомный анализ пероксисом листьев арабидопсиса выявил новые целевые пептиды, метаболические пути и защитные механизмы. Растительная клетка 19, 3170–3193. DOI: 10.1105 / tpc.107.050989

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейман, С., Сингхал, Р. (2014). Выделение пероксисом листьев Arabidopsis для анализа протеома органелл. Methods Mol. Биол. 1072, 541–552. DOI: 10.1007 / 978-1-62703-631-3_36

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Роуз, Дж. К., Башир, С., Джованнони, Дж. Дж., Ян, М. М., и Сараванан, Р.С. (2004). Решение проблемы протеома растений: практические подходы, препятствия и экспериментальные инструменты. Plant J. 39, 715–733. DOI: 10.1111 / j.1365-313X.2004.02182.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Роуз, Дж. К., и Ли, С. Дж. (2010). Отклонение от магистрали: торговля секретируемыми растительными белками и сложность протеома клеточной стенки растений. Plant Physiol. 153, 433–436. DOI: 10.1104 / стр.110.154872

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рудольф, Г.К., Хейденройтер В. и Зибер С. А. (2013). Химическая протеомика: лигирование и расщепление модификаций белков. Curr. Opin. Chem. Биол. 17, 110–117. DOI: 10.1016 / j.cbpa.2012.11.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Salvato, F., Havelund, J. F., Chen, M., Rao, R. S., Rogowska-Wrzesinska, A., Jensen, O. N., et al. (2014). Митохондриальный протеом клубней картофеля. Plant Physiol. 164, 637–653. DOI: 10.1104 / стр.113.229054

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сантони, В., Киффер, С., Дескло, Д., Массон, Ф., и Рабийо, Т. (2000). Мембранная протеомика: использование дополнительных основных эффектов с моделью мультипликативного взаимодействия для классификации белков плазматической мембраны в соответствии с их растворимостью и электрофоретическими свойствами. Электрофор 21, 3329–3344. DOI: 10.1002 / 1522-2683 (20001001) 21:16 <3329 :: AID-ELPS3329> 3.0.CO; 2-F

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сари, Ю. В., Алтинг, А. К., Флорис, Р., Сандерс, Дж.П. М., Брюинз М. Е. (2014). Производство глутаминовой кислоты из побочных продуктов пшеницы с использованием ферментативного и кислотного гидролиза. Biomass Bioenerg. 67, 451–459. DOI: 10.1016 / j.biombioe.2014.05.018

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сари Ю. В., Сяфитри У., Брюинз М. Э. и Сандерс Дж. П. М. (2015). Как состав биомассы определяет экстрагируемость белка. Ind. Crop. Prod. 70, 125–133. DOI: 10.1016 / j.indcrop.2015.03.020

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шад, М., Липтон, М. С., Джавалиско, П., Смит, Р. Д., и Кер, Дж. (2005). Оценка результатов двумерного электрофореза и жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии для тканеспецифического профилирования белков образцов растений, подвергнутых лазерному микродиссекции. Электрофорез 26, 2729–2738. DOI: 10.1002 / elps.200410399

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schikowsky, C., Thal, B., Braun, H.P., and Eubel, H. (2018). Подготовка проб для анализа протеома митохондриальной мембраны растений. Methods Mol. Биол. 1696, 163–183. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-7411-5_11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Симаока Т., Охниши М., Сазука Т., Мицухаси Н., Хара-Нисимура И., Симадзаки К. и др. (2004). Выделение интактных вакуолей и протеомный анализ тонопласта из культивированных в суспензии клеток Arabidopsis thaliana . Physiol растительных клеток. 45, 672–683. DOI: 10.1093 / pcp / pch099

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сикорскайте, С., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., and Valkonen, J. P. (2013). Протокол: оптимизированная методология выделения ядер из листьев видов семейств Solanaceae и Rosaceae. Растительные методы 9, 31–40. DOI: 10.1186 / 1746-4811-9-31

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Соарес, Н. К., Франциско, Р., Рикардо, К. П., и Джексон, П. А. (2007). Протеомика ионно связанных и растворимых внеклеточных белков в листьях Medicago truncatula. Proteomics 7, 2070–2082. DOI: 10.1002 / pmic.200600953

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стоер, Г., Шааб, К., Грауман, Дж., И Манн, М. (2013). Подход, основанный на SILAC, идентифицирует субстраты зависимого от каспазы расщепления при TRAIL-индуцированном апоптозе. Mol. Cell Proteomics 12, 1436–1450. DOI: 10.1074 / mcp.M112.024679

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Svozil, J., Gruissem, W., и Беренфаллер, К. (2016). Meselect — быстрый и эффективный метод отделения основных типов тканей листа. Фронт. Plant Sci. 7: 1701. DOI: 10.3389 / fpls.2016.01701

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вердонк, Дж. К., Хэтфилд, Р. Д., и Салливан, М. Л. (2012). Протеомный анализ клеточных стенок двух стадий развития стеблей люцерны. Фронт. Plant Sci. 13: 279. DOI: 10.3389 / fpls.2012.00279

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вальцтоени, Т., Лейтнер А., Стенгель Ф. и Эберсольд Р. (2013). Масс-спектрометрия подтвердила определение структуры белкового комплекса. Curr. Opin. Struc. Биол . 23, 252–260. DOI: 10.1016 / j.sbi.2013.02.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, S., Zhang, G., Zhang, Y., Song, Q., Chen, Z., Wang, J., et al. (2015). Сравнительные исследования митохондриальной протеомики выявляют интимную белковую сеть мужской стерильности у пшеницы ( Triticum aestivum L.). J. Exp. Бот. 66, 6191–6203. DOI: 10.1093 / jxb / erv322

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, W., Scali, M., Vignani, R., Spadafora, A., Sensi, E., Mazzuca, S., et al. (2003). Экстракция белка для двумерного электрофореза из листьев оливы, растительной ткани, содержащей высокие уровни мешающих соединений. Электрофорез 24, 2369–2375. DOI: 10.1002 / elps.200305500

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, В., Тай, Ф., и Чен, С. (2008). Оптимизация экстракции белка из тканей растений для расширенного протеомного анализа. J. Sep. Sci. 31, 2032–2039. DOI: 10.1002 / jssc.200800087

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wu, X., Gong, F., and Wang, W. (2014a). Экстракция белка из тканей растений для 2DE и его применение в протеомном анализе. Протеомика 14, 645–658. DOI: 10.1002 / pmic.201300239

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wu, X., Xiong, E., An, S., Gong, F., and Wang, W. (2012). Последовательная экстракция приводит к улучшенному протеомному профилированию клубней лекарственного растения Pinellia ternata , которые содержат большое количество белков с высоким содержанием. PLoS ONE 7: e50497. DOI: 10.1371 / Journal.Pone.0050497

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву X., Xiong, E., Wang, W., Scali, M., and Cresti, M. (2014b). Универсальный метод подготовки проб, объединяющий осаждение трихлоруксусной кислотой / ацетоном с экстракцией фенолом для протеомного анализа сельскохозяйственных культур. Nat. Protoc. 9, 362–374. DOI: 10.1038 / nprot.2014.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

У, X., Чжан, Q., Wu, Z., Tai, F., и Wang, W. (2018). Субклеточные местоположения потенциальных белков клеточной стенки в растениях: предикторы, базы данных и перекрестные ссылки. Краткое. Биоинформ. DOI: 10.1093 / bib / bbx050

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Син, С., Мэн, X., Чжоу, Л., Муджахид, Х., Чжао, К., Чжан, Ю., и другие. (2016). Протеомный профиль гранул крахмала, очищенного из эндосперма риса ( Oryza sativa ). PLoS ONE 11: e0168467. DOI: 10.1371 / journal.pone.0168467

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Xiong, E., Wu, X., Yang, L., Gong, F., Tai, F., and Wang, W. (2014). Экстракция фенола с помощью хлороформа улучшает профилирование протеома зародышей кукурузы за счет избирательного истощения запасных белков в большом количестве. PLoS ONE 9: e112724.DOI: 10.1371 / journal.pone.0112724

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан К., Сандерс Дж. П. М. и Брюинз М. Э. (2014). Критические параметры в рентабельной щелочной экстракции для высокого выхода белка из листьев. Biomass Bioenerg. 67, 466–472. DOI: 10.1016 / j.biombioe.2014.05.020

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан Ю., Гибулот А., Зиви М., Валот Б., Жаме Э. и Албенн К. (2011). Комбинирование различных стратегий для увеличения покрытия гликопротеома клеточной стенки растений. Фитохимия 72, 1109–1123. DOI: 10.1016 / j.phytochem.2010.10.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhu, Y., Li, H., Bhatti, S., Zhou, S., Yang, Y., Fish, T., et al. (2016). Разработка инструмента одноклеточной протеомики на основе микроскопа с лазерным захватом для изучения протеомов отдельных слоев клеток корней растений. Hortic. Res. 3, 16026–16034. DOI: 10.1038 / hortres.2016.26

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вычислительные методы с использованием сверхмощной обучающей машины для прогнозирования самовзаимодействия белков с информацией об эволюции белков | Journal of Cheminformatics

Dataset

В базе данных UniProt имеется 20 199 отобранных человеческих последовательностей [16].Данные PPI могут быть получены из разнообразных ресурсов, включая DIP [17], BioGRID [18], IntAct [19], InnateDB [20] и MatrixDB [21]. В этой статье мы построили данные PPI, которые содержат только те же две белковые последовательности взаимодействия и чей тип взаимодействия был определен как «прямое взаимодействие» в соответствующих базах данных. В результате мы получили 2994 белковых последовательностей самовзаимодействий человека. Для оценки эффективности прогнозирования предложенного подхода были построены наборы экспериментальных данных, которые содержат три этапа [22]: (1) белковые последовательности, длина которых меньше 50 остатков и больше 5000 остатков, были удалены из всего протеома человека; ( 2) для построения положительного набора данных мы выбрали данные SIP, которые должны удовлетворять одному из следующих условий: (а) они были обнаружены для самовзаимодействия в одном мелкомасштабном эксперименте или по крайней мере в двух типах крупных — масштабные эксперименты; (b) Самовзаимодействие. Данные о белках были определены как гомоолигомер (включая гомодимеры и гомодимеры) в UniProt; (c) об этом сообщалось по крайней мере в двух публикациях по самовзаимодействию; (3) для построения отрицательного набора данных все виды SIP содержали весь протеом человека (включая белки, помеченные как «прямое взаимодействие» и более обширные «физические взаимодействия»). ассоциация ‘) и база данных UniProt.В результате результирующий экспериментальный набор данных человека содержал 15 938 не-SIP как отрицательных и 1441 SIP как положительных [22]. Кроме того, для дальнейшей демонстрации предсказательной способности WELM-LAG мы также создали набор данных дрожжей , который содержал 5511 отрицательных и 710 положительных последовательностей белка [22], используя ту же стратегию, упомянутую выше.

Метод извлечения признаков

В работе мы использовали Матрицу оценок, специфичных для позиции (PSSM), для прогнозирования SIP. В эксперименте каждая последовательность белка была преобразована в PSSM с использованием позиционно-зависимого итеративного BLAST (PSI-BLAST) [23].{20} {m \ left ({i, k} \ right) \ times n \ left ({j, k} \ right)} \), где \ (m \ left ({i, k} \ right) \ ) представляет собой частоту появления \ (k_ {th} \) аминокислоты в положении \ (i \) зонда, а \ (n \ left ({j, k} \ right) \) — это оценка Дейхоффа. матрица мутаций между аминокислотами \ ({\ text {j}} _ {\ text {th}} \) и \ ({\ text {k}} _ {\ text {th}} \). Таким образом, для хорошо сохраняющейся позиции можно получить высокий балл, а для слабо сохраняемого положения — только низкий балл.

В исследовании, чтобы получить высокогомологичные и широко гомологичные белковые последовательности, параметр e-value PSI_BLAST был установлен на 0.001. Между тем было выбрано три итерации. Однако одна из основных проблем в методах, основанных на машинном обучении, — это извлечение полезных информативных функций. В работе, поскольку каждый PSSM имеет разную длину аминокислот. В результате каждый PSSM не может быть напрямую преобразован в вектор признаков, что приведет к разной длине векторов признаков. Для решения этого вопроса используется подход Local Average Group (LAG) для создания векторов признаков. Локальная средняя группа описывается следующим образом: группа состоит из 5% длины данной последовательности.{{\ frac {P} {20}}} Мат \ left ({k + \ left ({i — 1} \ right) \ times \ frac {P} {20}, j} \ right) \ hfill \\ & \ quad i = 1, \ ldots, 20; \; j = 1, \ ldots, 20; \; P = j + 20 \ times \ left ({{\ text {i}} — 1} \ right), \ hfill \\ \ end {align} $$

(1)

, где P представляет длину данной белковой последовательности, P /20 составляет 5% длины данной последовательности, которая представляет длину группы \ (j_ {th} \). \ (Mat \ left ({k + \ left ({i — 1} \ right) \ times \ frac {P} {20}, j} \ right) \) представляет вектор размером 1 × 20, полученный из матрицы PSSM в позиция \ (i_ {th} \) в группе \ (j_ {th} \).Таким образом, каждый PSSM был разделен на 20 групп и выражен как 400-мерный вектор признаков. Теоретическая основа LAG заключается в том, что тенденции к сохранению остатков схожи, а расположение доменов тесно связано с длиной белковой последовательности в том же семействе [24]. В нашей заявке каждая последовательность белка была преобразована в 400-мерный вектор признаков с использованием метода LAG.

В исследовании, чтобы повысить точность прогнозирования, размерность векторов признаков была уменьшена с 400 до 300 за счет использования метода PCA.Это может снизить влияние шума. Кроме того, для оценки эффективности предлагаемого метода извлечения признаков мы сравнили его с другими четырьмя методами, используя классификатор SVM на наборах данных PPI дрожжей (набор данных дрожжей содержит 11 188 пар белков): Глобальное кодирование (GE) [25], автоковариация (AC) [26], автокросс-ковариация (ACC) [26] и локальные дескрипторы белковой последовательности (LD) [27]. Как видно из таблицы 1, предложенный метод извлечения признаков дал явно лучшую точность прогнозирования по сравнению с другими существующими методами при использовании того же классификатора.

Таблица 1 Сравнение точности прогнозирования между нашим методом извлечения признаков и другими методами в наборе данных дрожжей

В документе метод извлечения признаков, основанный на объединении локальной средней группы с PCA, используемым для сбора информации о ключевых признаках, и надежный классификатор WELM используется для выполнения классификации. Схема предлагаемого метода WELM – LAG для прогнозирования SIP показана на рис. 1.

Рис. 1

Блок-схема метода WELM – LAG

Машина экстремального обучения с весами

Машина с экстремальным взвешиванием может произвольно генерировать скрытый узел, что является основной характеристикой, которая отличает от традиционных алгоритмов обучения нейронных сетей [28].Другими словами, он может случайным образом назначать параметры, содержащие скрытые узлы, независимо от обучающих выборок. Мы выразили вывод скрытого слоя как вектор-строку \ (F \ left ({\ text {X}} \ right) = \ left [{{\ text {f}} _ {1} \ left (m \ right) \ ldots f_ {L} \ left (m \ right)} \ right] \), где m — входная выборка, L — количество скрытых узлов [28]. Предположим, что существуют наборы обучающих выборок \ (\ left \ {{m_ {i}, p_ {i}} \ right \} \), модель сетей прямого распространения с одним скрытым слоем (SLFN) [29] может быть определена как показано ниже:

, где F представляет матрицу вывода скрытого слоя, \ (\ upbeta \) представляет собой выходной вес, а \ (P \) представляет целевой вектор.

$$ F = \ left [{\ begin {array} {* {20} c} {\ begin {array} {* {20} c} {f_ {1} \ left ({m_ {1}} \ справа)} \\ {\ begin {array} {* {20} c}. \\. \\. \\ \ end {array}} \\ \ end {array}} \\ {f_ {L} \ left ({m_ {n}} \ right)} \\ \ end {array}} \ right] $$

(3)

Минимальная норма вместе с решением наименьших квадратов может быть определена аналитически с помощью «обобщенного» обратного преобразования Мура – ​​Пенроуза \ (\ hat {F} \)

$$ {\ text {when}} n

(4)

$$ {\ text {when}} \; L

(5)

Как показано в двух формулах выше, положительное значение \ (\ frac {\ text {I}} {\ text {C}} \) добавляется к диагонали \ (FF ^ {P} \) или \ ( F ^ {P} F \) для лучшей производительности обобщения.{p}, \ quad i = 1 \ ldots n $$

где \ ({\ text {f}} (m _ {\ text {i}}) \) представляет вектор отображения объектов, содержащийся в скрытом слое относительно \ (m _ {\ text {i}} \), а \ (\ beta \) — вектор выходных весов, соединяющий скрытый слой и выходной слой. Для двоичного классификатора в выходном слое есть только один узел. Здесь \ (\ partial _ {\ text {i}} \) представляет ошибку обучения выборки \ (m_ {i} \). Это вызвано различием желаемого выхода \ (P_ {i} \) и фактического выхода \ (f (m_ {i}) \)
\ (\ beta \) [28].{P} \ varepsilon $$

(8)

$$ \ frac {{\ emptyset L _ {{D_ {ELM}}}}}} {{\ emptyset \ partial_ {i}}} = 0 \ to a_ {i} = CW \ partial_ {i}, \ quad i = 1 \ ldots n $$

(9)

$$ \ frac {{\ emptyset L _ {{D_ {ELM}}}}} {{\ emptyset a_ {i}}} = 0 \ to f \ left ({m_ {i}} \ right) \ beta — p_ {i} + \ partial_ {i} = CW \ partial_ {i} = 0, \ quad i = 1 \ ldots n $$

(10)

Две версии решений \ (\ upbeta \) могут быть получены из (10) относительно левого псевдообратного или правого псевдообратного.{- 1} WP $$

(13)

Оценка производительности

В исследовании мы использовали следующие меры, чтобы оценить производительность прогнозирования машины экстремального взвешенного обучения. Определение показано следующим образом:

$$ {\ text {Ac}} = \ frac {TP + TN} {TP + FP + TN + FN} $$

$$ {\ text {Sn}} = \ frac {TP} {TP + TN} $$

$$ {\ text {Sp}} = \ frac {TN} {FP + TN} $$

$$ {\ text {Pe}} = \ frac {TP} {FP + TP} $$

$$ {\ text {MCC}} = \ frac {{\ left ({TP \ times TN} \ right) — \ left ({FP \ times FN} \ right)}} {{\ sqrt {\ left ( {TP + FN} \ right) \ times \ left ({TN + FP} \ right) \ times \ left ({TP + FP} \ right) \ times \ left ({TN + FN} \ right)}}}

$

Ac, Sn, Sp, Pe и MCC представляют точность, чувствительность, специфичность, точность и коэффициент корреляции Мэтьюза соответственно.

Добавить комментарий Отменить ответ

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Комментарий *

Имя *

Email *

Сайт

Сохранить моё имя, email и адрес сайта в этом браузере для последующих моих комментариев.