Как разводить пептиды: Как принимать пептиды — основные правила

Как принимать пептиды — основные правила

• местом инъекции служит область живота в 8см от пупка
• угол наклона шприца при инъекции составляет 45 градусов
• делать инъекцию строго на голодный желудок
• не принимать пищу в течении 40 минут после инъекции
• перерыв между инъекциями должен составлять не менее 4 часов

Правила разведения пептидов в стерильной воде для инъекций:

• разводить пептид стерильной водой для инъекций по стенке ампулы
• при разведении избегать падений капли воды на пептидную массу
• не смешивать различные пептиды в одной ампуле
• не трясти разведённый в воде пептид
• не держать смесь пептидов из разных ампул в одном шприце долгое время
• беречь от прямых солнечных лучей
• хранить приготовленный раствор в холодильнике при температуре 2-8 градусов
• срок хранения приготовленного раствора до 7-10 дней

Практические советы к использованию пептидов:

• использовать инсулиновый шприц на 100 инсулиновых единиц U100 (оранжевая крышка, см на картинку)
• не путать инсулиновые единицы с делениями
• четко следовать дозировке и рекомендациям спортивного врача
• повысить количество белков в дневном рационе до 3г на 1 кг веса
• ведите дневник инъекций, что бы не забыть что и когда колоть
• делайте инъекции в одной и той же последовательности. (что бы не перепутать препараты и не вколоть 2раза одно и тоже)
• в области живота есть места где инъекция безболезненна и напротив.
• постарайтесь избежать инъекций в сосуды
• после инъекции шприц не вытаскивать 5-10 секунд, что бы исключить вытекание препарата.

Перед началом курса вам необходимо купить:

• инсулиновые шприцы U100 (1 миллилитр). В аптеке 70-100р
• ампулы с стерильной водой для инъекций. В аптеке 30-50р
• шприцы с длинной иглой для разведения пептидов. В аптеке 5-10р
• ватные диски. В аптеке 30-50р
• спирт или спиртовые салфетки. В аптеке 40-60р.

Основные правила стерильности при инъекциях:

• инъекцию проводить чистыми руками
• протереть спиртом горлышко ампулы с пептидом перед эксплуатацией
• протереть спиртом место инъекции. (можно пренебречь, так как риск заражения слишком мал, если использовать инсулиновые шприцы)
• исключить соприкасание иглы с не стерильными поверхностями
• исключить попадание воздуха в шприц
• шприц используется только 1 раз. (в целях экономии можно дневную дозу 1 препарата набирать в отдельный шприц)

Побочные явления пептидов:

Пептиды используются достаточно долго и так таковых побочных явлений не выявилось, однако следует заметить некоторые негативные реакции организма на препарат:

• сильная головная боль, 
• периодическое чувство слабости, 
• повышение давления, 
• сниженное внимание, 
• вздутие кожи и зуд в месте инъекций,
• твёрдые овальные уплотнения под кожей после инъекций (гематомы).

PEG-MGF 2 мг | пегилированный механический фактор роста ST Biotechnology

PEG-MGF (Mechano Growth Factor)

PEG-MGF — пегилированный механический фактор роста ST Biotechnology

Другие названия: ПЭГ-мГ (пегилированный механический фактор роста)

Описание: ПЭГ-мГ (пегилированный механический фактор роста) представляет собой вариант ИФР-1 (инсулиноподобный фактор роста), эффект от применения приводит к увеличению мышечных клеток, крайне необходим взрослым мышцам для продолжения роста вне их генетического предела. Как и другие формы IGF-1, PEG-MGF (также известный как  IGF-1ec | ИФР-1ec) создает новые мышечные клетки и стимулирует рост мышц, способствует удержанию азота и увеличивает синтез белка. 

PEG-MGF отличается от обычного MGF, так как он прошел процесс называемый «ПЭГилированием», благодаря которому изменяется период полураспада, в  MGF период полураспада наступает менее чем за 30 минут после применения, использования пегилированной формы увеличивает период полураспада до нескольких дней. 
PEG MGF курс будет полезен атлетам, ищущих способ стимулировать рост в некоторых (как правило, отстающий) мышц. 

Хранение: Содержание флаконов в сублимированном порошке будет оставаться стабильным при комнатной температуре в течение 1-2 месяцев. Для более длительного хранения PEG-MGF должен храниться при температуре от 2-8 градусов по Цельсию (температура холодильника) , при таком хранение в форме порошка он будет оставаться стабильным до 18 месяцев. После смешивания сухого вещества с водичкой для растворения, флаконы следует хранить в холодильнике и не оставляют при комнатной температуре. Примечание: Не следует смешивать все ваши ампул сразу. Вы должны только смешать 1 (один) флакон, а остальное хранить в виде порошка, пока вы не будете готовы использовать следующий флакон. 

PEG MGF как разводить?

Количество воды для смешивания: Вы можете смешать 1мл (1СС или 100 единиц), 2 мл (2cc или 200 единиц), или 3 мл (3CC или 300 единиц) стерильной воды, стерильный физиологический раствор (0.09nacl) или бактериостатической воды. Количество воды при смешивании не оказывает влияние на эффективность продукции. Единственное, что изменится с различающимися количеством воды это объем, который вы должны вводить, чтобы получить определенную дозу. Для удобства дозирования, мы рекомендуем смешивания 1 мл воды на флакон (если у вас есть трудности с растворением пептида). Примечание: Если продукт не растворяется в 1 мл воды в течение нескольких минут, не встряхивайте флакон, просто нужно добавить 1мл или 2 мл воды и оставить флакон в холодильнике.

Дозировка: Мужчины и Женщины = 200 мкг (0. 10ml или единицы «10» на инсулиновый шприц, если вы использовали 1мл для смешивания, или 0,20 мл единиц «20», если вы использовали 2 мл воды для смешивания и 0,3 мл или «30» единицы, если вы использовали 3 мл воды для смешивания). 

Количество дозировках на флакон: 10 х 200 мкг (0,2 мг) дозы. 

PEG-MGF (механотерапии фактор роста) 

Доза на инъекции: 200 мкг (0,2 мг) 

Инъекции в каждом флаконе: 10 х дозировки 200 мкг 

Если вы использовали 1мл воды для смешивания затем дозу 200 мкг = 0.10ml (или 10 единиц на инсулиновый шприц). Если вы использовали 2 мл воды для смешивания затем 200 мкг = 0,20 мл (или 20 единиц), и если вы использовали 3 мл воды для смешивания затем 200 мкг = 0.30ml (или 30 единиц). 

PEG MGF как принимать: PEG-MGF 200 мкг лучше всего вводить после тренировки. Можно вводить одной инъекции в одну группу мышц, или дробить, чтобы впрыснуть половину дозы в мышцы правой и левой стороны. Предпочтительно вводят внутримышечно. Но из-за длительного периода полураспада можно вводить подкожно в жир (живот, бедра или ягодицы) такой способ ввода тоже эффективен. Другие пептиды могут быть смешаны в одном шприце c PEG MGF и вводятся одновременно. 

Возможные преимущества: Увеличение мышечной массы в отстающих группах мышц, заживление травмы. 

Возможные побочные эффекты PEG MGF: Было отмечено временное раздражение (покраснение, зуд или небольшие комочки) в месте инъекции. 

Лучший сочетании с: CJC-1295 DAC. 

Краткое резюме: MGF является пептидом созданным на основе ИФР получен благодаря определенных частичных замен. MGF увеличивает количество мышечных стволовых клеток, что позволяет сливаться и становится частью клеток взрослых мышц. Это процесс крайне необходим для продолжения роста клеток мышц во взрослом возрасте. 

Почему Пегилированный MGF? 

MGF проявляет локальные эффекты в скелетных мышцах. Проблема с синтетическим MGF в  том что он вводится на водной основе, так он попадает в кровоток. MGF не может быть   стабильным в потоке крови более чем на несколько минут. Биологический MGF производится локально и не попадает в кровоток и его период короткой стабильности не является проблемой. Пэгилирования MGF помогает сделать инъекции синтетическим MGF столь же эффективными, как и от натурального MGF вырабатываемый собственым организмом. Клинически доказано, что Пегилирование, технология полиэтиленгликоль (PEG) сопряжением, имеет значительные перспективы в поддержании эффективных концентраций в плазме крови системно вводимых лекарственных средств. Делая, окружающую часть пептида с уникальной структурой изготовленной из полиэтиленгликоля, помогающая в  присоединение к молекуле белка. Группы полиэтиленгликоль защищают пептид, но не окружают его полностью. Активные участки пептида по-прежнему свободно выполнять свою биологическую функцию. В этом случае оболочка представляет собой отрицательно заряженными щит против положительно заряженных соединений, которые могут повлиять на белок.

Неврологические исследования показали, что использование пегилированного MGF привело к более стабильному воздействию MGF в сыворотке крови. 

Пегилирование может улучшить производительность и удобство дозирования пептидов, белков, антител, олигонуклеотидов и многих малых молекул путем оптимизации фармакокинетики, увеличение биодоступности и снижения иммуногенности и дозирования частоты. Пегилирование также может повысить терапевтическую эффективность, создавая повышенную концентрацию лекарственного вещества, улучшенную систему БИО-распределения и более продолжительным временем воздействия.

Полный обзор MGF или ИФР-Iec 

По своей аминокислотной последовательности, MGF является производным от гена IGF-I путем альтернативного сплайсинга, имеет ряд системных отличий приводящих к сдвигу считывания с (С) концевой последовательности. Обработка про-пептида дает готовый пептид, который участвует в повышающей регуляции синтеза белка. Существуют доказательства того, что Карбоксиконцевая пептида MGF также выступает в качестве отдельного фактора роста. Это стимулирует деление Мононуклеированные миобластов или сателлита (стволовых) клеток, тем самым увеличивая их число для локального восстановления.

На ранней стадии развития скелетных мышц, миобластов (мышечные стволовые клетки), которые Иннервируются и развиваются в мышечные волокна. После митоза пролиферации ядер в мышечных волокнах прекращается.  

Ваши мышцы не могут больше расти, как только они достигли определенного размера, если они не получают больше ядер из. MGF увеличивает количество миобластов для роста мышечной клетки.

Пептиды

Пептиды (греч. ?????? — питательный) — семейство веществ, молекулы которых построены из остатков ?-аминокислот, соединённых в цепь пептидными (амидными) связями. Это природные или синтетические соединения, содержащие десятки, сотни или тысячи мономерных звеньев — аминокислот. Данный класс очень разнообразен и выполняет в организме самые разнообразные регуляторные функции. В рамках данной статьи мы рассмотрим только те пептиды, которые используются в спорте для коррекции физических показателей.

В настоящее время на рынке все чаще и чаще встречаются пептиды, которые представляют собой стимуляторы гормона роста. Наиболее популярные пептиды в бодибилдинге:

Из группы Грелина (GHRP): (создают выраженный пик концентрации ГР сразу после введения, вне зависимости от времени суток и наличия соматостатина в крови. )

GHRP-6 и Гексарелин

GHRP-2

Ипаморелин

Сравнение гормона роста и пептидов (кривые концентрации в крови)

Из группы Гормон роста рилизинг гормона (GHRH): (введение в организм вызывает волнообразный подъем концентрации, который будет слабым в часы когда естественная секреция ГР снижена за счет соматостатина, и высоким во время естественного подъема концентрации ГР (например, ночью). Иными словами GHRH усиливает секрецию ГР, не нарушая естественную пульсообразную кривую.)

GRF(1-29) Серморелин

CJC-1295

HGH Frag (176-191) — фрагмент гормона роста (жиросжигатель)

Преимущества пептидовправить

У многих возникают вопросы, зачем использовать новые пептидные вещества, если существует искусственный гормон роста? Ответ прост: пептидные стимуляторы имеют несколько веских преимуществ:

Отзывы ученыхправить

Содержание

Исследования показали, что пептиды-стимуляторы секреции гормонов роста (GHRP), а также другие непептидные вещества, повышающие секрецию, действительно влияют на выработку гормона роста. [1][2]

Эти наблюдения послужили основой для создания пищевых добавок – стимуляторов гормона роста (например, аминокислоты, питуитарные пептиды, Macuna pruriens, конские бобы, холин альфосцерат и т.д.). На текущий момент существуют данные, подтверждающие, что пептиды-стимуляторы секреции гормонов роста и некоторые вещества непептидной природы могут повышать уровень гормонов роста, а также инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) как в состоянии покоя, так и во время физических упражнений. Тем не менее, не было замечено влияния данных веществ на прирост сухой мышечной массы.[3]

Как разводить пептиды и правильно хранитьправить

Разведение и схема введения

Рекомендации Юрия Бомбелы, актуальные для всех пептидов.

Растворитель

Раствор пептидов, полученный с помощью бактериостатической воды (вода для инъекций с добавлением бензилового спирта), остается стабильным в среднем на 2-5 суток дольше, чем раствор, полученный с помощью обычной воды для инъекций. Если эти дни окажутся для вас критичными, можете попытаться сотворить бактериостатическую воду самостоятельно. Практически все лаборатории используют в качестве растворителя бактериостатическую воду.

Хранение

Лиофилизированный порошок рекомендуется хранить в темном сухом месте при температуре около 4°С – если речь идет о коротком (1-2 месяца) промежутке времени. При температуре минус 18-20°С порошок можно хранить вплоть до нескольких лет.

Герметичность и свет

Свет может разрушать порошок, также как и кислород, хотя влиянию последнего пептиды подвержены не в одинаковой степени. В любом случае, не следует нарушать герметичность упаковки – попавший внутрь воздух будет медленно приводить к разрушению пептида.

Заморозка

Юрий Бомбела считает, что «полученный раствор можно замораживать один раз (не больше), но только в том случае, если его рН превышает 8. То есть, лишь тот, который приготовлен с помощью физраствора.» Ошибка автора заключается в том, что физиологический раствор, также как и вода для инъекций имеет рН=7.

Хранение раствора

Хранить раствор лучше всего при температуре около 2-4°С, допустим подъем до 8°С.

Приготовление раствораправить

Перед приготовлением раствора температуру флакона следует довести до комнатной.

Следует избегать прямого попадания растворителя в порошок – растворитель должен стекать по стенке флакона.

Не рекомендуется встряхивать флакон для ускорения растворения. Можно покачивать его медленными плавными движениями из стороны в сторону, но лучше всего поставить флакон в холодильник – через некоторое время весь порошок растворится.

Введение выполняется по стандартной технике подкожных или внутримышечных инъекций.

Пептиды значительно дешевле гормона роста. Стоимость аналогичного курса будет в несколько раз ниже.

Различные механизмы действия и периоды полувыведения позволяют манипулировать концентрационной кривой, добиваясь оптимального анаболического отклика.

Различное воздействие на чувство голода и метаболизм, позволяет отдавать предпочтение тем или иным веществам.

На данный момент производство и распространение пептидов не регулируется законом, поэтому их без опаски можно заказывать в сети.

Быстро и бесследно разрушаются, поэтому можно не бояться за допинг контроль.

Пептиды, так же как и классический ГР легко проверить на подлинность. Для этого достаточно сдать анализы на уровень соматотропина в плазме после введения препарата.

Оземпик инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Ozempic р-р д/п/к введения 1.34 мг/1 мл: картридж в шприц-ручке 1.5 мл (0.25 мг/доза или 0.5 мг/доза) и 3 мл (1 мг/доза) (56252)

Препарат Оземпик^® применяют 1 раз в неделю в любое время, независимо от приема пищи. Препарат Оземпик^® вводят п/к в живот, бедро или плечо. Место инъекции можно изменять без коррекции дозы. Препарат Оземпик^® нельзя вводить в/в и в/м. Дальнейшая информация по способу применения содержится в разделе «Руководство по использованию».

При необходимости день еженедельного введения можно менять при условии, что интервал времени между двумя инъекциями составляет не менее 3 дней (>72 ч).

Дозы

Начальная доза препарата Оземпик^® составляет 0.25 мг 1 раз в неделю. После 4 недель применения дозу следует увеличить до 0.5 мг 1 раз в неделю. Для дальнейшего улучшения гликемического контроля после как минимум 4 недель применения препарата в дозе 0.5 мг 1 раз в неделю, дозу можно увеличить до 1 мг 1 раз в неделю.

Доза препарата Оземпик^® 0.25 мг не является терапевтической.

Препарат Оземпик^® может применяться в виде монотерапии или в комбинации с одним или более гипогликемическими препаратами (см. раздел «Клиническая эффективность и безопасность»).

При добавлении препарата Оземпик^® к предшествующей терапии метформином и/или тиазолидиндионом терапию метформином и/или тиазолидиндионом можно продолжить в прежних дозах.

При добавлении препарата Оземпик^® к проводимой терапии производным сульфонилмочевины или инсулином следует предусмотреть снижение дозы производного сульфонилмочевины или инсулина с целью снижения риска возникновения гипогликемий (см. раздел «Особые указания»).

Применение препарата Оземпик^® не требует проведения самоконтроля концентрации глюкозы крови. Самостоятельный мониторинг концентрации глюкозы в крови необходим для коррекции дозы сульфонилмочевины и инсулина, особенно в начале лечения препаратом Оземпик^® и при снижении дозы инсулина. Рекомендуется использовать поэтапный подход к снижению дозы инсулина.

Пропущенная доза

В случае пропуска дозы препарат Оземпик^® следует ввести как можно быстрее в течение 5 дней с момента запланированного введения дозы. Если продолжительность пропуска составляет более 5 дней, пропущенную дозу не нужно вводить. Следующую дозу препарата Оземпик^® следует ввести в обычный запланированный день. В каждом случае пациенты могут возобновить их обычный однократный еженедельный график введения.

Особые группы пациентов

Не требуется коррекции дозы у пациентов пожилого возраста (≥65 лет). Опыт применения семаглутида у пациентов в возрасте 75 лет и старше ограничен.

Не требуется коррекции дозы у пациентов с печеночной недостаточностью (см. раздел «Фармакокинетика»). Опыт применения семаглутида у пациентов с печеночной недостаточностью тяжелой степени ограничен; применение препарата Оземпик^® у таких пациентов противопоказано.

Не требуется коррекции дозы у пациентов с почечной недостаточностью. Опыт применения препарата у пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности отсутствует; применение препарата Оземпик^® у таких пациентов противопоказано.

Применение препарата Оземпик^® у детей и подростков в возрасте до 18 лет противопоказано в связи с отсутствием данных по безопасности и эффективности.

Руководство по использованию

Предварительно заполненная шприц-ручка Оземпик^® поставляется в двух видах:

• Оземпик^® 0. 25 мг/доза или 0.5 мг/доза раствор для п/к введения в предварительно заполненной шприц-ручке позволяет вводить дозы 0.25 мг или 0.5 мг. Данная шприц-ручка предназначена для повышения дозы и поддержания терапевтической дозы 0.5 мг. Одна шприц-ручка содержит 1.5 мл раствора.
• Оземпик^® 1 мг/доза раствор для п/к введения в предварительно заполненной шприц-ручке позволяет вводить дозы только 1 мг. Данная шприц-ручка предназначена только для поддержания терапевтической дозы 1 мг. Одна шприц-ручка содержит 3 мл раствора.

В упаковку препарата Оземпик^® включены иглы НовоФайн^® Плюс.

Пациенту следует рекомендовать выбрасывать инъекционную иглу после каждой инъекции в соответствии с местными требованиями.

Шприц-ручка Оземпик^® предназначена только для индивидуального использования.

Препарат Оземпик^® нельзя применять, если он выглядит иначе, чем прозрачный бесцветный или почти бесцветный раствор.

Препарат Оземпик^® нельзя применять, если он был заморожен.

Препарат Оземпик^® можно вводить при помощи игл длиной до 8 мм. Шприц-ручка предназначена для использования с одноразовыми инъекционными иглами НовоФайн^®.

Всегда после каждой инъекции следует удалять иглу и хранить шприц-ручку Оземпик^® с отсоединенной иглой. Это поможет предотвратить закупорку игл, загрязнение, заражение, вытекание раствора и введение неправильной дозы препарата.

Инструкция для пациентов по применению препарата Оземпик^® 0.25 мг/доза или 0.5 мг/доза раствор для п/к введения в предварительно заполненной шприц-ручке

Внимательно прочитайте данную инструкцию перед применением предварительно заполненной шприц-ручки Оземпик^®.

Используйте шприц-ручку только после того, как Вы научитесь ею пользоваться под руководством врача или медсестры.

Начните с проверки шприц-ручки, чтобы убедиться, что в ней содержится препарат Оземпик^® 0. 25 мг/доза или 0.5 мг/доза, затем посмотрите на представленные ниже иллюстрации, чтобы ознакомиться с различными частями шприц-ручки и иглы.

Если Вы слабовидящий или у Вас имеются серьезные проблемы со зрением, и Вы не можете различить цифры на счетчике дозы, не используйте шприц-ручку без посторонней помощи. Помочь вам может человек с хорошим зрением, обученный использованию предварительно заполненной шприц-ручки с препаратом Оземпик^®.

Данная шприц-ручка является предварительно заполненной шприц-ручкой. Она содержит 2 мг семаглутида и позволяет выбрать дозы 0.25 мг или 0.5 мг. Шприц-ручка разработана для использования с одноразовыми иглами НовоФайн^® длиной до 8 мм.

Иглы НовоФайн^® Плюс включены в упаковку.

Δ Важная информация

Обратите особое внимание на информацию, отмеченную такими значками, это очень важно для безопасного использования шприц-ручки.

Предварительно заполненная шприц-ручка с препаратом Оземпик^® и игла (пример)

1. Подготовка шприц-ручки с новой иглой к использованию

• Проверьте название и цветовой код на этикетке шприц-ручки, чтобы убедиться, что в ней содержится препарат Оземпик^® 0.25 мг/доза или 0.5 мг/доза. Это особенно важно, если Вы применяете более одного инъекционного препарата.
• Снимите колпачок со шприц-ручки (рис. А).

• Убедитесь, что раствор в шприц-ручке прозрачный и бесцветный (рис. В). Посмотрите в окошко шприц-ручки. Если раствор мутный и не бесцветный, не используйте шприц ручку.

• Возьмите новую иглу и удалите защитную наклейку (рис. С). Если защитная наклейка повреждена, не используйте иглу, т.к. в этом случае стерильность не гарантируется.

• Наденьте иглу на шприц-ручку и поверните ее, чтобы игла плотно держалась на шприц-ручке (рис. D).

• Снимите наружный колпачок иглы, но не выбрасывайте его (рис. Е). Он понадобится после завершения инъекции, чтобы безопасно снять иглу со шприц-ручки.

• Снимите и выбросьте внутренний колпачок иглы (рис. F). Если Вы попытаетесь надеть внутренний колпачок обратно на иглу, Вы можете случайно уколоться иглой.

На конце иглы может появиться капля раствора. Это нормальное явление, однако Вы все равно должны проверить поступление препарата, если Вы используете новую шприц-ручку в первый раз.

Не присоединяйте новую иглу до тех пор, пока Вы не будете готовы сделать инъекцию.

Δ Всегда для каждой инъекции используйте новую иглу. Это может предотвратить закупорку игл, загрязнение, инфицирование и введение неправильной дозы препарата.

Δ Никогда не используйте иглу, если она погнута или повреждена.

2. Проверка поступления препарата

• Перед первой инъекцией с помощью каждой новой шприц-ручки проверьте поступление препарата. Если шприц-ручка уже находится в использовании, то перейдите к операции 3 «Установка дозы».
• Поворачивайте селектор дозы, пока счетчик дозы не поравняется с символом проверки поступления препарата (••—) (рис. А).

• Держите шприц-ручку иглой вверх. Нажмите пусковую кнопку и удерживайте ее в этом положении, пока счетчик дозы не возвратится к «0» (рис. В). «0» должен стоять напротив указателя дозы. На конце иглы должна появиться капля раствора.

На конце иглы может оставаться маленькая капля, но она не будет введена при инъекции. Если капля раствора на конце иглы не появилась, повторите операцию «2» «Проверка поступления препарата», но не более 6 раз. Если капля раствора так и не появилась, поменяйте иглу и повторите операцию «2» «Проверка поступления препарата» еще раз. Если капля раствора так и не появилась, утилизируйте шприц-ручку и используйте новую.

Δ Всегда перед использованием новой шприц-ручки в первый раз убедитесь в том, что на конце иглы появилась капля раствора. Это гарантирует поступление препарата.

Если капля раствора не появилась, препарат не будет введен, даже если счетчик дозы будет двигаться. Это может указывать на то, что игла закупорена или повреждена.

Если Вы не проверите поступление препарата перед первой инъекцией с помощью каждой новой шприц-ручки, Вы можете не ввести необходимую дозу и ожидаемый эффект препарата Оземпик^® не будет достигнут.

3. Установка дозы

• Поворачивайте селектор дозы до тех пор, пока он не покажет необходимую дозу (0.25 мг или 0.5 мг) (рис. А). Если доза была выбрана неправильно, Вы можете поворачивать селектор дозы вперед или назад, пока не будет установлена правильная доза. Максимальная доза, которую можно установить, составляет 0.5 мг.

Селектор дозы изменяет дозу. Только счетчик дозы и указатель дозы покажут количество мг препарата в выбранной Вами дозе.

Вы можете выбрать до 0.5 мг препарата на дозу. Если в шприц-ручке содержится менее 0.5 мг, счетчик дозы остановится прежде, чем появится «0.5».

При каждом повороте селектора дозы раздаются щелчки, звук щелчков зависит от того, в какую сторону вращается селектор дозы: вперед, назад или, если набранная доза превышает количество мг препарата, оставшихся в шприц-ручке. Не считайте щелчки шприц-ручки.

Δ Всегда перед каждой инъекцией проверяйте, какое количество мг препарата Вы набрали по счетчику дозы и указателю дозы.

Не считайте щелчки шприц-ручки.

С помощью селектора дозы нужно выбирать только дозы 0.25 мг или 0.5 мг. Выбранная доза должна находиться точно напротив указателя дозы — такое положение гарантирует, что Вы получите правильную дозу препарата.

Сколько препарата осталось

Чтобы определить, сколько препарата осталось, используйте счетчик дозы (рис. А): поворачивайте селектор дозы до остановки счетчика дозы.

Если он показывает «0.5», в шприц-ручке осталось не менее 0.5 мг препарата. Если счетчик дозы остановился до того, как появилось «0.5», то это означает, что в шприц-ручке осталось недостаточное количество препарата, чтобы ввести полную дозу 0.5 мг.

Δ Если в шприц-ручке осталось недостаточное количество препарата для введения полной дозы, не используйте шприц-ручку. Используйте новую шприц-ручку Оземпик^®.

4. Введение препарата

• Введите иглу под кожу, используя технику инъекций, рекомендованную врачом или медсестрой (рис. А).
• Убедитесь, что счетчик дозы находится в поле Вашего зрения. Не дотрагивайтесь до счетчика дозы пальцами — это может прервать инъекцию.

• Нажмите пусковую кнопку до упора и удерживайте ее в этом положении, пока счетчик дозы не покажет «0» (рис. В). «0» должен находиться точно напротив указателя дозы. При этом Вы можете услышать или ощутить щелчок.

• Удерживайте иглу под кожей, после того, как счетчик дозы вернулся к «0» и медленно считайте до 6 (рис. С).
• Если Вы извлечете иглу из-под кожи раньше, Вы можете увидеть, как препарат вытекает из иглы. В этом случае будет введена неполная доза препарата.

• Извлеките иглу из-под кожи (рис. D). Если в месте инъекции появилась кровь, слегка прижмите к месту укола ватный тампон. Не массируйте место укола.

После завершения инъекции Вы можете увидеть каплю раствора на конце иглы. Это нормально и не влияет на дозу препарата, которую Вы ввели.

Δ Всегда сверяйтесь с показаниями счетчика дозы, чтобы знать, какое количество мг препарата Вы ввели. Удерживайте пусковую кнопку до тех пор, пока счетчик дозы не покажет «0».

Как выявить закупорку или повреждение иглы

• Если после долгого нажатия на пусковую кнопку на счетчике дозы не появляется «0», это может означать закупорку или повреждение иглы.
• В этом случае Вы не получили препарат, даже если счетчик дозы изменил положение с исходной дозы, которую Вы установили.

Что делать с закупоренной иглой

Замените иглу как описано в операции 5 «После завершения инъекции» и повторите все шаги, начиная с операции 1 «Подготовка шприц-ручки с новой иглой к использованию». Убедитесь, что установили полную необходимую Вам дозу.

Никогда не дотрагивайтесь до счетчика дозы во время введения препарата. Это может прервать инъекцию.

5. После завершения инъекции

• Положив наружный колпачок иглы на плоскую поверхность, введите конец иглы внутрь колпачка, не касаясь его или иглы (рис. А).

• Когда игла войдет в колпачок, осторожно наденьте наружный колпачок на иглу (рис. В).
• Отвинтите иглу и выбросьте ее, соблюдая меры предосторожности.

• После каждого использования надевайте на шприц-ручку колпачок, чтобы защитить содержащийся в ней раствор от воздействия света (рис. С).

Всегда после каждой инъекции выбрасывайте иглу, чтобы обеспечить комфортную инъекцию и избежать закупорки игл. Если игла закупорена, Вы не введете себе препарат. Выбрасывайте пустую шприц-ручку с отсоединенной иглой в соответствии с рекомендациями данными врачом, медсестрой, фармацевтом или в соответствии с местными требованиями.

Δ Никогда не пытайтесь надеть внутренний колпачок обратно на иглу. Вы можете уколоться.

Δ После каждой инъекции всегда сразу удаляйте иглу со шприц-ручки. Это может предотвратить закупорку игл, загрязнение, инфицирование, вытекание раствора и введение неправильной дозы препарата.

Δ Дополнительная важная информация:

• Всегда храните шприц-ручку и иглы к ней в недоступном для всех, и в особенности для детей, месте.
• Никогда не передавайте свою шприц-ручку и иглы к ней другим лицам.
• Лица, осуществляющие уход за больным, должны обращаться с использованными иглами с особой осторожностью, чтобы предотвратить уколы иглой и перекрестное инфицирование.

Уход за шприц-ручкой

Аккуратно обращайтесь со шприц-ручкой. Небрежное обращение или неправильное использование могут привести к введению неправильной дозы препарата, следствием чего могут стать высокая концентрация глюкозы крови или дискомфорт в области живота (тошнота или рвота).

• Не оставляйте шприц-ручку в автомобиле или любом другом месте, где она может подвергаться воздействию слишком высоких или слишком низких температур.
• Не применяйте препарат Оземпик^®, если он был заморожен. В этом случае концентрация глюкозы крови может стать слишком высокой или Вы можете почувствовать дискомфорт в области живота, такой, как тошнота или рвота.
• Не применяйте препарат Оземпик^®, если он подвергся воздействию прямых солнечных лучей. В этом случае концентрация глюкозы крови может стать слишком высокой.
• Предохраняйте шприц-ручку от попадания на нее пыли, загрязнений и жидкости.
• Не мойте шприц-ручку, не погружайте ее в жидкость и не смазывайте ее. При необходимости шприц-ручку можно очищать влажной тканью, смоченной мягким моющим средством.
• Нельзя ронять или ударять шприц-ручку о твердую поверхность. Если Вы уронили шприц-ручку или сомневаетесь в ее исправности, присоедините новую иглу и проверьте поступление препарата перед тем, как сделать инъекцию.
• Не пытайтесь повторно заполнить шприц-ручку. Пустую шприц-ручку необходимо выбросить.
• Не пытайтесь самостоятельно починить шприц-ручку или разобрать ее на части.

Инструкция для пациентов по применению препарата Оземпик^® 1 мг/доза раствор для п/к введения в предварительно заполненной шприц-ручке

Внимательно прочитайте данную инструкцию перед применением предварительно заполненной шприц-ручки Оземпик^®.

Используйте шприц-ручку только после того, как Вы научитесь ею пользоваться под руководством врача или медсестры.

Начните с проверки шприц-ручки, чтобы убедиться, что в ней содержится препарат Оземпик^® 1 мг/доза, затем посмотрите на представленные ниже иллюстрации, чтобы ознакомиться с различными частями шприц-ручки и иглы.

Если Вы слабовидящий или у Вас имеются серьезные проблемы со зрением, и Вы не можете различить цифры на счетчике дозы, не используйте шприц-ручку без посторонней помощи. Помочь вам может человек с хорошим зрением, обученный использованию предварительно заполненной шприц-ручки с препаратом Оземпик^®.

Данная шприц-ручка является предварительно заполненной шприц-ручкой. Она содержит 4 мг семаглутида и позволяет выбрать только дозу 1 мг. Шприц-ручка разработана для использования с одноразовыми иглами НовоФайн^® длиной до 8 мм.

Иглы НовоФайн^® Плюс включены в упаковку.

Δ Важная информация

Обратите особое внимание на информацию, отмеченную такими значками, это очень важно для безопасного использования шприц-ручки.

Предварительно заполненная шприц-ручка с препаратом Оземпик^® и игла (пример)

1. Подготовка шприц-ручки с новой иглой к использованию

• Проверьте название и цветовой код на этикетке шприц-ручки, чтобы убедиться, что в ней содержится препарат Оземпик^® 1 мг/доза. Это особенно важно, если Вы применяете более одного инъекционного препарата.
• Снимите колпачок со шприц-ручки (рис. А).

• Убедитесь, что раствор в шприц-ручке прозрачный и бесцветный (рис. В). Посмотрите в окошко шприц-ручки. Если раствор мутный и не бесцветный, не используйте шприц-ручку.

• Возьмите новую иглу и удалите защитную наклейку (рис. С). Если защитная наклейка повреждена, не используйте иглу, т.к. в этом случае стерильность не гарантируется.

• Наденьте иглу на шприц-ручку и поверните ее, чтобы игла плотно держалась на шприц-ручке (рис. D).

• Снимите наружный колпачок иглы, но не выбрасывайте его (рис. Е). Он понадобится после завершения инъекции, чтобы безопасно снять иглу со шприц-ручки.

• Снимите и выбросьте внутренний колпачок иглы (рис. F). Если Вы попытаетесь надеть внутренний колпачок обратно на иглу, Вы можете случайно уколоться иглой.

На конце иглы может появиться капля раствора. Это нормальное явление, однако, Вы все равно должны проверить поступление препарата, если Вы используете новую шприц-ручку в первый раз.

Не присоединяйте новую иглу до тех пор, пока Вы не будете готовы сделать инъекцию.

Δ Всегда для каждой инъекции используйте новую иглу. Это может предотвратить закупорку игл, загрязнение, инфицирование и введение неправильной дозы препарата.

Δ Никогда не используйте иглу, если она погнута или повреждена.

2. Проверка поступления препарата

• Перед первой инъекцией с помощью каждой новой шприц-ручки проверьте поступление препарата. Если шприц-ручка уже находится в использовании, то перейдите к операции 3 «Установка дозы».
• Поворачивайте селектор дозы, пока счетчик дозы не поравняется с символом проверки поступления препарата (••—) (рис. А).

• Держите шприц-ручку иглой вверх. Нажмите пусковую кнопку и удерживайте ее в этом положении, пока счетчик дозы не возвратится к «0» (рис. В). «0» должен стоять напротив указателя дозы. На конце иглы должна появиться капля раствора.

На конце иглы может оставаться маленькая капля, но она не будет введена при инъекции.

Если капля раствора на конце иглы не появилась, повторите операцию «2» «Проверка поступления препарата», но не более 6 раз. Если капля раствора так и не появилась, поменяйте иглу и повторите операцию «2» «Проверка поступления препарата» еще раз. Если капля раствора так и не появилась, утилизируйте шприц-ручку и используйте новую.

Δ Всегда перед использованием новой шприц-ручки в первый раз убедитесь в том, что на конце иглы появилась капля раствора. Это гарантирует поступление препарата.

Если капля раствора не появилась, препарат не будет введен, даже если счетчик дозы будет двигаться. Это может указывать на то, что игла закупорена или повреждена.

Если Вы не проверите поступление препарата перед первой инъекцией с помощью каждой новой шприц-ручки, Вы можете не ввести необходимую дозу и ожидаемый эффект препарата Оземпик^® не будет достигнут.

3. Установка дозы

• Поверните селектор дозы, чтобы выбрать дозу 1 мг (рис. А). Продолжайте поворачивать до тех пор, пока счетчик дозы не остановится и не покажет «1».

Только счетчик дозы и указатель дозы покажут, что был выбран 1 мг.

Вы можете выбрать только 1 мг препарата на дозу. Если в шприц-ручке содержится менее 1 мг, счетчик дозы остановится прежде, чем появится «1».

При каждом повороте селектора дозы раздаются щелчки, звук щелчков зависит от того, в какую сторону вращается селектор дозы: вперед, назад или, если Вы пытаетесь набрать дозу больше 1 мг. Не считайте щелчки шприц-ручки.

Δ Всегда перед каждой инъекцией по счетчику дозы и указателю дозы проверяйте, что был набран 1 мг.

Не считайте щелчки шприц-ручки.

С помощью селектора дозы нужно выбирать только дозу 1 мг. Доза 1 мг должна находиться точно напротив указателя дозы — такое положение гарантирует, что Вы получите правильную дозу препарата.

Сколько препарата осталось

Чтобы определить, сколько препарата осталось, используйте счетчик дозы (рис. А): поворачивайте селектор дозы до остановки счетчика дозы.

Если он показывает «1», в шприц-ручке осталось не менее 1 мг препарата. Если счетчик дозы остановился до того, как появилась цифра «1», то это означает, что в шприц-ручке осталось недостаточное количество препарата, чтобы ввести полную дозу 1 мг.

Δ Если в шприц-ручке осталось недостаточное количество препарата для введения полной дозы, не используйте шприц-ручку. Используйте новую шприц-ручку Оземпик^®.

4. Введение препарата

• Введите иглу под кожу, используя технику инъекций, рекомендованную врачом или медсестрой (рис. А).
• Убедитесь, что счетчик дозы находится в поле Вашего зрения. Не дотрагивайтесь до счетчика дозы пальцами — это может прервать инъекцию.

• Нажмите пусковую кнопку до упора и удерживайте ее в этом положении, пока счетчик дозы не покажет «0» (рис. В). «0» должен находиться точно напротив указателя дозы. При этом Вы можете услышать или ощутить щелчок.

• Удерживайте иглу под кожей, после того, как счетчик дозы вернулся к «0» и медленно считайте до 6 (рис. С). Если Вы извлечете иглу из-под кожи раньше, Вы можете увидеть, как препарат вытекает из иглы. В этом случае будет введена неполная доза препарата.

• Извлеките иглу из-под кожи (рис. D). Если в месте инъекции появилась кровь, слегка прижмите к месту укола ватный тампон. Не массируйте место укола.

После завершения инъекции Вы можете увидеть каплю раствора на конце иглы. Это нормально и не влияет на дозу препарата, которую Вы ввели.

Δ Всегда сверяйтесь с показаниями счетчика дозы, чтобы знать, какое количество мг препарата Вы ввели. Удерживайте пусковую кнопку до тех пор, пока счетчик дозы не покажет «0».

Как выявить закупорку или повреждение иглы

• Если после долгого нажатия на пусковую кнопку на счетчике дозы не появляется «0», это может означать закупорку или повреждение иглы.
• В этом случае Вы не получили препарат, даже если счетчик дозы изменил положение с исходной дозы, которую Вы установили.

Что делать с закупоренной иглой

Замените иглу как описано в операции 5 «После завершения инъекции» и повторите все шаги, начиная с операции 1 «Подготовка шприц-ручки с новой иглой к использованию». Убедитесь, что установили полную необходимую Вам дозу.

Никогда не дотрагивайтесь до счетчика дозы во время введения препарата. Это может прервать инъекцию.

5. После завершения инъекции

• Положив наружный колпачок иглы на плоскую поверхность, введите конец иглы внутрь колпачка, не касаясь его или иглы (рис. А).

• Когда игла войдет в колпачок, осторожно наденьте наружный колпачок на иглу (рис. В).
• Отвинтите иглу и выбросьте ее, соблюдая меры предосторожности.

• После каждого использования надевайте на шприц-ручку колпачок, чтобы защитить содержащийся в ней раствор от воздействия света (рис. С).

Всегда после каждой инъекции выбрасывайте иглу, чтобы обеспечить комфортную инъекцию и избежать закупорки игл. Если игла закупорена, Вы не введете себе препарат. Выбрасывайте пустую шприц-ручку с отсоединенной иглой в соответствии с рекомендациями данными врачом, медсестрой, фармацевтом или в соответствии с местными требованиями.

Δ Никогда не пытайтесь надеть внутренний колпачок обратно на иглу. Вы можете уколоться.

Δ После каждой инъекции всегда сразу удаляйте иглу со шприц-ручки. Это может предотвратить закупорку игл, загрязнение, инфицирование, вытекание раствора и введение неправильной дозы препарата.

Δ Дополнительная важная информация:

• Всегда храните шприц-ручку и иглы к ней в недоступном для всех, и в особенности для детей, месте.
• Никогда не передавайте свою шприц-ручку и иглы к ней другим лицам.
• Лица, осуществляющие уход за больным, должны обращаться с использованными иглами с особой осторожностью, чтобы предотвратить уколы иглой и перекрестное инфицирование.

Уход за шприц-ручкой

Аккуратно обращайтесь со шприц-ручкой. Небрежное обращение или неправильное использование могут привести к введению неправильной дозы препарата, следствием чего могут стать высокая концентрация глюкозы крови или дискомфорт в области живота (тошнота или рвота).

• Не оставляйте шприц-ручку в автомобиле или любом другом месте, где она может подвергаться воздействию слишком высоких или слишком низких температур.
• Не применяйте препарат Оземпик^®, если он был заморожен. В этом случае концентрация глюкозы крови может стать слишком высокой или Вы можете почувствовать дискомфорт в области живота такой, как тошнота или рвота.
• Не применяйте препарат Оземпик^®, если он подвергся воздействию прямых солнечных лучей. В этом случае концентрация глюкозы крови может стать слишком высокой.
• Предохраняйте шприц-ручку от попадания на нее пыли, загрязнений и жидкости.
• Не мойте шприц-ручку, не погружайте ее в жидкость и не смазывайте ее. При необходимости шприц-ручку можно очищать влажной тканью, смоченной мягким моющим средством.
• Нельзя ронять или ударять шприц-ручку о твердую поверхность. Если Вы уронили шприц-ручку или сомневаетесь в ее исправности, присоедините новую иглу и проверьте поступление препарата перед тем, как сделать инъекцию.
• Не пытайтесь повторно заполнить шприц-ручку. Пустую шприц-ручку необходимо выбросить.
• Не пытайтесь самостоятельно починить шприц-ручку или разобрать ее на части.

Информация о сайте peptide.com.ua

Описание	Пептиды купить. Купить пептиды в Украине. Цена пептиды Киев Украина. Пептиды для загара, сушки, похудения, суставов, сна. Пептиды для сжигания жира. Гормон роста купить. Пептиды гормон роста курс. Пептиды Санкт-Петербург. Кардиоген, Тестаген, Везилют, Панкраген, Нормофтал, Бронхоген, Везуген, Карталакс, Пинеалон, Оваген, Кристаген, Офталамин, Эпифамин, Тесталамин, Вазаламин, Церебрамин, Тирамин, Супренамин, Панкрамин, Гепатамин, Тимусамин, Хондрамин, Селанк, Пиналекс, Pinalex, Epitalon Эпиталон. Пептиды купить Киев Украина. Пептиды, пептидные биорегулятьры разработанные Санкт-петербугским Институтом геронтологии и биорегуляции, производства Санкт-Петербург, Россия. Купить пептиды производства Санкт-Петербург, Россия по самым низким ценам в Киеве, Украине. Медицинские фармокологические препараты на основе пептидов и пептидных комплексов, коротких пептидов, нано пептидов, для лечения, восстановления функций, регенерации, реставрации органов и систем человека, болезней сердца, легких, мочеполовой системы, органов зрения, поджелудочной железы. Лечение инфаркта миокарда, ишимической болезни, стенокардии, гипертонии, повышенного давления, бронхита, пневмонии, бронхиальной астмы, кашля, эмфиземы легких, панкреатита, холицистита, нарушения желчеобразования,выделения желчи, сахарного диабета, болезней глаз, снижения зрения, глаукомы, близорукости, дальнозоркости, ослабления остроты зрения, возрастного ухудшения зрения, отслоения сетчатки, заболеваний мочеполовой системы, воспалении мочевого пузыря, простатита, аденомы предстательной железы, нарушении мочеиспускания, недержания мочи, снижения эрекции, ухудшение потенции, импотенции, климакса, ухудшения репродуктивной функции, понижения сперматогенеза, снижение спермообразования, понижения выработки тестостерона. С помощью лекарств на основе пептидов нормализуются обменные процессы в организме, восстанавливаются функции органов и тканей, происходят процессы регенерации и реставрации органов. Купить пептиды Хавинсона в Киеве, Украине, цена на пептиды недорого. Низкая стоимость и высокое качество. Оригинальные пептиды Санкт-петербугского Института геронтологии, созданы под руководством академика Хавинсона В.Х. Пептиды гормон роста купить в Укаине недорого. Пептиды Кардиоген, Тестаген, Везилют, Панкраген, Нормофтал, Бронхоген, Везуген, Карталакс, Пинеалон, Оваген, Кристаген, Купить Эпиталон Epitalon, GHRP 2 (5мг), GHRP 6 (5мг), CJC-1295 (2мг), CJC-1295 with DAC (2мг), MGF (2мг), Peg MGF (2мг), Melanotan 2 (10мг), TB500 (2мг), HGH Frag (176-191) (5мг), PT-141 (Bremelanotide) (10мг), Ipamorelin (5мг), Gonadorelin (2мг), IGF1 LR3 (1мг), IGF1 DES (1мг), MOD GRF 1-29 (2мг), AOD9604 (5мг), ACTH (1-39) (10мг), AICAR (50мг), BPC 157 (5мг), Follistatin 315 (1мг), Follistatin 344 (1мг). Как принимать пептиды, как и чем разводить пептиды, расчет дозы пептидов , какой курс пептидов. Пептиды для набора мышечной массы. Пептиды для роста мышц. Пептиды для похудения. Пептиды — сжигать жир. Пептиды для загара. Пептиды для потенции от импотенции. Недорого купить инъекционные пептиды.	Ключевые слова	купить,пептиды,цена,пептид,киев,пептиды,курс,гормон,роста,Киев,Укаина,недорого,для,загара,сушки,суставов,сжигания,жира.гормон,роста,Epitalon,Эпиталон,AGAG,GHRP2,HRP6,CJC1295,CJC1295withDAC,MGF,Peg,MGF,Melanotan2,TB500,HGH,Frag,176191,PT141,bremelanotide,ipamorelin,Gonadorelin,IGF1,LR3,IGF1,DES,MOD,GRF129,AOD9604,ACTH,139,AICAR,BPC,157,Follistatin315,Follistatin344,Selank,Селанк,как,принимать,пептиды,как,чем,разводить,пептиды,расчет,дозы,пептидов,курс,пептидов,сжигание,жира,набор,массы,мышечная,масса,рост,мышц,накачать,мышцы,похудеть,диета,диетическое,питание,похудение,Санкт,петербург,россия,институт,геронтологии,купить,оптом,украина,недорого,дешево,бесплатная,доставка,заказать,онлайн,лечение,болезни,здоровье,заболевания,органов,терапия,патология,импотенция,потенция,виагра,повышение,эрекции,простатит,инфаркт,гипертония,сердца,миокарда,ишимия,стенокардия,бронхит,сахарный,диабет,панкреатит,зрение,глаз,БАДы,лекарство,препараты,пептиды,средство,фармпрепарат,аптека,медицина,заказать,Кардиоген,Тестаген,Везилют,Панкраген,Нормофтал,Бронхоген,Везуген,Карталакс,Пинеалон,Оваген,Кристаген,Офталамин,Эпифамин,Тесталамин,Вазаламин,Церебрамин,Тирамин,Супренамин,Панкрамин,Гепатамин,Тимусамин,Хондрамин,Селанк,Пиналекс,Pinalex,Epitalon

Инфо Поле » Как правильно принимать сухой коллаген в порошке

02 июля 202002 июля 2020

Как пить сухой коллаген

Любая пищевая добавка, в том числе и порошкового коллагена, снабжена подробной инструкцией о ее применении. Различаются, как правило, только дозировки. Они напрямую зависят от производителя БАДа. Так, например, гидролизованный коллаген от “Иван-Поле” разводится в пропорции 5 граммов смеси на стакан воды (профилактическая суточная норма). Одной банки хватает для приготовления 50-и порций.

Но есть у порошкового коллагена и свои секреты. Для наилучшего растворения в воде, рекомендуется сначала развести порошок в небольшом ее количестве. И лишь потом долить до нужного объема.

В теории вместо воды можно использовать любимый сок или морс, но все-таки нежелательно. Дело в том, что это может ухудшить усвоение белка. По этой же причине коллаген не следует добавлять в пищу. Однако если возникла острая необходимость сделать это, то предпочтительнее выбирать небелковые блюда. То есть каши, вафли или блины. Соответственно, разводить порошок коллагена в белковых жидкостях также не рекомендуется.

Как принимать коллаген в порошке

Сухой коллаген усваивается лучше остальных коллагенов. Тем не менее, для того, чтобы максимально повысить всасываемость белка, его рекомендуется принимать утром за полчаса до приема пищи. Температура воды, в которой будет растворен порошок коллаген, не важна. Его волокна сохраняют свою структуру даже в очень горячей жидкости. Пить же смесь приятнее все-таки в холодном или теплом виде.

Как правильно принимать коллаген в порошке? Прежде всего не следует разводить коллаген впрок или делить уже растворенный порошок на два подхода. Порция должна быть выпита за один прием.

Как мы уже писали выше, профилактическая порция коллагена — 5 граммов в день. Терапевтическая — 10. В этом случае добавку лучше разделить на два приема. В противном случае большая часть питательного вещества просто не усвоится.

Профилактический курс приема обычно длится три месяца после чего следует трехмесячный перерыв. Данной схемы вполне достаточно, чтобы защитить соединительные ткани от преждевременного старения. После 40 лет следует сделать прием сухого коллагена более длительным — полгода приема и двухмесячный перерыв после.

Увеличивать рекомендуемые порции или продлевать профилактический курс самостоятельно не стоит. Только специалист может назначить дополнительный прием коллагена. Если все же придется пить коллаген несколько раз в день, то делать это нужно спустя 4 часа после последнего приема пищи и за полчаса до следующего.

Как правильно принимать коллаген 2 типа

Коллаген 2 типа назначают при проблемах с суставами, сухожилиями и связками. Распространенным показанием к приему является диагностированный артрит. Однако следует помнить о том, что коллаген 2 типа нужно принимать отдельно от добавок 1-го и 3-го типа. Они помогают сохранить молодость и здоровье кожи, волос, ногтей и скелета. Минимальный перерыв между приемом коллагенов разных типов составляет 2 часа.

Как правильно принимать коллаген и гиалуроновую кислоту

Гиалуроновая кислота усиливает эффект от приема коллагена, поскольку тоже является частью межклеточного матрикса. Она удерживает влагу внутри клеток, за счет чего процесс их восстановления протекает быстрее.

Некоторые производители включают гиалуроновую кислоту в состав сухого коллагена в качестве сопутствующего компонента. В противном случае ее прием стоит начать параллельно с белком. И если коллаген лучше принимать натощак, то гиалуроновую кислоту, напротив, — во время еды. Еще одним немаловажным условием для получения результата является питьевой режим. Во время приема БАДов рекомендуется пить как можно больше воды.

Сухой коллаген и витамин С

Аскорбиновая кислота или витамин С также увеличивают эффективность принимаемого коллагена. Белок лучше усваивается, а синтез собственного коллагена увеличивается, поскольку аминокислоты связываются и правильно формируют коллагеновые волокна.

Хорошо, если вы будете получать достаточное количество витамина С с пищей. Иначе вам следует начать параллельный курс приема аскорбиновой кислоты вместе с коллагеном. Или искать сухой коллаген, в составе которого уже есть нужный витамин.

Коллаген необходим нашему организму для поддержания здоровья костей и соединительных тканей, а также упругости и молодости кожи, волос и ногтей. Если в рационе не достаточно естественных источников коллагена, то есть мяса, желатина или морских продуктов, то рекомендуется принимать его в виде пищевой добавки. Сухой коллаген в порошке — один из наиболее доступных БАДов. Кроме того, он легко усваивается и не сильно бьет по кошельку. Для достижения максимального эффекта от приема сухого коллагена необходимо следовать инструкции и усиливать его действие витамином С, а также гиалуроновой кислотой.

ИНСТРУКЦИЯ по медицинскому применению препарата Церебролизин(R) (Cerebrolysin(R))

There are no translations available.

Торговое название препарата: Церебролизин(R) Лекарственная форма: раствор для инъекций Отпускается:  по рецепту врача

Инструкция по медицинскому применению препарата:

Церебролизин® (Cerebrolysin®)
 

Регистрационный номер: П N013827/01
 

Торговое название препарата:  Церебролизин
 

Международное название препарата: отсутствует
 

Лекарственная форма: раствор для инъекций
 

СОСТАВ:Активное вещество: 1 мл водного раствора препарата содержит 215,2 мг концентрата церебролизина (комплекс пептидов, полученных из головного мозга свиньи). Активная фракция Церебролизина представлена пептидами, молекулярный вес которых не превышает 10 ООО дальтон.

Вспомогательные вещества натрия гидроксид и вода для инъекций.

ОПИСАНИЕ:Прозрачный раствор янтарного цвета.
 

ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ГРУППА: ноотропное средство Код ATX: N06BX
 

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ: Фармакодинамика

Церебролизин содержит низкомолекулярные биологически активные нейропептиды,которые проникают через гематоэнцефалический барьер и непосредственно; поступают к нервным клеткам. Препарат обладает органоспецифическим мультимодальным действием на головной мозг, т.е.обеспечивает метаболическую регуляцию, нейропротекцию, функциональную нейромодуляцию и нейротрофическую активность.

а) метаболическая регуляция: церебролизин повышает эффективность аэробного  энергетического метаболизма головного мозга, улучшает внутриклеточный синтез белка в развивающемся и стареющем головном мозге.

б)       нейропротекция: церебролизин защищает нейроны от повреждающего действия лактацидоза, предотвращает образование свободных радикалов, повышает выживаемость и предотвращает гибель нейронов в условиях гипоксии и ишемии, снижает повреждающее нейротоксическое действие возбуждающих аминокислот (глутамата).

в)        нейротрофическая активность: церебролизин — единственный ноотропный пептидергический препарат с доказанной нейротрофической активностью, аналогичной действию естественных факторов нейронального роста (NGF), но проявляющейся в условиях периферического введения.

г)        функциональная нейромодуляция: церебролизин оказывает положительное влияние при нарушениях когнитивных функций, на процессы запоминания Фармакокинетика

Сложный состав Церебролизина, активная фракция которого состоит из сбалансированной и стабильной смеси биологически активных олигопептидов, обладающих суммарным полифункциональным действием, не позволяет провести обычный фармакокинетический анализ отдельных компонентов.

ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ:

Болезнь Альцгеймера, синдром деменции различного генеза, хроническая цереброваскулярная недостаточность, ишемический инсульт, травматические повреждения головного и спинного мозга; задержка умственного развития у детей, гиперактивность и дефицит внимания у детей; в комплексной терапии — при эндогенной         

депрессии, резистентной к антидепрессантам.  
      

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ:
 

                          — индивидуальная непереносимость препарата
                          — острая почечная недостаточность
                          — эпилептический статус
                                                                                                                                                                       

БЕРЕМЕННОСТЬ И ЛАКТАЦИЯ: 

                                   

С осторожностью препарат назначают в триместре беременности и в период   лактации.                                                                                 

В период беременности и во время грудного вскармливания Церебролизин следует применять только после тщательного анализа соотношения положительного эффекта лечения и риска, связанного с его проведением. Результаты экспериментальных исследований не дают оснований полагать, что Церебролизин обладает каким-либо тератогенным действием или оказывает токсическое влияние на плод. Однако аналогичные клинические исследования не проводились.
 

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ И ДОЗЫ:

Применяется парентерально. Дозы и продолжительность лечения зависят от характера и тяжести заболевания, а также от возраста больного. Возможно назначение однократных доз, величина которых может достигать 50 мл, однако более предпочтительно проведение курса лечения.

Рекомендуемый оптимальный курс лечения представляет собой ежедневные инъекции в течение 10-20 дней.
 

• Острые состояния (ишемический инсульт, черепно- мозговая травма, осложнения нейрохирургических операций):	от 10 мл до 50 мл
• В резидуальном периоде мозгового инсульта и травматического повреждения головного и спинного мозга:	от 5 мл до 50 мл
• При психоорганическом синдроме и депрессии:	от 5 мл до 30 мл
• При болезни Альцгеймера, деменции сосудистого и сочетанного альцгеймеровско-сосудистого генеза:	от 5 мл до 30 мл
• В нейропедиатрической практике:	0,1-0,2 мл/кг веса

Для повышения эффективности лечения могут быть проведены повторные курсы до тех пор, пока наблюдается улучшение состояния пациента вследствие лечения. После проведения первого курса периодичность назначения доз может быть снижена до 2 или 3 раз в неделю.

Церебролизин применяют в виде инъекций: внутримышечно (до 5 мл) и внутривенно (до 10 мл). Дозы от 10 мл до 50 мл рекомендуется вводить только посредством медленных внутривенных инфузий после разведения предложенными стандартными растворами для инфузий. Продолжительность инфузии составляет от 15 до 60 минут.

ПОБОЧНОЕ ДЕЙСТВИЕ:

Частые побочные эффекты — более 1/100 — менее 1/10; редкие побочные эффекты

—                 более 1/1000 — менее 1/100; очень редкие побочные эффекты — более 1/10000

—                 менее 1/1000; крайне редкие побочные эффекты — менее 1/10000.

При чрезмерно быстром введении в редких случаях возможно ощущение жара, потливость, головокружение и (в единичных случаях) возможно учащенное сердцебиение или аритмии.

Со стороны желудочно-кишечного тракта: в редких случаях наблюдались потеря аппетита, диспепсия, диарея, запоры, тошнота и рвота.

эпилептический статус                                                               

Со стороны ЦНС и периферической нервной системы: в редких случаях предполагаемый эффект активации сопровождался возбуждением (проявлявшимся агрессивным поведением, спутанностью сознания, бессонницей). Имеются сообщения о возникновении в единичных случаях (

Со стороны иммунной системы: в крайне редких случаях отмечались реакции повышенной чувствительности или аллергические реакции, проявляющиеся головной болью; болевыми ощущениями в шее, конечностях, нижней части спины; одышкой, ознобом и коллаптоидным состоянием.

Местные реакции: в редких случаях отмечается покраснение кожи, зуд и жжение в месте инъекции.

Прочие: по результатам исследований сообщалось о крайне редких случаях гипервентиляции, артериальной гипертонии, артериальной гипотонии, усталости, тремора, депрессии, апатии, головокружения и гриппоподобных симптомов (кашля, насморка, инфекций дыхательных путей).

Следует учесть, что некоторые нежелательные эффекты (возбуждение, артериальная гипертония, артериальная гипотония, вялость, тремор, депрессия, апатия, головокружение, головная боль, одышка, диарея, тошнота) были выявлены в ходе клинических испытаний и возникали в равной мере как у пациентов, получавших Церебролизин, так и у пациентов группы плацебо.

ПЕРЕДОЗИРОВКА: Не выявлено
 

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДРУГИМИ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ СРЕДСТВАМИ:

С учетом фармакологического профиля Церебролизина следует уделить особое нааа внимание возможным аддитивным эффектам при совместном назначении с антидепрессантами или ингибиторами МАО. В таких случаях рекомендуется снизить — дозу антидепрессанта. Не следует смешивать в одном растворе для инфузий Церебролизин и сбалансированные растворы аминокислот.

Церебролизин несовместим с растворами, в состав которых входят липиды, и с растворами, изменяющими рН среды (5,0-8,0). ОСОБЫЕ УКАЗАНИЯ

При чрезмерно быстром выполнении инъекций возможно ощущение жара, потливость, головокружение. Поэтому препарат следует вводить медленно. Проверена и подтверждена совместимость препарата (в течение 24 часов при комнатной температуре и наличии освещения) со следующими стандартными растворами для инфузий:

■                    0,9%-ый раствор натрия хлорида (9 мг NaCI/мл).

■                    Раствор Рингера (Na* — 153,98 ммоль/л; Са²⁺ — 2,74 ммоль/л; К* — 4,02 ммоль/л; СГ — 163,48 ммоль/л).

■                    5%-ый раствор глюкозы

Допускается одновременное назначение Церебролизина с витаминами и препаратами, улучшающими сердечное кровообращение, однако эти препараты не следует смешивать в одном шприце с Церебролизином. Использовать только прозрачный раствор и только однократно.
 

ВЛИЯНИЕ НА СПОСОБНОСТЬ К УПРАВЛЕНИЮ ТРАНСПОРТНЫМИ СРЕДСТВАМИ:

Клинические испытания показали, что Церебролизин не оказывает влияния на способность к управлению транспортными средствами и использованию механизмов.
 

ФОРМА ВЫПУСКА:

Раствор для инъекций ампулы 1 мл

По 1 мл в стеклянные ампулы коричневого цвета. По 10 ампул помещают в контурную ячейковую упаковку из ПВХ, покрытую вощеной бумагой. Одну контурную ячейковую упаковку с инструкцией по применению помещают в картонную пачку. Упаковка «in bulk»

По 10 ампул (1 мл) помещают в блистер из ПВХ, покрытый вощеной бумагой. По 50 или 225 блистеров с инструкцией по применению помещают в картонную коробку. Раствор для инъекций ампулы 5 мл и 10 мл

По 5 мл, 10 мл в стеклянные ампулы коричневого цвета. По 5 ампул помещают в контурную ячейковую упаковку из ПВХ, покрытую вощеной бумагой. Одну контурную ячейковую упаковку с инструкцией по применению помещают в картонную пачку. Раствор для инъекций флаконы 30 мл

По 30 мл во флакон из коричневого стекла, укупоренный резиновой пробкой под алюминиевой предохранительной обкаткой сотверстием для иглы в центре и закрытый защитной пластмассовой крышкой. По 1 или 5 флаконов с инструкцией по применению помещают в картонную пачку.
 

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ:

Хранить в защищенном от света месте при температуре не выше 25°С, Тщательно оберегать от детей.

Примечание: после вскрытия ампулы/флакона раствор должен использоваться незамедлительно.
 

СРОК ГОДНОСТИ:

Срок хранения ампул — 5 лет. Срок хранения флаконов — 4 года.

Не применять по истечении срока годности, указанного на упаковке
 

УСЛОВИЯ ОТПУСКА ИЗ АПТЕК: По рецепту

ПРОИЗВОДИТЕЛЬ:

ЭВЕР Нейро Фарма ГмбХ А-4866 Унтерах, Австрия, Европа.
 

УПАКОВЩИК: (ампулы 1 мл) ЗАО «БИОКОМ», Россия, 355016, г. Ставрополь, Чапаевский проезд, 54 Тел.: (8652) 36-53-56, 36-53-54 Факс: (8652) 36-53-55
 

Адрес представительства:

127055 Москва, ул. Бутырский Вал, 68/70, стр.1 Тел./факс: (495) 933 87 02

EVER
 

NEURO PHARMA

782834-06

EVER Neuro Pharma GmbH

A-4866 Unterach, AUSTRIA www.everpharma.com

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Антиоксиданты | Бесплатный полнотекстовый | Профиль жирных кислот и антиоксидантные свойства пептидов, выделенных из ферментированной корейки ягненка, обработанной ферментированным молоком

1. Введение

Ферментированные мясные продукты имеют далеко идущие традиции и преимущественно производятся и употребляются в пищу в западных странах [1]. В процессе производства основные компоненты мяса подвергаются многоступенчатым биохимическим (протеолиз, липолиз, окислительные изменения) и физическим (диффузия, испарение воды) изменениям, которые определяют безопасность, качество и сенсорные характеристики продукта, такие как вкус, цвет. и аромат.Ферментированные мясные продукты ценятся потребителями не только за их неповторимый вкус и аромат, но и за их пользу для здоровья. Несколько исследований показали, что эти продукты являются источником биологически активных пептидов [2,3,4]. Присутствие этих соединений связано с процессом ферментации, который приводит к протеолитическим изменениям белков, приводящим к образованию пептидов и аминокислот. Наше предыдущее исследование [5], в котором определялось содержание биоактивных соединений в ферментированных колбасах, в том числе биоактивных пептидов, подтвердило эту взаимосвязь.Биоактивные пептиды представляют собой специфические фрагменты белка, которые могут образовываться под действием эндогенных ферментов во время обработки, в основном ферментации [6]. Благодаря их положительному влиянию на здоровье человека, в последнее время было показано множество исследований свойств пептидов, выделенных из пищевых продуктов, в том числе в отношении мяса и мясных продуктов [2,5]. Результаты исследования [7,8] показали антигипертензивные, антиоксидантные, антибактериальные и антипролиферативные свойства пептидов, выделенных из мяса.Escudero et al. [9] провели исследования свойств пептидного экстракта, выделенного из испанской сыровяленой ветчины, с использованием метода эксклюзионной хроматографии. Продемонстрированы антиоксидантные свойства некоторых пептидных фракций по отношению к 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил-радикалу. Пептиды, испытанные в этой работе, также показали значительную антигипертензивную активность после перорального введения крысам со спонтанной гипертензией. Ферментированные мясные продукты уникальны тем, что используется высококачественное сырое мясо, а количество синтетических добавок сокращается или исключается в направлении «чистой этикетки». »Тенденция.Современные потребители предпочитают такие продукты, чем те, которые производятся традиционно с синтетическими добавками, в том числе нитратами [10]. Продукты из цельного мяса ферментированных жвачных животных обычно изготавливают из говядины; однако продукты из ферментированного мяса ягненка могут представлять интересный вариант для развития овцеводства. Более того, мясо ягненка отличается исключительной питательной ценностью, обусловленной жирнокислотным профилем внутримышечного жира, включая высокое содержание ненасыщенных кислот и конъюгированной линолевой кислоты [11].Предыдущие исследования показали, что порода или генотип являются важным фактором, влияющим на качество мяса ягненка [12,13]. Результаты, полученные Janiszewski et al. [14] также доказали, что породы ягненка оказали влияние на проверенные физические характеристики (например, pH, цвет и нежность) longissimus lumborum мышцы аборигенных польских пород, включая Uhruska, Wrzosówka, winiarka, которые являются ценными местными породами овец в Польша [15]. Добавки — еще один важный фактор, влияющий на качество ферментированных мясных продуктов.Для получения продуктов с чистой этикеткой используется натуральное сырье растительного или животного происхождения, которое проявляет свойства, аналогичные синтетическим добавкам [16]. Устранение нитрата натрия, который проявляет антиоксидантные свойства в мясных продуктах, создает необходимость искать натуральные ингредиенты, обладающие антиоксидантными свойствами. В этом контексте усилия по увеличению содержания биологически активных соединений в мясных продуктах, таких как пептиды с антиоксидантными свойствами, кажутся особенно важными. Как сообщает Wang et al.[17], роль биоактивных пептидов с антиоксидантными свойствами может заключаться в защите пищевых продуктов от активных форм кислорода путем захвата свободных радикалов и хелатирования ионов металлов. Из-за присутствия молочнокислых бактерий и биоактивных пептидов ферментированное молоко может быть интересным дополнением при производстве сырых мясных продуктов, ферментированных с использованием нативной микрофлоры [3]. Белки молока являются источником биоактивных пептидов, которые высвобождаются во время обработки пищевых продуктов [18] и проявляют связывающую минералы, опиоидную, ингибирующую АПФ, иммуномодулирующую, цитотоксическую, антиканцерогенную, антибактериальную и антитромботическую активность [19].

Насколько нам известно, еще не было опубликовано исследований о влиянии ферментированного молока на содержание и антиоксидантные свойства пептидов, выделенных из ферментированной корейки ягненка. В этом контексте данное исследование направлено на оценку влияния мацерации ферментированного молока на филе ягненка без нитратов с целью получения пептидов с высокой активностью против окислительных изменений (ABTS, DPPH, восстанавливающая способность), а также с благоприятным профилем жирных кислот, включая Содержание CLA. Кроме того, была предпринята попытка оценить влияние породы ягненка на оцениваемые свойства.

2. Материалы и методы

2.1. Сырье

Сырьем для производства квашеного мяса служила филе (m. Longissimus dorsi), полученное от ягнят трех польских пород: Wrzosówka, Uhruska и winiarka. Животные содержались в фермерских условиях, отвечающих требованиям органического земледелия. Ухрусских ягнят забивали в возрасте 5–6 месяцев (вес животных составлял 36 кг), а ягнят породы Вжосувка и Свинярка забивали в возрасте 7–8 месяцев и весили 27–29 кг.Овцы для эксперимента были выращены под наблюдением государственной ветеринарной инспекции. Разведение соответствовало всем требованиям европейского законодательства. Все права животных в соответствии с европейским законодательством контролировались и соблюдались на всех этапах от разведения до транспортировки и убоя. Отобранное для эксперимента мясо было закуплено в мясном цехе бойни. Мясо было упаковано в вакуумной упаковке и доставлено в условиях охлаждения в лабораторию и хранилось при 4 ± 1 ° С в течение 48 ч. По истечении этого времени мясо готовили путем очистки поверхности фасции, оставшихся сухожилий, придавая форму веретена часть примерно 1.0 кг. Приготовленные таким образом образцы мяса подвергали технологическим процедурам, включающим засолку (2,8%) морской солью или посолочной солью (морская соль 95,6%, нитрат натрия 0,4% (V) и мацерацию в натуральном кисломолке в течение 48 часов. Морская соль (не содержащая йод и без добавок, препятствующих слеживанию) (CuroDiMare, Италия) и глюкоза (Delecta, Польша) были приобретены в местных супермаркетах (Люблин, Польша). Нитрат натрия (без агентов, препятствующих слеживанию) был получен от StanLab ( Люблин, Польша). Ферментированное молоко, полученное из коровьего молока, закупалось в свежем виде на сертифицированном молочном заводе (Р.Яновский, Людвинув, Польша). На следующем этапе куски мяса сушат в камере созревания при 18 ° C в течение 24 часов. На следующий день был нанесен цемент, состоящий из семян горчицы, чеснока, свежего красного перца, черного перца, тмина, кориандра и воды. Все специи были помещены в блендер и перемешаны до образования вязкого теста. Затем куски мяса были тщательно покрыты пастой из специй со всех сторон, не оставляя зазора для сохранения продукта. Варианты партии были приготовлены путем выдержки в камерах для ферментации в течение 14 дней в условиях контролируемой влажности (75 ± 5%) и температуры (18 ± 1 ° C).В результате были получены три типа обработки: P1 — обработка лечебной солью (95,6% морской соли, 0,4% нитрата натрия), P2 — обработка морской солью и P3 — обработка морской солью и мацерированием в натуральном ферментированном молоке.

2.2. Отбор образцов и план эксперимента

В конце обработки из каждого варианта были взяты образцы. Кроме того, в начале эксперимента были проведены анализы сырья. Варианты были воспроизведены дважды, производя две разные партии в разные дни.В каждой партии было произведено 18 ферментированных филейных частей. Как сырье, так и ферментированный продукт были протестированы на их физико-химические свойства, содержание пептидов, их антиоксидантные свойства и профиль жирных кислот, включая кислоты CLA. Все измерения были выполнены в трех экземплярах для каждого образца.

2.3. Физико-химические свойства (активность воды, pH)

Анализатор активности воды (Novasina AG, Лахен, Швейцария), который дает измерения с контролем температуры, был использован для измерения активности воды ( _w ).Устройство откалибровано по стандартам влажности Novasina SAL-T на основе насыщенных солевых растворов (относительная влажность 33%, 75%, 84% и 90%).

Значение pH измеряли в суспензии, полученной путем гомогенизации 10 г измельченного образца с 50 мл деионизированной воды в течение 1 мин с использованием гомогенизатора IKA T25 (IKA ^® -Werke GmbH & CO. KG, Staufen, Германия). Использовали цифровой pH-метр (CPC-501, Elmetron, Zabrze, Польша), оборудованный pH-электродом (ERH-111, Hydroment, Gliwice, Poland) и датчиком температуры.

2.4. Определение содержания пептидов и их антиоксидантных свойств

Экстракцию пептидов проводили согласно методу, описанному Zhu et al. [20]. Полученный супернатант концентрировали в испарителе и растворяли в 0,01 М HCl и фильтровали через нейлоновый мембранный фильтр 0,45 мкм (AlfaChem, Торунь, Польша). Концентрацию пептидов определяли с помощью спектрофотометрического анализа о-фтальдиальдегида (OPA) в соответствии с процедурой Nielsen et al. [21]. Лейцин использовали в качестве стандарта для количественного определения содержания пептидов.Содержание пептидов выражали в мг пептидов на 100 г мясного продукта. Активность пептидного экстракта по улавливанию свободных радикалов определяли с использованием метода ABTS (2-азино-бис-3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) в соответствии с процедурой описанный Re et al. [22]. Активность пептидов по улавливанию остатков выражали в мМ эквивалента Trolox на мг пептидов. Антиоксидантные свойства пептидов также определяли как активность по улавливанию радикалов DPPH в соответствии с процедурой, описанной Zhu et al.[20]. Способность пептидов улавливать свободные радикалы DPPH оценивали со ссылкой на стандартную кривую Trolox. Результаты выражали в мМ эквивалента Trolox на мг пептидов. Ферроредуцирующая антиоксидантная сила (RP) пептидов определялась согласно Mora et al. [23]. Способность пептидов восстанавливать железо от степени окисления Fe ³⁺ (трехвалентное) до степени окисления Fe ²⁺ (двухвалентное железо) рассчитывали со ссылкой на результаты, полученные для стандартной кривой для аскорбиновой кислоты.Результаты выражали в эквиваленте мг аскорбиновой кислоты на мг пептидов.

2,5. Профиль жирных кислот

. Для экстракции жира из образца смесь хлороформа и метанола в соотношении 2: 1 (об. / Об.) Использовали в качестве экстракционного растворителя в соответствии с методом Folch et al. [24]. Газохроматографический анализ выполняли с использованием Varian 450-GC (Уолнат-Крик, Калифорния, США). Образцы разделяли с помощью капиллярной колонки (Select Biodiesel for FAME, Varian, Пало-Альто, Калифорния, США) (30 м × 0,32 мм × 0.Толщина пленки 25 мкм). Гелий использовался в качестве газа-носителя при скорости потока 1 мл / мин. Начальная температура была установлена ​​на 60 ° C. После впрыска температура колонки была запрограммирована на повышение на 200 ° C (поддерживалось в течение 10 мин), а затем повышалась до 240 ° C со скоростью 3 ° C мин. ^-1 . Конечная температура поддерживалась 4 мин. Стандартные эталонные метиловые эфиры жирных кислот использовали для идентификации пиков.

2.6. Статистический анализ

Эксперимент повторяли дважды, производя две разные партии в разные дни.Программа Statistica v. 13.3 использовалась для статистического анализа результатов, полученных в эксперименте. В рукописи данные выражены как среднее ± стандартное отклонение. Эксперимент проводился в двух партиях, различия между партиями не были значительными. Основные эффекты (породы и лечение) и взаимодействия между средними были рассчитаны с использованием факторного дисперсионного анализа. Апостериорные сравнения проводились с использованием критерия Тьюки. Все различия были достоверными при p ≤ 0,05.Чтобы оценить силу взаимосвязи между переменными, был рассчитан коэффициент корреляции Пирсона. Результаты были показаны в виде тепловой карты корреляции.

Контактные линзы, к которым не могут прилипнуть микробы? Ученые разводят дизайнерский молекулярный мех на поверхности — ScienceDaily

Белки играют решающую роль как в переносимости контактных линз, так и в прикреплении мидий к корпусам кораблей. При первом контакте с инородным материалом у них образуется биопленка.Этот очень сложный процесс чрезвычайно трудно изучить. Ученые из Бохума, работая в сотрудничестве с коллегами из Франкфурта и Марбурга, разработали новый метод исследования, который упрощает расшифровку задействованных механизмов.

Ученые разводят «на заказ» молекулярные «меха» на поверхностях с отдельными «волосками», состоящими из пептидов, коротких белков. Эти пептиды контролируют биосовместимость, то есть какие белки адсорбируются. Используя определенный пептид, ученые даже смогли создать поверхность, полностью устойчивую к протеинам, что очень желательно для определенных целей (например,грамм. для контактных линз).

Остаточные белки отвечают за реакцию отторжения имплантатов

При первом контакте жидкости организма с посторонними предметами (например, имплантатами) белки немедленно адсорбируются поверхностью этого материала. Однако во время этого процесса они повреждаются, теряют свою функцию и образуют биопленку. Точная природа этой биопленки, которая зависит от поверхности материала и предварительной обработки, затем определяет, отторгает ли тело имплантат или он растет внутрь по желанию.Точное понимание этих процессов усложняется тем, что слои адсорбированного белка чрезвычайно сложны и поэтому не поддаются тщательному исследованию.

Пептидное покрытие на слое золота

Исследователи в области физической химии (проф. Кристоф Велл) и неорганической химии (проф. Нильс Мецлер-Нольте) из Рурского университета разработали новый класс молекул, с помощью которых можно напрямую создавать биопленки с заданными свойствами. Первый шаг заключается в применении молекулярного «якоря» к коротким белковым цепям (пептидам), состоящим из нескольких аминокислот.Если эти молекулярные гибриды вступают в контакт с золотом, они прикрепляются жесткими химическими связями к металлу, в результате чего образуется покрытие толщиной и длиной с молекулу.

Поверхность золотого слоя чрезвычайно ровная, поэтому он служит «тарелкой», на которой можно использовать различные аналитические методы для точного исследования пептидных покрытий. Этот слой особенно полезен для анализа адсорбции белков. SPR (поверхностный плазмонный резонанс) является распространенным методом и позволяет быстро определять тип белков, адсорбированных пептидными покрытиями, а также скорость адсорбции.Полученные данные позволяют прогнозировать возможное отторжение иммунной системой человека.

Не адсорбирует белок

Чтобы продемонстрировать исключительную гибкость этого метода, ученые из Бохума использовали пептидную последовательность, оптимизированную для отторжения белка. Результат анализа биологического покрытия, созданного закреплением этих пептидов на поверхности Au, оказался неожиданным. Скорость отторжения белка первой испытанной последовательности была почти такой же высокой, как у лучшего вещества, использованного для этой цели на сегодняшний день.Профессор Велл был несколько удивлен и заявил, что исследовательская группа выбрала аминокислотную последовательность пептида просто на основании того факта, что гидрофильные пептиды с большей вероятностью отторгают белки, как и в случае с скрученными пептидами.

Полученная поверхность полностью сопротивлялась адсорбции белков. Это свойство, например, желательно для корпусов судов, чтобы предотвратить налипание мидий, которые, в свою очередь, увеличивают сопротивление и, следовательно, расход топлива. Эта особенность также желательна для контактных линз, поскольку можно предположить, что в этом случае ежедневная чистка больше не потребуется.Основным критерием при разработке материала имплантата является создание поверхностей, которые адсорбируют только определенные белки, что обеспечивает устойчивый рост в организме. Проф. Вёлль уверен, что новый метод, разработанный его исследовательской группой, поможет создавать материалы, специально разработанные для этой цели.

Самостоятельная сборка ЗУР

Одним из фундаментальных свойств для синтеза этих биосовместимых покрытий является создание самоорганизующихся монослоев (SAM) из тиолорганических соединений.На кафедре физической химии I эти ультратонкие, но структурно четко определенные молекулярные слои уже были подробно исследованы и подлежат постоянному совершенствованию для ряда областей применения на протяжении более десяти лет. Эта в высшей степени междисциплинарная область исследований требует отличного сотрудничества между членами факультетов физической химии и синтетической химии, причем последние способны синтезировать необходимые тиолорганические соединения. Пептиды, использованные в этом исследовании, были связаны с тиоловыми линкерами с использованием только недавно разработанной стратегии синтеза — так называемой химии «щелчка», которая была усовершенствована проф.Metzler-Nolte. С помощью этого метода можно просто «соединить» совершенно разные молекулы, в данном случае пептиды и тиоловый якорь.

История Источник:

Материалы предоставлены Ruhr-Universitaet-Bochum . Примечание. Содержимое можно редактировать по стилю и длине.

Сравнительный протеомный анализ молока крупного рогатого скота Кашмира и Джерси выявил дифференциальную экспрессию ключевых белков, участвующих в регуляции иммунной системы и качестве молока | BMC Genomics

1.

Рейнхардт Т.А., Липполис Дж. Д.. Протеом мембраны жировых глобул коровьего молока. J Dairy Res. 2006. 73 (4): 406–16.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

2.

Северин С., Веншуй X. Биологически активные компоненты молока в качестве нутрицевтиков. Crit Rev Food Sci Nutr. 2005. 45 (7–8): 645–56.

PubMed
Статья
CAS
PubMed Central

Google ученый

3.

Dai W, Chen Q, Wang Q, White RR, Liu J, Liu H. Дополнительные транскриптомные и протеомные анализы выявили регуляторные механизмы производства молочного белка у дойных коров, потребляющих различные корма. Научный доклад 2017; 7: 44234.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

4.

Lönnerdal B. Детские смеси и детское питание: биоактивные белки грудного молока и их значение для состава детских смесей.Am J Clin Nutr. 2014; 99 (3): 712С – 7С.

PubMed
Статья
CAS
PubMed Central

Google ученый

5.

Ляо Ю., Цзян Р., Лённердал Б. Биохимическое и молекулярное влияние лактоферрина на рост и развитие тонкого кишечника в молодом возрасте. Biochem Cell Biol. 2012. 90 (3): 476–84.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

6.

Резников Е.А., Комсток С.С., Й.и.С., Подрядчик Н., Донован С.М. Диетический коровий лактоферрин увеличивает пролиферацию кишечных клеток у новорожденных поросят, 2. J Nutr. 2014; 144 (9): 1401–8.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

7.

Ibeagha-Awemu EM, Ibeagha AE, Messier S, Zhao X. Протеомика, геномика и анализ путей молочной сыворотки, инфицированной Escherichia coli и Staphylococcus aureus, выявляют молекулярные пути и сети, участвующие в мастите.J Proteome Res. 2010. 9 (9): 4604–19.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

8.

Вада Ю., Лённердаль Б. Биоактивные пептиды, полученные из белков грудного молока — механизмы действия. J Nutr Biochem. 2014; 25 (5): 503–14.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

9.

Касадо Б., Аффолтер М., Куссманн М. Исследования молочных белков, олигосахаридов и липидов, основанные на OMICS.J Proteomics. 2009. 73 (2): 196–208.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

10.

German JB, Dillard CJ, Ward RE. Биоактивные компоненты в молоке. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2002. 5 (6): 653–8.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

11.

Лённердаль Б. Питательное и физиологическое значение белков грудного молока.Am J Clin Nutr. 2003; 77 (6): 1537С – 43С.

PubMed
Статья

Google ученый

12.

Mohanty DP, Mohapatra S, Misra S, Sahu PS. Биоактивные пептиды, полученные из молока, и их влияние на здоровье человека — обзор. Saudi J Biol Sci. 2016; 23 (5): 577–83.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

13.

Майзель Х. Биохимические свойства пептидов, зашифрованных в белках коровьего молока.Curr Med Chem. 2005; 12 (16): 1905–19.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

14.

Ibeagha-Awemu EM, Liu J, Zhao X. Биоактивные компоненты в йогуртовых продуктах. В: Парк Ю.В., редактор. Биоактивные компоненты в молоке и молочных продуктах, 2009 г .; 2009. с. 235–50.

Глава

Google ученый

15.

Ward RE, German JB. Понимание биоактивных компонентов молока: цель инструментария геномики.J Nutr. 2004; 134 (4): 962С – 7С.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

16.

Tacoma R, Fields J, Ebenstein DB, Lam YW, Greenwood SL. Характеристика протеома коровьего молока у молочных коров голштинской и джерсийской пород в раннем периоде лактации. J Proteomics. 2016; 130: 200–10.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

17.

Litwińczuk Z, Król J, Brodziak A, Barłowska J.Изменение содержания белка и его фракций в коровьем молоке разных пород в зависимости от количества соматических клеток. J Dairy Sci. 2011; 94 (2): 684–91.

PubMed
Статья
CAS
PubMed Central

Google ученый

18.

Д’Аурия Э., Агостони С., Джованнини М., Рива Э., Зеттерстрём Р., Фортин Р., Ронкада П. Протеомная оценка молока от различных видов млекопитающих как заменителя грудного молока. Acta Paediatr. 2005. 94 (12): 1708–13.

PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

19.

Ян И, Бу Д., Чжао X, Сан П., Ван Дж, Чжоу Л. Протеомный анализ белков сыворотки коровьего, як, буйволиного, козьего и верблюжьего молока: количественные дифференциальные паттерны экспрессии. J Proteome Res. 2013; 12 (4): 1660–7.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

20.

Ван Х, Чжао Х, Хуан Д, Пань Х, Ци И, Ян Й, Ченг Дж.Протеомный анализ и межвидовое сравнение фракций казеина из молока молочных животных. Научный отчет 2017; 7: 43020.

PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

21.

Oltenacu PA, Algers B. Отбор для увеличения продуктивности и благополучия дойных коров: нужны ли новые цели селекции? Ambio. 2005. 34 (4): 311–5.

PubMed
Статья

Google ученый

22.

Чжан Л., ван Дейк А.Д., Хеттинга К. Обзор взаимодействия протеома человеческого и коровьего молока в период лактации. Proteome Sci. 2016; 15 (1): 1.

PubMed
Статья
CAS

Google ученый

23.

Мол П., Каннегундла У., Дей Дж., Гопалакришнан Л., Даммалли М., Кумар М., ТСК П. Сравнительный протеомный анализ коровьего молока при ранней, средней и поздней лактации у пород крупного рогатого скота, Малнад Гидда ( Bos индика ). Омикс.2018; 22 (3): 223–35.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

24.

Аффолтер М., Грасс Л., Ванробайс Ф., Касадо Б., Куссманн М. Качественное и количественное профилирование протеома мембраны глобулы жира коровьего молока. J Proteome. 2010. 73 (6): 1079–88.

CAS
Статья

Google ученый

25.

Мураками К., Лагард М., Юки Ю. Идентификация минорных белков человеческого молозива и зрелого молока с помощью двумерного электрофореза.Электрофорез. 1998. 19 (14): 2521–7.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

26.

Ямада М., Мураками К., Уоллингфорд Дж. К., Юки Ю. Идентификация белков с низким содержанием молозива крупного рогатого скота и зрелого молока с использованием двумерного электрофореза с последующим микросеквенированием и масс-спектрометрией. Электрофорез. 2002. 23 (7–8): 1153–60.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

27.

Палмер Диджей, Келли В.К., Смит А.М., Куи С., Найт К.Г., Купер Дж. Дж. Человеческое молозиво: идентификация минорных белков в водной фазе с помощью протеомики. Протеомика. 2006. 6 (7): 2208–16.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

28.

Амиго Л., Ресио И., Рамос М. Генетический полиморфизм белков овечьего молока: его влияние на технологические свойства молока — обзор. Int Dairy J. 2000; 10 (3): 135–49.

CAS
Статья

Google ученый

29.

Masson PL, Heremans JF. Лактоферрин в молоке разных видов. Comp Biochem Physiol. 1971; 1: 119–29.

Google ученый

30.

Хеннарт П.Ф., Brasseur DJ, Delogne-Desnoeck JB, Dramaix MM, Robyn CE. Содержание лизоцима, лактоферрина и секреторного иммуноглобулина А в грудном молоке: влияние продолжительности лактации, статуса питания, статуса пролактина и половой жизни матери. Am J Clin Nutr. 1991; 53 (1): 32–9.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

31.

Вайнберг ЭД. Удержание железа: защита от инфекций и новообразований. Physiol Rev.1984; 64 (1): 65–102.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

32.

Арнольд Р.Р., Рассел Дж. Э., Чемпион WJ, Брюер М., Готье Дж. Дж. Бактерицидная активность человеческого лактоферрина: дифференциация от стаза депривации железа. Заражение иммунной. 1982; 35 (3): 792–9.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

33.

Ellison RT III, LaForce FM, Giehl TJ, Boose DS, Dunn BE. Повреждение грамотрицательной внешней мембраны лактоферрином и трансферрином модулируется Ca2 + и Mg2 +. Микробиология. 1990. 136 (7): 1437–46.

CAS

Google ученый

34.

Carraway KL, Hull SR. Гликопротеины муцинового типа и муциноподобные домены клеточной поверхности. Гликобиология. 1991. 1 (2): 131–8.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

35.

Larocca D, Peterson JA, Walkup G, Urrea R, Ceriani RL. Клонирование и секвенирование комплементарной ДНК, кодирующей антиген, связанный с эпителиальным муцином молочной железы человека Mr 70,000. Cancer Res. 1990. 50 (18): 5925–30.

CAS
PubMed
PubMed Central

Google ученый

36.

Ван Г, Кунду Р., Хан С., Ци Х, Энгландер Э. У., Квертермоус Т., Грили Г. Х. мл. Онтогенез апелина и его рецепторов в желудочно-кишечном тракте грызунов. Regul Pept.2009. 158 (1–3): 32–9.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

37.

Айдын С. Присутствие пептидов апелина, грелина и несфатина-1 в грудном молоке человека и снижение их уровней у пациентов с гестационным сахарным диабетом. Пептиды. 2010. 31 (12): 2236–40.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

38.

Данбар А.Дж., Прибе И.К., Белфорд Д.А., Годдард С. Идентификация бетацеллулина как основного фактора роста пептидов в молоке: очистка, характеристика и молекулярное клонирование бетацеллулина крупного рогатого скота. Биохим Дж. 1999; 344 (Pt 3): 713.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

39.

Grosvenor CE, Picciano MF, Baumrucker CR. Гормоны и факторы роста в молоке. Endocrine Rev.1993; 14 (6): 710–28.

CAS
Статья

Google ученый

40.

Карпентер Г. Эпидермальный фактор роста является основным стимулятором роста грудного молока. Наука. 1980. 210 (4466): 198–9.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

41.

Ceciliani F, Pocacqua V, Provasi E, Comunian C, Bertolini A, Bronzo V, Sartorelli P. Идентификация бычьего $ \ alpha $ 1-кислотного гликопротеина в молозиве и молоке. Vet Res. 2005. 36 (5–6): 735–46.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

42.

Lönnerdal B. Грудное молоко: биоактивные белки / пептиды и функциональные свойства. В книге «Белки в питании новорожденных и младенцев: последние обновления», 2016 г. (том 86, стр. 97–107). Karger Publishers.

43.

Berger M, Gray JA, Roth BL. Расширенная биология серотонина. Ann Rev Med. 2009. 60: 355–66.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

44.

Bounous G, Kongshavn PA. Влияние пищевых белков на иммунную систему мышей.J Nutr. 1982; 112 (9): 1747–55.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

45.

Creamer LK, Ploughman JE, Liddell MJ, Smith MH, Hill JP. Стабильность мицелл: структура и функция κ-казеина. J Dairy Sci. 1998. 81 (11): 3004–12.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

46.

Strömqvist M, Falk P, Bergström S, Hansson L, Lönnerdal B, Normark S, Hernell O.Каппа-казеин грудного молока и ингибирование адгезии Helicobacter pylori к слизистой оболочке желудка человека. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1995. 21 (3): 288–96.

PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

47.

Келлехер С.Л., Чаттертон Д., Нильсен К., Лённердаль Б. Гликомакропептиды и альфа-лактальбумин в смеси для младенцев влияет на рост и статус питания детенышей макак-резусов. Am J Clin Nutr. 2003. 77 (5): 1261–8.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

48.

Pringnitz DJ, Butler JE. Количественное определение бычьего β2-микроглобулина: наличие в жидкостях организма, на шариках жира в молоке и происхождение в молоке. Мол Иммунол. 1985. 22 (7): 779–86.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

49.

Федосов С.Н., Петерсен Т.Э., Нексё Э.Транскобаламин из коровьего молока: изоляция и физико-химические свойства. Biochim Biophys Acta (BBA) -Protein Struct Mol Enzymol. 1996; 1292 (1): 113–9.

Артикул

Google ученый

50.

Хайн Б., Боггс И., Грин Р., Миллер Дж. У., Хови Р. С., Хамфри Р., Уиллер Т. Т.. Транскобаламин, полученный из коровьего молока, стимулирует апикальное поглощение витамина B12 эпителиальными клетками кишечника человека. J Cell Biochem. 2014; 115 (11): 1948–54.

CAS
PubMed

Google ученый

51.

Hvarregaard J, Andersen MH, Berglund L, Rasmussen JT, Petersen TE. Характеристика гликопротеина PAS-6/7 из мембран глобул жира коровьего молока. FEBS J. 1996; 240 (3): 628–36.

CAS

Google ученый

52.

Yolken RH, Peterson JA, Vonderfecht SL, Fouts ET, Midthun K, Newburg DS. Муцин грудного молока подавляет репликацию ротавируса и предотвращает экспериментальный гастроэнтерит. J Clin Invest. 1992; 90 (5): 1984–91.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

53.

Becker-Dreps S, Choi WS, Stamper L, Vilchez S, Velasquez DE, Moon SS, Permar SR. Факторы врожденного иммунитета в материнском грудном молоке и их отсутствие связи с иммуногенностью ротавирусной вакцины у никарагуанских младенцев. J Pediatr Infect Dis Soc. 2017; 6 (1): 87–90.

Артикул

Google ученый

54.

Lundén A, Gustafsson V, Imhof M, Gauch R, Bosset JOJ. Dairy Res. 2002; 69 (3): 383–90.

Артикул
CAS

Google ученый

55.

Питер Х, Мария К. Исследования механизма образования микросомальных N-оксидов в печени. Роль цитохрома P-450 и аминоксидазы со смешанными функциями в N-окислении NN-диметиланилина. Биохим Дж. 1977; 164 (3): 487.

Артикул

Google ученый

56.

Spellacy E, Watts RWE, Goolamali SK. Триметиламинурия. J Inherit Metab Dis. 1979; 2: 85–8.

Артикул

Google ученый

57.

Eswaramoorthy S, Bonanno JB, Burley SK, Swaminathan S. Механизм действия флавинсодержащей монооксигеназы. Proc Natl Acad Sci. 2006. 103 (26): 9832–7.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

58.

Cashman JR, Zhang J. Человеческие флавинсодержащие монооксигеназы. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2006; 46: 65–100.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

59.

Krueger SK, Williams DE. Флавинсодержащие монооксигеназы млекопитающих: структура / функция, генетический полиморфизм и роль в метаболизме лекарств. Pharmacol Ther. 2005. 106 (3): 357–87.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

60.

Chen GP, ​​Ziegler DM. Микросомы печени и флавин-содержащая монооксигеназа, катализируемая окислением органических соединений селена. Arch Biochem Biophys. 1994; 312 (2): 566–72.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

61.

Бхат С.А., Ахмад С.М., Ибегха-Авему Е.М., Бхат Б.А., Дар М.А., Мумтаз П.Т., Ганаи Н.А. Сравнительный анализ транскриптома эпителиальных клеток молочной железы на разных стадиях лактации показывает значительные различия в экспрессии генов и путях, регулирующих синтез молока, у крупного рогатого скота Джерси и Кашмира. PLoS One. 2019; 14 (2).

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

62.

Feder ME, Walser JC. Биологические ограничения транскриптомики в объяснении стресса и стрессовых реакций.J Evol Biol. 2005. 18 (4): 901–10.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

63.

Канехиса М., Сато Ю., Кавашима М., Фурумичи М., Танабе М. KEGG как справочный ресурс для аннотации генов и белков. Nucleic Acids Res. 2015; 44 (D1): D457–62.

PubMed
PubMed Central
Статья
CAS

Google ученый

64.

Incassati A, Chandramouli A, Eelkema R, Cowin P.Ключевые сигнальные узлы в развитии молочной железы и рака: β-катенин. Рак молочной железы Res. 2010; 12 (6): 213.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

65.

Yu QC, Verheyen EM, Zeng YA. Развитие молочной железы и рак груди: перспектива Wnt. Раки. 2016; 8 (7): 65.

PubMed Central
Статья
CAS
PubMed

Google ученый

66.

Брискен С., Хейнеман А., Чаваррия Т., Эленбаас Б., Тан Дж., Дей С.К. и др. Важная функция Wnt-4 в развитии молочных желез ниже передачи сигналов прогестерона. Genes Dev. 2000. 14 (6): 650–4.

CAS
PubMed
PubMed Central

Google ученый

67.

Zhang X, Martinez D, Koledova Z, Qiao G, Streuli CH, Lu P. Лиганды FGF постнатальной стромы молочной железы регулируют различные аспекты эпителиального морфогенеза. Разработка.2014. 141 (17): 3352–62.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

68.

Тернер Н., Гроуз Р. Передача сигналов фактора роста фибробластов: от развития до рака. Нат Рев Рак. 2010; 10 (2): 116.

CAS
PubMed
Статья

Google ученый

69.

Фурт PA, Nakles RE, Millman S, Diaz-Cruz ES, Cabrera MC. Сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 5 как ключевой сигнальный путь в нормальной биологии развития молочной железы и при раке груди.Рак молочной железы Res. 2011; 13 (5): 220.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

70.

Oikonomopoulou K, Ricklin D, Ward PA, Lambris JD. Взаимодействие между коагуляцией и комплементом — их роль в воспалении. Semin Immunopathol. 2012; 341: 51–165.

Google ученый

71.

Кэрролл М.С. Комплементарный и гуморальный иммунитет. Вакцина. 2008; 26: I28–33.

CAS
PubMed
PubMed Central
Статья

Google ученый

72.

Kunz C, Lönnerdal B. Белки грудного молока: анализ казеина и субъединиц казеина с помощью анионообменной хроматографии, гель-электрофореза и специфических методов окрашивания. Am J Clin Nutr. 1990. 51 (1): 37–46.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

73.

Perez-Riverol Y, Csordas A, Bai J, Bernal-Llinares M, Hewapathirana S, Kundu DJ, Inuganti A, Griss J, Mayer G, Eisenacher M, Pérez E, Uszkoreit J, Pfeuffer J, Sachsenberg T, Yilmaz S, Tiwary S, Cox J, Audain E, Walzer M, Jarnuczak AF, Ternent T, Brazma A, Vizcaíno JA.База данных PRIDE и связанные с ней инструменты и ресурсы в 2019 году: улучшение поддержки количественных данных. Nucleic Acids Res. 2019; 47 (D1): D442–50 Идентификатор PubMed: 30395289.

CAS
PubMed
Статья
PubMed Central

Google ученый

Главный герой станет героем в создании стабильных пероральных пептидов для замены инъекционных препаратов

Уэйн Коберштейн, ответственный редактор

ОБЗОР
Protagonist Therapeutics разработала технологию изготовления стабильных пероральных пептидов, способных заменить препараты, вводимые только для инъекций, и разрабатывает совершенно новые пероральные пептидные терапевтические препараты для пациентов с желудочно-кишечным трактом.Его начальные области развития — заболевания раздраженного кишечника (ВЗК) и синдром раздраженного кишечника (СРК). Два соединения, одно из которых представляет собой инъекционный пептид для блокирования IL-6, а другое, пероральный пептид для блокирования интегринов, будут проходить клинические испытания в 2015 году.

ПОСЛЕДНИЕ ОБНОВЛЕНИЯ

• 4 квартал 2013 г .: продвинутый проект инъекционного пептидного антагониста IL-6 до стадии доклинической разработки с назначением кандидата IND (новый исследуемый препарат) ожидается в 2014 г.
• Четвертый квартал 2013 г .: продвинутый проект орального пептидного антагониста интегрина от начала до стадии доклинической разработки с назначением кандидата IND ожидается в 2014 г.
• 2013: привлечено 18 миллионов долларов в рамках серии B для финансирования разработки перорального пептида путем инициирования фазы 1 клинических испытаний

ЧТО НА СТАВКЕ
Протагонисту, как и многим компаниям-разработчикам, потребовались годы, чтобы разработать платформу, но все это время он намеревался разработать собственные лекарственные препараты с помощью пероральной пептидной технологии, а не стать директором по маркетингу.Таким образом, ее вклад может быть потрясающим с двух сторон — предлагая долгожданную альтернативу существующим инъекционным антителам и пептидам, а также предлагая новый вид пероральных лекарств с превосходной эффективностью и безопасностью — и, по словам компании, удобство, соответствие требованиям и доступность.

Между миром малых молекул и белков находится царство пептидов: по сути, цепочки аминокислот с уникальным терапевтическим потенциалом, но в традиционных пероральных составах пептиды имеют серьезные недостатки в стабильности и фармакокинетических свойствах.«Наше намерение состоит в том, чтобы создать новые химические соединения, которые объединят лучшее из обоих миров, что означает удобство и фармакокинетические характеристики малых молекул, включая пероральную доставку и пероральную стабильность, а также важные характеристики эффективности больших биопрепаратов, то есть способность работают с крупными мишенями межбелкового взаимодействия », — говорит президент и главный исполнительный директор Protagonist Динеш Патель. В исследованиях компании такие цели включают IL-6, IL-23, TNF и интегрины.

Области GI — IBD и IBS — являются естественными кандидатами для разработки лекарств, учитывая, что первое препятствие для пероральных пептидов — это кишечник.«Для нас IBD — это не вторичное приложение; это основное приложение, и мы выбрали его специально, чтобы в полной мере использовать преимущества перорального пептидного препарата », — говорит Патель.

Главный герой не одинок в этой области, и даже не один из самых продвинутых в разработке пероральных пептидных лекарств. Рош сотрудничает с Chiasma в разработке перорального аналога соматостатина с использованием платформы Transient Permeability Enhancer (TPE) небольшой компании. Enteris BioPharma недавно возродила платформу Peptelligence, приобретенную у Unigene.А Ironwood Pharmaceuticals, которая сотрудничает с Protagonist с 2011 года, уже выпустила линаклотид, пептидный агонист GCC для перорального приема один раз в день при СРК с преобладанием запоров. Другие исследовали пероральный пептидный ответ в ингибиторах протеазы, усилителях проницаемости, наночастицах, жидких эмульсиях, водно-масляных микроэмульсиях и липосомах.

Патель так сказал о позиции своей компании в этой области: «Здоровая конкуренция — это не плохо, и мы рады видеть большой интерес к пероральным пептидам.В то время как почти все наши конкуренты применяют различные стратегии рецептуры, Protagonist использует свою запатентованную технологическую платформу для обнаружения новых пептидных химических соединений (НХЭ), которые являются одновременно мощными и устойчивыми при пероральном приеме ».

Патель добавляет, что оба партнера Protagonist, Ironwood и Zealand Pharma, считали платформу его компании «взаимодополняющей и синергетической» по отношению к их собственному опыту и опыту. «Это сотрудничество — первая важная проверка технологии Protagonist.Следующим шагом будет направление пептидных активов во все внутренние клинические каналы наших компаний ».

Независимо от того, кто победит в гонке за звание лучшего будущего пакета оральных пептидов, некоторые сообщения в прессе неоправданно превозносят новые технологии. Один из недавних анализов рассматривает платформу Protagonist как еще одну альтернативу в доставке лекарств, явно упуская из виду тот очевидный факт, что мир с нетерпением ждал перорального раствора для ограничения инъекционных пептидов.Оральная доставка пептидов будет большим прорывом, а не постепенным улучшением.

Активность, экспрессия и генетические вариации собачьего β-дефенсина 103: многофункциональный противомикробный пептид в коже домашних собак — FullText — Journal of Natural Immunity 2012, Vol. 4, № 3

Аннотация

Кожа действует не только как физический барьер для инфекции. Эпителиальные клетки кожи могут синтезировать антимикробные пептиды, в том числе дефенсины, которые проявляют прямую антимикробную активность.Здесь мы охарактеризуем паттерн экспрессии, генетические вариации и активность основного β-дефенсина, экспрессируемого в коже собак, β-дефенсина 103 собаки (CBD103). Ген, кодирующий CBD103, проявляет две формы полиморфизма: общий аллель с делецией из 3 пар оснований и вариацию числа копий гена. Золотистые ретриверы и лабрадоры были единственными породами, кодировавшими вариантный аллель CBD103, названный CBD103 Δ G23 . Обе эти породы также демонстрировали полиморфизм числа копий гена CBD103 , который варьировался от 2 до 4 копий гена на диплоидный геном.Рекомбинантные CBD103 и CBD103ΔG23, а также человеческий ортолог человеческий β-дефенсин 3 (hBD3) и hBD3ΔG23 продемонстрировали мощное и сопоставимое антимикробное уничтожение как чувствительных к метициллину, так и устойчивых к метициллину Staphylococcus pseudintermedius . Образцы биопсии кожи собак с атопическим дерматитом показали, что уровни экспрессии CBD103 аналогичны уровням экспрессии у здоровых людей и сопоставимы на участках поражения и без повреждений. Этот паттерн экспрессии у собак отличается от ранее описанного сниженного уровня экспрессии ортолога человека при атопическом дерматите.В целом, сходство CBD103 и его человеческого ортолога, о котором здесь сообщается, подтверждают мнение о том, что домашняя собака может служить ценной моделью для изучения биологии β-дефенсина в коже.

© 2012 S. Karger AG, Базель

---

Введение

Поверхности эпителия, включая кожу, часто сталкиваются с болезнетворными микроорганизмами, но частота инфицирования относительно низка. Физические барьеры для инфекции, циркулирующие лейкоциты и эндогенная микрофлора играют важную роль в защите хозяина.В дополнение к этим защитным механизмам эпителиальные клетки синтезируют и секретируют растворимые эффекторные молекулы, называемые антимикробными пептидами, которые служат эндогенными антибиотиками для предотвращения инфекции [1,2]. Эти эпителиальные антимикробные пептиды экспрессируются многими разнообразными видами, от беспозвоночных до видов более высокого уровня, включая млекопитающих [3].

У млекопитающих дефенсины являются основным семейством антимикробных пептидов, и эту группу можно разделить на подсемейства: α-, β- и θ-дефенсины [4].Α-дефенсины были описаны у многих млекопитающих, включая глейров, лошадей, мышей, крыс, приматов и людей, в то время как θ-дефенсины присутствуют только у нечеловеческих приматов [5]. Напротив, β-дефенсины представляют собой старейшее эволюционное подсемейство, обнаруженное у различных видов, от подковообразных крабов и птиц до гоминидов. Геномы некоторых млекопитающих, таких как жвачные и плотоядные, по-видимому, кодируют исключительно β-дефенсины.

β-дефенсинов экспрессируются во многих эпителиальных тканях, включая высокую экспрессию в коже.Они выполняют множество функций в врожденном иммунитете, включая защиту хозяина в качестве эндогенных антибиотиков, передачу сигналов, способствующих хемотаксису и заживлению ран, и другие виды межклеточной коммуникации [3,5,6,7,8]. Экспрессия и биологическая роль β-дефенсинов при различных кожных заболеваниях были предметом многочисленных исследований [1,9,10,11,12,13]. Однако большая часть наших знаний о β-дефенсинах в коже основана на исследованиях пептидов человека, поскольку модели на животных еще не полностью разработаны. В этом отношении домашняя собака становится потенциально ценной моделью для изучения β-дефензинов [8,14,15,16].Вычислительный анализ генома собаки, выполненный Патилом и соавт. [14], продемонстрировали, что геном собаки кодирует 43 гена и псевдогена β-дефенсина. Геномная организация этих генов аналогична таковой для генов β-дефенсина у людей и мышей. Напр., Главный кластер β-дефенсина человека на хромосоме 8 является синтеничным кластеру собак на хромосоме 16 [14]. Два из человеческих β-дефенсинов (hBD), кодируемых в этом кластере, hBD2 и hBD3, индуцибельно экспрессируются до высоких уровней в коже человека, и оба обладают сильной антимикробной активностью [1,17,18].На основании сравнения последовательностей hBD3 и собачий β-дефенсин 103 (CBD103), по-видимому, являются ортологами. CBD103 экспрессируется в коже собак [8,15] и дыхательных путях [16], паттерн тканевой экспрессии подобен его аналогу у человека. Обладает ли CBD103 мощной антибактериальной активностью hBD3, еще не было тщательно изучено и проверено в этом исследовании. В настоящее время у собак нет ортолога hBD2. Как характерно для семейства дефенсинов, часто существует большая вариабельность от вида к виду, поэтому такие различия обычно выявляются [3] и их важно учитывать при разработке полезных моделей на животных.

Интересно, что CBD103 демонстрирует два типа генетических полиморфизмов: (1) вариантный аллель с делецией из 3 пар оснований в его кодирующей последовательности и (2) вариация числа копий гена. Делеция из 3 пар оснований в CBD103 , обозначенная как CBD103 Δ G23 , была идентифицирована как аллельный вариант, ответственный за доминирующий черный окрас шерсти у собак [8]. CBD103ΔG23 не имеет остатка глицина на N-конце зрелого пептида и может связываться с рецептором меланокортина 1 (Mc1r) на поверхности меланоцитов с более высоким сродством, чем CBD103.Считается, что из-за своей аффинности связывания и высокого уровня экспрессии CBD103ΔG23 вытесняет Агути, антагонист передачи сигналов Mc1r, позволяя Mc1r передавать неослабевающий сигнал, что приводит к синтезу черного пигмента эумеланина и приводит к черной окраске шерсти.

В дополнение к варианту последовательности ΔG23, CBD103 , по-видимому, проявляет другую форму генетической пластичности — вариацию числа копий гена [19]. В то время как большинство генов присутствует в двух копиях на диплоидный геном, вариация числа копий описывает явление, при котором гены, расположенные в одном локусе, присутствуют в популяции с переменным числом копий по сравнению с эталонным геномом.У человека ген, кодирующий hBD3, находится в кластере генов β-дефенсина, который проявляет полиморфизм числа копий, который варьируется от 1 до 12 копий на диплоидный геном в популяциях человека [20]. Полиморфизм числа копий гена для этого кластера β-дефенсина, включая ген, кодирующий hBD3 и соседние гены β-дефенсина, был тщательно исследован, в том числе его связь с восприимчивостью к кожным заболеваниям [11]. Однако сведения об изменении числа копий гена предполагаемого ортолога собаки, CBD103, , скудны.

Атопический дерматит (БА) — это хроническая воспалительная дерматопатия, которая часто осложняется вторичной бактериальной инфекцией как у собак, так и у людей [21]. Считается, что у людей с БА воспалительные цитокины в коже, такие как IL-4 и IL-13, снижают экспрессию hBD3 [22]. Кроме того, было отмечено, что кожа человека с БА не способна убивать Staphylococcus aureus из-за аберраций в мобилизации hBD3 [23]. Недавнее исследование на собаках с БА показывает, что экспрессия CBD103 и одинакова для поврежденной и не поврежденной кожи, но снижена по сравнению со здоровой контрольной группой [24].

В этом исследовании мы стремились дать представление об антимикробной активности, экспрессии в тканях в здоровых и больных образцах, а также о разновидностях CBD103 и его общих генетических полиморфизмах. Поскольку домашние собаки появляются в качестве модели для изучения биологии β-дефензинов в коже, представленные здесь данные подчеркивают многие сходства CBD103 с его аналогом у человека, хотя наблюдаются некоторые различия в экспрессии.

Материалы и методы

Ткань

Собачья ткань была получена от принадлежащих клиенту собак, которые по причинам, не связанным с данным исследованием, были подвергнуты эвтаназии, обработаны для вскрытия и признаны неограниченными для использования в исследованиях.Это произошло в Школе ветеринарной медицины Дэвиса при Калифорнийском университете (UC), в больнице ветеринарной медицины им. Уильяма Р. Притчарда. Ткани (придаток яичка и кожа) помещали в RNAlater (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США) и встряхивали при комнатной температуре в течение ночи. Консервированные образцы хранили при –80 ° C до дальнейшей обработки. Дополнительную РНК из желудочно-кишечного тракта (язык, желудок, двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку, толстую и прямую кишку), кожи, легких, почек, поджелудочной железы и костного мозга получали из коммерческого источника (Zyagen, San Diego, Calif., СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).

Геномная ДНК собак

Образцы крови были взяты у пациентов ветеринарной больницы Калифорнийского университета в Дэвисе им. Уильяма Р. Притчарда. Со всеми животными обращались в строгом соответствии с надлежащей практикой в ​​отношении животных, как это определено соответствующими национальными и / или местными органами по защите животных, и вся работа с животными была одобрена протоколом № 15356, утвержденным Комитетом по уходу и использованию институциональных животных. Геномную ДНК выделяли с помощью набора QiaAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Inc.).

ПЦР собачьих дефенсинов

Выделение РНК и синтез кДНК выполняли, как описано ранее [25,26]. Качественная ПЦР использовалась в качестве широкого инструмента скрининга для определения паттернов экспрессии дефенсинов, кодируемых геномом собаки. Праймеры для ПЦР были сконструированы с использованием программного обеспечения MacVector (MacVector Inc., Кэри, Северная Каролина, США) для специфической амплификации последовательностей собачьего дефенсина, депонированных в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) [14], и домашнего транскрипта собачьего рибосомного белка S5 ( RPS5) (онлайн-доп.Таблица 1; для всех онлайн-дополнений. материал см. www.karger.com?doi=10.1159/000334566) [27]. FastStart Taq (Roche Applied Sciences, Индианаполис, Индиана, США) использовали для амплификации кДНК, представляющей 100 нг общей РНК, со следующими параметрами: 94 ° C в течение 5 минут, 35 циклов при 94 ° C в течение 30 с, 55 ° C. в течение 30 с, 72 ° C в течение 1 мин и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 7 мин. Придатки яичка и яички использовали в качестве положительного контроля для экспрессии дефенсина, поскольку было показано, что эти ткани экспрессируют большую часть дефенсинов у других видов [14].В нестандартных контрольных образцах раствор ДНК заменяли водой. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в агарозном геле (1,5% мас. / Об.) И детектировали с помощью окрашивания бромидом этидия. Положительные продукты ПЦР для каждого транскрипта дефенсина вырезали из агарозного геля, очищали с помощью набора для очистки QIAquick PCR (Qiagen) и напрямую секвенировали, чтобы гарантировать идентификацию амплифицированной кДНК. Количественная ОТ-ПЦР (qRT-PCR) была проведена на кДНК из ткани из первоначального скрининга с использованием праймеров для CBD1 (2) s, CBD1 (118) a, CBD103 (12) s, CBD103 (117) a, CBD108 (23) s, CBD108 (126) a, RPS5 (54) s и RPS5 (235) a (онлайн-доп.таблица 1) [26].

Генетическая вариация

Для определения распространенности генетической вариации ΔG23 в CBD103 были разработаны праймеры для ПЦР (MacVector), фланкирующие геномную последовательность CBD103 , окружающую делецию из 3 пар оснований, с флуоресцентно меченным смысловым праймером 6FAM. (онлайн-приложение, таблица 1). Примерно 10 нг геномной ДНК от разных пород (доберман-пинчер (n = 15), немецкая овчарка (n = 15), золотистый ретривер (n = 13), лабрадор-ретривер (n = 16) и ротвейлер (n = 15)). ПЦР, амплифицированная с CBD103 (1662) s и CBD103 (1889) a (онлайн-приложение.таблица 1) с использованием следующих параметров: 94 ° C в течение 5 минут, 35 циклов 94 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 1 минуты и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 7 минут. Разведение 1:20 было выполнено с помощью GeneScan 400D Rox в формамиде Hi-Di (Life Technologies Corporation, Карлсбад, Калифорния, США). Образцы были обнаружены на генетическом анализаторе ABI 3100 (Life Technologies Corporation) с использованием программного обеспечения STRand, разработанного лабораторией ветеринарной генетики Калифорнийского университета в Дэвисе (http://www.vgl.ucdavis.edu/ informatics / strand.php) [28].

Для определения вариации GCN в CBD103 были разработаны праймеры для ПЦР, очищенные электрофорезом в полиакриламидном геле (MacVector) для амплификации областей CBD103 и эталонного гена, TATA-связывающего белка (TBP) , который считается диплоидным в геном [онлайн-доп. таблица 1: CBD103 CN (421) s, CBD103 CN (580) a, CTBP CN (17889) s и CTBP CN (17999) a]. Количественная ПЦР (кПЦР) была проведена с использованием FastStart Taq (Roche) с использованием 10 нг геномной ДНК от разных пород со следующими параметрами: 94 ° C в течение 5 минут, 35 циклов при 94 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд. , 72 ° C в течение 1 мин и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 7 мин.GCN был рассчитан с использованием метода, подробно описанного Linzmeier и Ganz [29].

Иммуногистохимия

Образцы кожи собак фиксировали формалином и заливали парафином. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм помещали на заряженные предметные стекла и дважды депарафинизировали в ксилоле в течение 3 мин. Затем слайды инкубировали в 100% этаноле дважды по 2 мин каждое и гасили эндогенные пероксидазы 0,1% перекисью водорода в метаноле в течение 5 мин. После регидратации в 95% этаноле в течение 2 мин, затем в 70% в течение 2 мин слайды помещали в увлажненную камеру при комнатной температуре.За этапом блокирования 0,02% козьей сывороткой в ​​фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 20 мин следовало применение первичных поликлональных антител, индуцированных против hBD3 [24] (Allele Biotech, Сан-Диего, Калифорния, США) в разведении 1: 500 в 0,02% козьей сыворотке в PBS. Срезы отрицательного контроля инкубировали с 0,02% козьей сыворотки в PBS при 4 ° C в течение ночи, а затем дважды промывали PBS в течение 10 мин. Биотинилированное вторичное антитело α-кролика (Vector Elite Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) применяли в течение 20 минут.После двух промывок PBS в течение 2 минут на предметные стекла наносили реагент ABC (Vector Elite Kit) и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. После трех промывок трис-буферным физиологическим раствором (TBS) 3 раза в течение 2 минут хромаген-3,3′-диаминобензидин (Vector Elite Kit) был добавлен к каждому слайду на 5 минут. Последнее контрастное окрашивание светло-зеленым (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 5 минут проводили после промывки TBS в течение 4 минут и промывки деионизированной водой в течение 4 минут. После сушки предметных стекол покровные стекла закрывали с помощью Permount (ThermoFisher Scientific, Waltham, Mass., СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). Оценку ткани и запись изображения выполняли с использованием микроскопа Olympus DP72 (Olympus America Corporation, Center Valley, PA, USA).

Рекомбинантный пептид

кДНК, кодирующая предсказанный зрелый CBD103 (45 аминокислот), CBD103ΔG23 (44 аминокислоты), hBD3 (45 аминокислот) и hBD3ΔG23 (44 аминокислоты), была амплифицирована с помощью ПЦР (онлайн-таблица 1). Кодон, кодирующий остаток метионина, был встроен в смысловой праймер для ПЦР, непосредственно примыкающий к N-концевому кодону пептидов дефенсина, чтобы обеспечить сайт расщепления цианогенбромида, который позволит отщеплять зрелый пептид от оставшейся части экспрессированного гибридный белок.Каждый продукт ПЦР подвергали рестрикционной обработке с использованием Eco RI и Sal I и вставляли (в рамке) в вектор экспрессии pET32a (+) (Novagen, EMD Chemicals, Дармштадт, Германия), содержащий N-концевую His-метку. и тиоредоксин. Четыре (с подтвержденной последовательностью) экспрессионные конструкции были субклонированы в химически компетентные клетки BL-21 (DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), размноженные в лизогенном бульоне (LB), содержащем карбенициллин (50 мкг / мл) при 37 ° С. C встряхиванием в течение ночи и запасы глицерина замораживали при –80 ° C.Чтобы получить отдельные колонии для экспрессии, каждый исходный глицерин наносили штрихами на планшет LB, содержащий карбенициллин (50 мкг / мл), и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Отдельную колонию использовали для инокуляции заквасочной культуры (LB и карбенициллин 50 мкг / мл) и инкубировали при 37 ° C, встряхивая, в течение ночи. На следующее утро всю заквасочную культуру добавляли к 1 литру LB, содержащего карбенициллин (50 мкг / мл) и стерильный фосфатный буфер (36 мкм M K ₂ HPO ₄ ,8.5 м M KH ₂ PO ₄ ). Экспрессию пептидов индуцировали добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (конечная концентрация 0,5 мкМ M ) при OD ₆₀₀ , равном 0,5–0,6. Культуре позволяли индуцировать в течение 4–5 часов, после чего клетки BL21 осаждали при 5000 г в течение 15 минут. Гранулированные клетки BL21 лизировали 6,0 M гуанидин-HCl и 100 мкл M Tris pH 8,0, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали при 5000 g в течение 30 мин.Полученный осветленный супернатант инкубировали с гранулами Ni-NTA агарозы (Novogen, 5 мл / л индукции) в течение ночи при 4 ° C. Затем гранулы помещали в колонку, промывали 6 M гуанидин / 100 м M Tris (pH 8,0) и элюировали 6 M гуанидин / 100 m M Tris / 1 M имидазолом (pH 6.0). Элюент диализовали против 5% ледяной уксусной кислоты и лиофилизировали. Для химического отщепления His-метки и тиоредоксина от рекомбинантного пептида дефенсина лиофилизированный продукт восстанавливали в 80% муравьиной кислоте, продували газообразным аргоном и обрабатывали CNBr (20 мг / мл) в течение ночи при комнатной температуре.Нарезанный продукт реакции разбавляли в 10 раз Milli-Q H ₂ O, диализовали против 5% ледяной уксусной кислоты, лиофилизировали и восстанавливали в 0,05% ледяной уксусной кислоте. Затем расщепленные продукты реакции сначала очищали с использованием полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой C18 (RP-HPLC) с 15-50% градиентным буфером B (99,9% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты), контролируя оптическую плотность при 230 нм, фракции собираются каждую минуту при скорости потока 1 мл / мин.Примерно 10% каждой фракции добавляли к 3-кратному буферу для образца белка (5% уксусная кислота, 3 M мочевина, 0,01% метилового зеленого) и загружали в 12,5% -ный электрофорез в полиакриламидном геле с мочевиной (AU-PAGE) и проводили при 130 В на обратной полярности на 1,5 ч. Полученные гели окрашивали SimplyBlue (Invitrogen) и обесцвечивали водой. Фракции, которые, как оказалось, содержали отщепленный зрелый пептид на основе миграции геля, были объединены и подвергнуты дальнейшим циклам очистки RP-HPLC с более мелким градиентом буфера B (26–38% для CBD103, CBD103ΔG23, hBD3ΔG23 и 40–46% для hBD3. ), используя колонку C18 с меньшим отверстием.На последней стадии очистки каждый пептид собирали вручную после элюирования. Общий выход составлял приблизительно 1 мг пептида на 6 литров бактериальной культуры. Выделенные пептиды подвергали ОФ-ВЭЖХ на аналитической колонке C18 с градиентом ацетонитрила при скорости потока 1 мл / мин (онлайн-приложение, рис. 3). Очищенные пептиды также анализировали с помощью масс-спектроскопии MALDI-TOF (онлайн-приложение, рис. 4). Для дальнейшего анализа рекомбинантных пептидов с помощью AU-PAGE и вестерн-блоттинга каждый из пептидов восстанавливали с помощью 100 мкл M TCEP при 55 ° C в течение 25 мин.Приблизительно 1 мкг восстановленного пептида добавляли к 3 × буферу для образца белка, загружали в 12,5% AU-PAGE и проводили при 130 В в течение 1,5 часов. Полученный гель окрашивали SimplyBlue (Invitrogen) и обесцвечивали водой. Для вестерн-блоттинга 250 нг каждого восстановленного пептида добавляли к 3 × буферу для образца белка, загружали в 12,5% AU-PAGE и проводили при 130 В при обратной полярности в течение 1,5 часов. Пептиды переносили на PVDF-мембрану (Millipore, Billerica, MA, USA) в обратной полярности с током 2 мА / см ² в течение 20 мин.Блот фиксировали 0,05% глутаровым альдегидом и зондировали поликлональным антителом против hBD3 (Allele Biotech) в разведении 1: 3000 в TBS-Tween 20 и молоке (0,05%). После последующих промывок блот инкубировали с вторичными антителами козьего α-кролика (KPL, Гейтерсбург, Мэриленд, США), разведенными в TBS-Tween 20 и молоке (0,05%). Хемилюминесцентный сигнал детектировали с помощью системы визуализации Biospectrum AC (UVP, Upland, Калифорния, США).

Антимикробный анализ

Были приобретены клинические изоляты Staphylococcus pseudintermedius , чувствительные к метициллину и устойчивые к метициллину, а также бактерии, выделенные из кожи собак.Для подтверждения идентичности клинических изолятов бактериальную ДНК выделяли с помощью мини-набора QIAamp DNA Stool (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США), для чего использовали универсальные бактериальные праймеры [Bac16s (27) s и Bac16s (1391) a]. амплифицировать ген 16S рРНК, субклонировать в pBluescript и секвенировать. Радиально-диффузионный антимикробный анализ был использован для определения антибактериальной активности невосстановленных CBD103, CBD103ΔG23, hBD3 и hBD3ΔG23 при различных концентрациях (250, 83, 28, 9 и 3 мкг / мл) каждого пептида [26,30].

Образцы атопического дерматита

Собаки, включенные в исследование, были представлены для внутрикожного тестирования (IDT). Все собаки имели клинические признаки и анамнез, подтверждающий AD. Перед представлением для внутрикожного тестирования возможность зуда, связанного с аллергическим дерматитом на блох, была исключена с помощью строгого контроля над блохами с помощью соответствующего средства для взрослых и собак, и собаки все еще получали либо местное, либо пероральное средство для борьбы с блохами во время проведения биопсии кожи и IDT были выполнены.Кожная побочная реакция на пищу была исключена до обращения к IDT, что было подтверждено завершением испытания элиминационной диеты и последующим повторным тестированием. Все вторичные инфекции, вызванные бактериями или дрожжами, были эффективно вылечены. Собаки не получали ни антигистаминных препаратов, ни кортикостероидов перорально или местно в течение 4 недель до обращения к IDT. Некоторые получали циклоспорин для лечения зуда во время кожных пробы.

Для получения образцов кожи использовался 6-миллиметровый пробойник для биопсии.Пораженная кожа относится к биопсии, взятой из подмышечной впадины, области, которая обычно поражается у собак с БА. Образцы без поражения были взяты из межлопаточной области, области, которая обычно не затрагивается при БА. Образцы биопсии были сагитально разделены пополам, одна половина была зафиксирована формалином, а оставшаяся половина сохранена в RNAlater (Ambion) и обработана так же, как и другие образцы кожи, описанные выше. Все собаки были обследованы сертифицированным ветеринарным дерматологом (C.A.O.), и у некоторых собак не было выявлено никаких клинических повреждений, кроме легкой эритемы в подмышечной впадине.Гистологическое исследование всех биопсий кожи было выполнено сертифицированным ветеринарным дерматологом (V.K.A.), и никаких повреждений не было обнаружено. Все образцы были собраны в соответствии с рекомендациями Совета по обзору клинических испытаний Калифорнийского университета в Дэвисе и Институционального комитета по уходу за животными и их использованию с письменным согласием клиента.

Статистический анализ

Все статистические сравнения были выполнены с использованием парных двусторонних t-критериев Стьюдента в Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон, США).

Результаты

Экспрессия собачьего β-дефенсина

В попытке определить, является ли CBD103 единственным высоко экспрессируемым β-дефенсином в коже, мы приступили к наиболее полному на сегодняшний день скринингу на экспрессию собачьего β-дефенсина. Праймеры для ПЦР (онлайн-приложение, таблица 1) были разработаны для специфической амплификации каждого из 41 предполагаемого транскрипта гена β-дефенсина [14] из кожи, а также из 13 других тканей. Мужской придаток яичка экспрессировал почти каждый β-дефенсин, кодируемый геномом собаки, что удобно служило положительным контролем для всех, кроме одной реакции ПЦР (онлайн-приложение.инжир. 1). CBD121 был единственным собачьим β-дефенсином, не обнаруженным ни в одной ткани. Продукт ПЦР из каждой из других реакций ПЦР с β-дефенсином был непосредственно секвенирован для подтверждения его идентичности. CBD1 , CBD108 и CBD123 продемонстрировали обобщенный паттерн экспрессии, поскольку транскрипты мРНК были идентифицированы в большинстве проанализированных тканей (онлайн-приложение, рис. 1). Напротив, более конкретный паттерн экспрессии был отмечен для CBD103 , CBD109 , CBD112 , CBD119 , CBD122 , CBD139 и CBD140 .Единственными двумя генами β-дефенсина с легко обнаруживаемой экспрессией в коже были CBD1 и CBD103 .

Затем были разработаны

анализов qRT-PCR для трех наиболее высоко экспрессируемых транскриптов β-дефенсина собак ( CBD1 , CBD103 и CBD108) на основе этого начального качественного скрининга ПЦР. Используя эту технику, CBD1 также показал общий образец экспрессии с заметными уровнями в коже, языке и почках (рис.1а). CBD108 был экспрессирован на низких уровнях в любых протестированных тканях, с более высокими уровнями в почках и семенниках (онлайн-приложение, рис. 2A). Напротив, более тканеспецифичный паттерн экспрессии был обнаружен с CBD103 с экспрессией на высоких уровнях, обнаруженной в коже (8,2E + 03 копии / 10 нг общей РНК) и языке (1,5E + 04 копии / 10 нг всего РНК) (рис. 1б). RPS5 , используемый в качестве гена домашнего хозяйства [27], показал относительно постоянные и высокие уровни экспрессии во всех различных исследованных тканях (онлайн-приложение.инжир. 2Б). Эти данные показали, что CBD103 был наиболее экспрессируемым β-дефенсином в коже собак.

Рис. 1

Экспрессия β-дефенсинов собак. qRT-PCR анализ абсолютного числа копий транскриптов мРНК, кодирующих CBD1 ( a ) и CBD103 ( b ) в РНК, выделенной из различных тканей, включая кожу, желудочно-кишечный тракт (язык, желудок, двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку, толстую кишку, прямая кишка), легкие, почки, поджелудочная железа, костный мозг, яички и придатки яичка.Каждая полоса представляет собой среднее значение повторных анализов (стандартное отклонение <10%) для одного протестированного образца (n = 1). ND = Не обнаружено.

Чтобы расширить наш анализ экспрессии эпидермиса CBD103 , образцы кожи были взяты из брюшной и спинной части 6 собак разных пород и возрастов. РНК экстрагировали из каждого образца ткани, и экспрессию CBD103 и оценивали с помощью qRT-PCR (рис. 2a). Средний уровень экспрессии мРНК CBD103 был практически одинаковым при сравнении кожи с обоих спинных (среднее: 1.7E + 4 копии / 10 нг общей РНК) или вентральной поверхности (среднее: 1,3E + 4 копии / 10 нг общей РНК). Кроме того, мРНК CBD103 экспрессировалась до аналогичных уровней в коже у каждой из 6 различных исследованных собак (рис. 2а). Чтобы идентифицировать сайт экспрессии CBD103 в коже, мы использовали иммуногистохимию с использованием поликлональных антител, индуцированных против человеческого ортолога CBD103, hBD3. Положительное окрашивание было обнаружено в кератиноцитах эпидермиса, а также в фолликулярных эпителиальных клетках (рис. 2б).

Рис. 2

Эпидермальная мРНК и пептидная экспрессия CBD103. анализ qRT-PCR абсолютного числа копий транскриптов мРНК, кодирующих CBD103, в РНК, выделенной из каудодорсальной (дорсальной) и паховой (брюшной) кожи собак. Рассчитанное среднее значение для 6 собак, кожа спины и брюшины. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку. b Иммуноокрашивание CBD103 в коже собаки (2 ×) с использованием поликлональных антител (1: 500), индуцированных против hBD3. CBD103 локализуется в кератиноцитах и ​​фолликулярных эпителиальных клетках. Вставка сделана с разрешением 20 ×. c Отрицательный контроль для окрашивания только вторичным антителом (2 ×). Вставка сделана с разрешением 20 ×. Стрелки указывают на положительное окрашивание. Полоса размера при 2-кратном просмотре: 300 мкм и при 20-кратном просмотре: 30 мкм.

CBD103 Генетическая вариация

Общий вариант CBD103 , CBD103 Δ G23 , имеет делецию из 3 пар оснований, кодирующую аминоконцевой глицин зрелого пептида. Этот вариант ранее был идентифицирован как аллель, ответственный за доминирующую черную окраску шерсти у собак [8].Анализ генотипирования на основе ПЦР был разработан для оценки присутствия этой вариантной последовательности у различных пород собак. Флуоресцентно меченые продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в капиллярном геле, и аллели выделяли в зависимости от размера продукта. Из 5 оцененных пород ротвейлеры, доберман-пинчеры и немецкие овчарки не обладали вариантным аллелем; был обнаружен только аллель CBD103 дикого типа (рис. 3а). Интересно, что вариантный аллель был обнаружен у всех голден ретриверов (54% WT / ΔG23; 46% ΔG23 / ΔG23) и лабрадоров (75% WT / ΔG23; 25% ΔG23 / ΔG23).

Рис. 3

Распространенность общего варианта CBD103 и вариация числа копий гена. a Круговые диаграммы представляют особей данной породы, разделенных на генотипы собак: CBD103 / CBD103 (синий), CBD103 / CBD103 Δ G23 (желтый) и CBD103 Δ G23 / CBD Δ103 G23 (красный) . Доберманы (n = 15), немецкие овчарки (n = 15) и ротвейлеры (n = 15), по-видимому, не имеют аллеля CBD103 Δ G23 , тогда как золотистые ретриверы (n = 13) и лабрадоры ( n = 16) обладают аллелем CBD103 Δ G23 как гетерозиготный или гомозиготный вариант. b График вариации числа копий гена CBD103 с цветами, указывающими генотип CBD103 . Доберманы-пинчеры, немецкие овчарки и ротвейлеры кодируют 2 копии CBD103 на диплоидный геном, тогда как у золотистых ретриверов и лабрадоров есть вариации в общем количестве копий гена CBD103 .

Помимо аллеля CBD103 Δ G23 , другой формой генетической вариации, идентифицированной в локусе β-дефенсина на хромосоме 16, был полиморфизм числа копий гена [19].Ген CBD103 расположен в кластере β-дефенсинов, который является синтеничным с кластером ортологов на хромосоме 8 человека, многие из которых считаются ортологами между двумя видами [14]. У людей этот кластер проявляет полиморфизм числа копий гена, и данный индивидуум может кодировать от 1 до 12 копий этого кластера на диплоидный геном [20,29]. Чтобы исследовать подобный полиморфизм числа копий гена у собак, мы разработали анализ кПЦР со специфическими праймерами для гена CBD103 и диплоидного эталонного гена TBP .Доберман-пинчеры, немецкие овчарки и ротвейлеры, по-видимому, не проявляли полиморфизма числа копий гена CBD103 , поскольку у каждого испытуемого было общее число копий гена CBD103 , равное примерно двум на диплоидный геном (рис. 3b). Напротив, у золотистых ретриверов и лабрадоров обнаружен полиморфизм числа копий гена с числом копий гена CBD103 , составляющим 2–4 копии на диплоидный геном (рис. 3b).

Антимикробная активность

Для исследования возможной дифференциальной антимикробной активности CBD103 дикого типа и его варианта ΔG23 были экспрессированы рекомбинантные пептиды (рис.4а), очищенные с помощью ОФ-ВЭЖХ (онлайн-приложение, рис. 3) и проанализированные с помощью масс-спектрометрии (онлайн-приложение, рис. 4). Для сравнения, hBD3 и соответствующий вариант, hBD3ΔG23, экспрессировали, очищали и анализировали аналогичным образом (онлайн-приложение, рис. 3, 4). Очищенные пептиды подвергали AU-PAGE в восстанавливающих условиях и анализировали для оценки иммунореактивности (фиг. 4b, c). Вестерн-блоттинг рекомбинантных пептидов показал, что hBD3 и hBD3ΔG23 одинаково распознаются поликлональным антителом α-hBD3, тогда как пептид CBD103ΔG23 распознается по-разному по сравнению с CBD103 (рис.4в). Результат подтверждает, что N-концевые остатки CBD103 доступны для белок-белковых взаимодействий, что согласуется с его предполагаемой ролью в цвете шерсти [8].

Рис. 4

Сравнение пептидных последовательностей CBD103 и hBD3 и рекомбинантная экспрессия. a Предсказанные зрелые пептидные последовательности для CBD103 и CBD103ΔG23, а также hBD3 и hBD3ΔG23. Звездочками обозначены аминокислотные различия, все из которых консервативны, за исключением S37G и T58R. b AU-PAGE TCEP восстановил рекомбинантные CBD103, CBD103ΔG23, hBD3 и hBD3ΔG23, демонстрируя гомогенность пептида по окрашиванию SimplyBlue. c Вестерн-блоттинг TCEP восстановил рекомбинантные CBD103, CBD103ΔG23, hBD3 и hBD3ΔG23 с использованием поликлонального антитела (1: 3000), индуцированного против hBD3.

Антибактериальная активность рекомбинантных дефенсинов была протестирована с использованием анализа радиальной диффузии как с грамположительными, так и с грамотрицательными бактериями. Клинические изоляты S. pseudintermedius , распространенного патогена кожи собак, особенно собачьих пациентов с БА, были закуплены для антимикробного тестирования. В дополнение к этим клиническим изолятам культивировали эндогенные бактерии из кожи собак для сравнения с S.Псевдоним . И CBD103, и CBD103Δ23 проявляли относительно одинаковую активность против метициллин-чувствительного и метициллин-устойчивого S. pseudintermedius (фиг. 5a, b). Точно так же hBD3 и hBD3ΔG23 были одинаково противомикробными против S. pseudintermedius . Оба набора пептидов собак и человека проявляли сильную антимикробную активность против эндогенных бактерий, обнаруженных на коже собак ( Bacillus licheniformis , Micrococcus sp. И Bacillus cereus) , а также лабораторный штамм Escherichia coli D31 (таблица 1).

Таблица 1

Рис. 5

Антибактериальная активность рекомбинантного CBD103. Определение антибактериальной активности CBD103, CBD103ΔG23, hBD3 и hBD3ΔG23 с использованием антибактериального анализа радиальной диффузии с клиническими изолятами метициллин-чувствительного ( a ) и метициллин-устойчивого ( b ) S. pseudintermedius. Графическое изображение антибактериального клиринга CBD103, CBD103ΔG23, hBD3 и hBD3ΔG23 [30].

Связь с атопическим дерматитом

У людей с БА уровни мРНК hBD3 и мобилизация пептидов нарушены [9,10,23].Поэтому мы предположили, что собачьи пациенты с БА также могут иметь пониженную экспрессию дефенсина, что предрасполагает их к вторичной инфекции. Чтобы проверить эту гипотезу, были взяты образцы кожи для пункционной биопсии как с пораженной (подмышечной), так и с неповрежденной (межлопаточной) кожи пациентов с диагнозом AD. Мы не обнаружили статистически значимой разницы в экспрессии мРНК CBD103 между пораженной (среднее: 1,1E + 04 копий / 10 нг общей РНК) и не поврежденной (среднее: 9.4E + 03 копии / 10 нг общей РНК) кожи (p = 0,42, рис. 6). Интересно, что S100A8, воспалительный белок, который, как известно, активируется в коже собак с атопией [31], проявлял в 6 раз более высокую экспрессию мРНК в очаге поражения (в среднем: 2,5E + 06 копий / 10 нг общей РНК) по сравнению с неповрежденным ( среднее: 4,4E + 05 копий / 10 нг общей РНК) кожи. В качестве контроля в этих экспериментах ген домашнего хозяйства, RPS5, экспрессировался на равных уровнях между двумя участками кожи (рис. 6).

Рис. 6

Экспрессия CBD103 при AD.Количественный анализ с помощью ОТ-ПЦР абсолютного числа копий транскриптов мРНК, кодирующих RPS5, CBD103 и S100A8, в РНК, выделенной из биоптатов пораженных и не пораженных участков кожи собак (n = 18) с диагнозом AD. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку.

Обсуждение

β-дефенсины являются ключевыми эффекторными молекулами врожденного иммунитета, экспрессируемыми на многих поверхностях тела, включая кожу. Исследования β-дефенсинов в коже почти полностью сосредоточены на пептидах человека [32], включая исследования экспрессии [17,18], регуляции [33,34,35] и связи с кожной инфекцией [12,13,36] и др. заболевания, такие как псориаз и БА [10,11].Сообщалось о нескольких исследованиях β-дефензинов кожи на животных моделях, за исключением модели на собаках [8,15,16,24,37,38]. Настоящее исследование направлено на расширение наших знаний о собачьих β-дефенсинах путем количественной оценки экспрессии CBD103 в здоровой коже, определения генетической изменчивости CBD103 среди и внутри разных пород, характеристики антибактериальной активности CBD103 и CBD103ΔG23 и оценки экспрессии CBD103. из кожных покровов с повреждениями и без повреждений у собак с AD.

Из всех β-дефенсинов собак CBD103 экспрессируется в коже до самых высоких уровней. В соответствии с данными, представленными здесь, ранее сообщалось о локальной экспрессии CBD103 в кератиноцитах и ​​фолликулярных эпителиальных клетках [24]. Чтобы определить возможные вариации в экспрессии CBD103 в коже собак, мы получили образцы кожи спины и брюшины у собак, не страдающих кожными заболеваниями. CBD103 Экспрессия мРНК была примерно одинаковой между сайтами экспрессии как внутри одной собаки, так и между другими тестируемыми собаками.Эти количественные данные подтверждают выводы исследования Wingate et al [15], где качественная ПЦР продемонстрировала продукты ПЦР схожей интенсивности с помощью гель-электрофореза. Ортолог CBD103 человека, hBD3, проявляет конститутивную экспрессию на низком уровне; однако в присутствии воспалительных стимулов, таких как инактивированные нагреванием бактерии и TNF-α, клетки кератиноцитов человека отвечали 20-30-кратным увеличением экспрессии hBD3 [18]. В отличие от низкого исходного уровня экспрессии у людей, конститутивная экспрессия мРНК CBD103 в коже собак значительно выше.В моделях культуры клеток кератиноцитов собак мы не смогли индуцировать CBD103 сверх конститутивных уровней с помощью различных бактериальных или провоспалительных стимулов, включая IL-1β, гемолитический стрептококк и S. pseudintermedius (неопубликованные результаты). Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить, отклоняются ли уровни экспрессии CBD103 при каких-либо обстоятельствах от основополагающих уровней, о которых мы сообщаем здесь.

Собака представляет собой интересный вид для изучения генетической изменчивости β-дефенсина, поскольку существует два общих полиморфизма: делеция из 3 пар оснований в CBD103, и полиморфизм числа копий гена.Мы обнаружили, что последовательность вариантов CBD103 Δ G23 часто встречается у золотистых ретриверов и лабрадоров, в соответствии с другим исследованием, в котором также сообщалось об этом варианте у немецких дог, басенджи и пуделей [8]. В то время как CBD103 Δ G23 отвечает за доминирующий черный окрас шерсти у некоторых пород, цвет шерсти у золотистых ретриверов и желтых лабрадоров не зависит от их генотипа CBD103 из-за генетических мутаций в Mc1r [39] .Второй аспект генетической гетерогенности — это полиморфизм числа копий гена, который обеспечивает генетическую пластичность и наблюдается как у собак, так и у человеческих β-дефенсинов. И у золотистых ретриверов, и у лабрадоров было количество копий гена CBD103 , которое варьировалось примерно от 2 до 4 копий на диплоидный геном. Два исследования с использованием образцов биопсии человека и клеточной культуры продемонстрировали прямую корреляцию между экспрессией мРНК β-дефенсина и количеством копий гена [40,41]. В настоящее время неизвестно, приводит ли увеличенное число копий гена у собаки аналогичным образом к увеличению экспрессии β-дефенсина.

Одной из целей этого исследования было охарактеризовать антимикробную активность CBD103 и варианта CBD103ΔG23. Учитывая высокую частоту аллеля CBD103 Δ G23 у некоторых пород собак, мы задались вопросом, следует ли учитывать измененную антимикробную активность вариантного пептида при разработке моделей, объясняющих любопытно высокую частоту этого полиморфизма. Для проверки антибактериальной активности были получены клинические изоляты метициллин-чувствительного и метициллин-устойчивого S.pseudintermedius , частый возбудитель кожи собак. Кроме того, мы культивировали и изолировали эндогенную микрофлору кожи здоровой собаки, в том числе: B. licheniformis , Micrococcus sp. и B. cereus . Интересно, что CBD103 и CBD103ΔG23 показали одинаковую антибактериальную активность in vitro против всех протестированных бактерий. Это наблюдение особенно важно из-за преобладания генотипа CBD103 Δ G23 у некоторых наиболее распространенных пород собак, включая лабрадор ретриверов и золотистых ретриверов.CBD103 и CBD103ΔG23 также проявляли одинаково сильную антибактериальную активность по сравнению с hBD3 и соответствующим вариантом hBD3ΔG23. Сходная активность CBD103 и CBD103ΔG23 позволяет предположить, что антимикробная функция не может быть важным фактором для объяснения изменений частоты аллелей в популяциях собак.

Как у человека, так и у собак, пациенты часто осложняются рецидивирующими вторичными бактериальными инфекциями, S. aureus у людей [9,42] и S. pseudintermedius у собак [43].Предыдущие исследования продемонстрировали снижение убивающей способности эпидермиса у людей с БА из-за снижения экспрессии hBD3 [9,10,22] и мобилизации на поверхность кожи [23]. Интересно, что мы не обнаружили разницы в уровнях транскрипта мРНК CBD103 между образцами с поражением и без него. Наши данные согласуются с данными другого исследования, в котором сообщается об одинаковой экспрессии мРНК CBD103 и в пораженной и не поврежденной коже при БА [24]. Однако мы не заметили каких-либо различий в экспрессии мРНК CBD103 между здоровыми собаками и собаками с БА, в отличие от того, о чем сообщалось ранее [24].Генетические различия с точки зрения вариации аллеля CBD103ΔG23 и / или количества копий гена могут потенциально способствовать смещению отбора в отношении патогенов окружающей среды и / или ассоциаций болезней, особенно в тех породах, где наблюдаются обе вариации. Однако мы обнаружили, что CBD103 и CBD103ΔG23 являются мощными антибактериальными пептидами с практически эквивалентной антибактериальной активностью, особенно против распространенных патогенов кожи собак. Таким образом, наши данные показывают, что измененная экспрессия CBD103 в атопической коже не является причиной повторных вторичных бактериальных инфекций.

В целом, экспрессия в коже, высокая антимикробная активность и полиморфизм числа копий гена являются свойствами, общими для CBD103 и его человеческого ортолога. С другой стороны, очевидная конститутивная экспрессия в здоровой коже и AD отличает собачий β-дефенсин от его человеческого аналога. Результаты этого исследования помогут сформировать дальнейшее развитие домашней собаки как ценной модели биологии β-дефенсина в коже.

Благодарности

Мы благодарим доктора В.Дениз М. Имаи за ее помощь в визуализации иммуногистохимического обнаружения CBD103 и доктору Николь Экхольм, доктору Кейси Степник, Монике Краточвил, Джуди Шеттлер и Нине Тобе за помощь в получении клинических образцов. Мы также благодарим Hiutung Chu за критическое прочтение рукописи. Исследование было частично поддержано грантами Центра ветеринарной медицины Калифорнийского университета в Дэвисе, Центра здоровья домашних животных и Национального института здравоохранения (AI32738, AI50843 и AI76246). B.C.L. получил поддержку от NIH T32AI60555 и T32RR021312, а также Школы ветеринарной медицины Калифорнийского университета в Дэвисе, программы подготовки ветеринарных ученых.

Список литературы

1. Шредер Дж. М., Хардер Дж.: Противомикробные кожные пептиды и белки. Cell Mol Life Sci 2006; 63: 469–486.

2. Бернард Дж. Дж., Галло Р. Л.: Защита границ: контрольная роль защитных пептидов хозяина в коже.Cell Mol Life Sci 2011; 68: 2189–2199.

3. Ганц Т: Дефенсины: антимикробные пептиды врожденного иммунитета. Нат Рев Иммунол 2003; 3: 710–720.

4. Ганц Т: Дефенсины: антимикробные пептиды позвоночных.C R Biol 2004; 327: 539–549.

5. Лерер Р.И.: Дефенсины приматов. Nat Rev Microbiol 2004; 2: 727–738.

6. Варога Д., Пуфе Т., Хардер Дж., Шредер Дж. М., Ментлейн Р., Мейер-Хофферт Ю., Голдринг М.Б., Тиллманн Б., Хассенпфлюг Дж., Паульсен Ф .: Человеческий бета-дефенсин 3 опосредует процессы ремоделирования тканей в суставном хряще за счет увеличения уровней металлопротеиназ и снижение уровня их эндогенных ингибиторов.Arthritis Rheum 2005; 52: 1736–1745.

7. Bowdish DM, Davidson DJ, Hancock RE: Иммуномодулирующие свойства дефензинов и кателицидинов. Curr Top Microbiol Immunol 2006; 306: 27–66.

8. Candille SI, Kaelin CB, Cattanach BM, Yu B, Thompson DA, Nix MA, Kerns JA, Schmutz SM, Millhauser GL, Barsh GS: мутация β-дефенсина вызывает черный цвет шерсти у домашних собак.Наука 2007; 318: 1418–1423.

9. Онг П.Й., Отаке Т., Брандт С., Стрикленд I, Богуневич М., Ганц Т., Галло Р.Л., Леунг Д.Ю.: Эндогенные антимикробные пептиды и кожные инфекции при атопическом дерматите. N Engl J Med 2002; 347: 1151–1160.

10. Howell MD, Boguniewicz M, Pastore S, Novak N, Bieber T., Girolomoni G, Leung DY: Механизм дефицита hBD-3 при атопическом дерматите.Clin Immunol 2006; 121: 332–338.

11. Hollox EJ, Huffmeier U, Zeeuwen PL, Palla R, Lascorz J, Rodijk-Olthuis D, van de Kerkhof PC, Traupe H, de Jongh G, den Heijer M, Reis A, Armor JA, Schalkwijk J: Псориаз связан с повышенной Число геномных копий бета-дефенсина. Нат Генет 2008; 40: 23–25.
12. Meyer-Hoffert U, Schwarz T., Schroder JM, Glaser R: Экспрессия человеческого бета-дефензина-2 и -3 в verrucae vulgares и condylomata acuminata. J Eur Acad Dermatol Venereol 2008; 22: 1050–1054.

13. Meyer-Hoffert U, Schwarz T., Schroder JM, Glaser R: Повышенная экспрессия человеческого бета-дефенсина 3 в контагиозном моллюске.Clin Exp Dermatol 2010; 35: 190–192.

14. Патил А.А., Цай Й., Санг Й., Блеча Ф., Чжан Г.: Межвидовой анализ семейства генов β-дефенсина млекопитающих: наличие кластеров синтенных генов и преимущественная экспрессия в мужском репродуктивном тракте. Physiol Genomics 2005; 23: 5–17.

15. Wingate KV, Torres SM, Silverstein KA, Hendrickson JA, Rutherford MS: Экспрессия эндогенных антимикробных пептидов в нормальной коже собак.Vet Dermatol 2009; 20: 19–26.

16. Эрлес К., Браунли Дж.: Экспрессия бета-дефенсинов в дыхательных путях собак и антимикробная активность против bordetella bronchiseptica. Вет Иммунол Иммунопатол 2010; 135: 12–19.

17. Хардер Дж., Бартельс Дж., Кристоферс Е, Шредер Дж. М.: пептидный антибиотик из кожи человека.Природа 1997; 387: 861.

18. Хардер Дж., Бартельс Дж., Кристоферс Е., Шредер Дж. М.: Выделение и характеристика человеческого бета-дефенсина-3, нового человеческого индуцибельного пептидного антибиотика. J Biol Chem 2001; 276: 5707–5713.

19. Chen WK, Swartz JD, Rush LJ, Alvarez CE: Картирование структурных вариаций ДНК у собак.Genome Res 2009; 19: 500–509.

20. Hardwick RJ, Machado LR, Zuccherato LW, Antolinos S, Xue Y, Shawa N, Gilman RH, Cabrera L, Berg DE, Tyler-Smith C, Kelly P, Tarazona-Santos E, Hollox EJ: всемирный анализ бета-дефенсина Вариация числа копий предполагает недавний отбор высокоэкспрессируемой копии гена DEFB103 в Восточной Азии.Hum Mutat 2011; 32: 743–750.

21. Марселла Р., Джироломони Г.: Собачьи модели атопического дерматита: полезный инструмент с неиспользованным потенциалом. Дж. Инвест Дерматол 2009; 129: 2351–2357.

22. Nomura I, Goleva E, Howell MD, Hamid QA, Ong PY, Hall CF, Darst MA, Gao B, Boguniewicz M, Travers JB, Leung DY: Цитокиновая среда атопического дерматита, по сравнению с псориазом, кожа предотвращает индукцию врожденного иммунитета. гены ответа.J Immunol 2003; 171: 3262–3269.

23. Kisich KO, Carspecken CW, Fieve S, Boguniewicz M, Leung DY: Неэффективное уничтожение Staphylococcus aureus при атопическом дерматите связано со сниженной мобилизацией бета-дефенсина-3 человека. J Allergy Clin Immunol 2008; 122: 62–68.
24. van Damme CM, Willemse T, van Dijk A, Haagsman HP, Veldhuizen EJ: Измененная кожная экспрессия бета-дефензинов у собак с атопическим дерматитом. Мол Иммунол 2009; 46: 2449–2455.

25. Wehkamp J, Chu H, Shen B, Feathers RW, Kays RJ, Lee SK, Bevins CL: Антимикробные пептиды клеток Панета: топографическое распределение и количественная оценка в тканях желудочно-кишечного тракта человека.Письма FEBS 2006; 580: 5344–5350.

26. Леонард BC, Chu H, Johns JL, Gallo RL, Moore PF, Marks SL, Bevins CL: Экспрессия и активность нового кателицидина от домашних кошек. PLoS One 2011; 6: e18756.

27. Бринкхоф Б., Спи Б., Ротуйзен Дж., Пеннинг Л.С.: Разработка и оценка эталонных генов собак для точной количественной оценки экспрессии генов.Анальная биохимия 2006; 356: 36–43.

28. Toonen RJ, Hughes S: Повышенная производительность анализа фрагментов на автоматическом секвенаторе ABI prism 377 с использованием мембранной гребенки и программного обеспечения STRand. Биотехники 2001; 31: 1320–1324.

29. Linzmeier RM, Ganz T: Полиморфизм числа копий гена дефенсина человека: всесторонний анализ независимых вариаций в областях альфа- и бета-дефенсина в 8p22-p23.Геномика 2005; 86: 423–430.

30. Лерер Р.И., Розенман М., Харвиг С.С., Джексон Р., Эйзенхауэр П.: Сверхчувствительные анализы эндогенных антимикробных полипептидов. J. Immunol. Методы 1991; 137: 167–173.

31. Merryman-Simpson AE, Wood SH, Fretwell N, Jones PG, McLaren WM, McEwan NA, Clements DN, Carter SD, Ollier WE, Nuttall T: Экспрессия гена (мРНК) при атопическом дерматите собак: анализ микроматриц.Ветеринарный дерматол 2008; 19: 59–66.

32. Хардер Дж., Шредер Дж. М.: Противомикробные пептиды в коже человека. Chem Immunol Allergy 2005; 86: 22–41.

33. Harder J, Meyer-Hoffert U, Wehkamp K, Schwichtenberg L, Schroder JM: Дифференциальная индукция генов бета-дефенсинов человека (hBD-1, -2, -3 и -4) в кератиноцитах ингибируется ретиноевой кислотой.Дж. Инвест Дерматол 2004; 123: 522–529.

34. Соренсен OE, Cowland JB, Theilgaard-Monch K, Liu L, Ganz T., Borregaard N: заживление ран и экспрессия антимикробных пептидов / полипептидов в кератиноцитах человека, как следствие общих факторов роста. J Immunol 2003; 170: 5583–5589.
35. Соренсен О.Е., Тапа Д.Р., Розенталь А., Лю Л., Робертс А.А., Ганц Т.: Дифференциальная регуляция экспрессии бета-дефенсина в коже человека с помощью микробных стимулов. J Immunol 2005; 174: 4870–4879.

36. Kisich KO, Howell MD, Boguniewicz M, Heizer HR, Watson NU, Leung DY: Конститутивная способность кератиноцитов человека убивать Staphylococcus aureus зависит от бета-дефенсина 3.Дж. Инвест Дерматол 2007; 127: 2368–2380.

37. Fazakerley J, Crossley J, McEwan N, Carter S, Nuttall T: Противомикробная эффективность бета-дефенсина 3 in vitro против изолятов Staphylococcus pseudintermedius из здоровой и атопической кожи собак. Ветеринарный дерматол 2010; 21: 463–468.
38. Санторо Д., Буник Д., Грейвс Т.К., Кэмпбелл К.Л.: Экспрессия и распределение антимикробных пептидов в коже здоровых гончих. Vet Dermatol 2011; 22: 61–67.

39. Everts RE, Rothuizen J, van Oost BA: Идентификация преждевременного стоп-кодона в гене рецептора меланоцит-стимулирующего гормона (Mc1r) у лабрадоров и золотистых ретриверов с желтым окрасом шерсти.Аним Генет 2000; 31: 194–199.

40. Fellermann K, Stange DE, Schaeffeler E, Schmalzl H, Wehkamp J, Bevins CL, Reinisch W., Teml A, Schwab M, Lichter P, Radlwimmer B, Stange EF: полиморфизм кластера генов хромосомы 8 с низким содержанием гена бета-дефенсина 2 человека число копий предрасполагает к болезни Крона толстой кишки.Am J Hum Genet 2006; 79: 439–448.

41. Groth M, Wiegand C, Szafranski K, Huse K, Kramer M, Rosenstiel P, Schreiber S, Norgauer J, Platzer M: как количество копий, так и вариации последовательности влияют на экспрессию человеческого DEFB4. Гены Иммун 2010; 11: 458–466.

42. Boguniewicz M, Leung DY: Атопический дерматит: заболевание измененного кожного барьера и иммунной дисрегуляции.Immunol Rev 2011; 242: 233–246.

43. DeBoer DJ, Marsella R: Целевая группа ACVD по атопическому дерматиту собак (XII): взаимосвязь кожных инфекций с патогенезом и клиническим течением атопического дерматита собак. Вет Иммунол Иммунопатол 2001; 81: 239–249.

---

Автор Контакты

Проф.Чарльз Л. Бевинс

Медицинский факультет Калифорнийского университета Дэвис

3146 Таппер Холл — MMI

Дэвис, Калифорния 95616-8645 (США)

Тел. +1 530 754 6889, электронная почта [email protected]

---

Подробности статьи / публикации

Предварительный просмотр первой страницы

Получено: 1 сентября 2011 г.
Принято: 19 октября 2011 г.
Опубликовано в Интернете: 19 января 2012 г.
Дата выпуска: апрель 2012 г.

Количество страниц для печати: 12
Количество рисунков: 6
Количество столов: 1

ISSN: 1662-811X (печатный)
eISSN: 1662-8128 (онлайн)

Для дополнительной информации: https: // www.karger.com/JIN

---

Авторские права / Дозировка препарата / Заявление об ограничении ответственности

Авторские права: Все права защищены. Никакая часть данной публикации не может быть переведена на другие языки, воспроизведена или использована в любой форме и любыми средствами, электронными или механическими, включая фотокопирование, запись, микрокопирование или с помощью какой-либо системы хранения и поиска информации, без письменного разрешения издателя. .
Дозировка лекарства: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор и дозировка лекарства, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Тем не менее, ввиду продолжающихся исследований, изменений в правительственных постановлениях и постоянного потока информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на них, читателю настоятельно рекомендуется проверять листок-вкладыш для каждого препарата на предмет любых изменений показаний и дозировки, а также дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендованным агентом является новое и / или редко применяемое лекарство.
Отказ от ответственности: утверждения, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и соавторам, а не издателям и редакторам.Появление в публикации рекламы и / или ссылок на продукты не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор (-ы) не несут ответственности за любой ущерб, причиненный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в контенте или рекламе.

Рецептор CLAVATA FASCIATED EAR2 отвечает на различные пептиды CLE, передавая сигнал через два последующих эффектора

[Примечание редакции: ответы автора на первый раунд рецензирования приводятся ниже.]

Все рецензенты согласны с тем, что ваша рукопись представляет собой интересный рассказ. Концепция, возникающая в результате вашей работы, потенциально интересна и важна, однако, по мнению рецензентов и редакторов, она еще не подтверждена данными. Чтобы подчеркнуть сильную сторону, которую вы здесь проецируете, потребуется ряд дополнительных решающих экспериментов. Это включает, например, анализ паттернов экспрессии, анализ двойных мутантов, независимые проверки белок-белкового взаимодействия или более реалистичные физиологические условия, такие как более низкие концентрации пептидов.Если вы решите существенно улучшить рукопись в этом направлении и всесторонне рассмотреть отдельные комментарии рецензентов, вставленные ниже, мы, тем не менее, готовы еще раз взглянуть на повторно отправленную рукопись.

Мы ценим конструктивную критику и предложения трех экспертов-рецензентов. Мы добавили новые данные, чтобы ответить на все комментарии, включая анализ экспрессии ZmCRN, fea3; анализ двойных мутантов Zmcrn , независимую проверку взаимодействия белок-белок и лечение различными концентрациями пептидов, чтобы решить проблемы.Эти новые данные дополнительно подтверждают наш основной вывод, и рукопись была соответствующим образом переработана.

Рецензент № 1:

[…] Введение.

1) Во введении должно быть оговорено, что функция WUS еще не продемонстрирована у кукурузы, и что гомолог CLV1 не имеет продемонстрированной функции в SAM кукурузы. В рукописи говорится: «У кукурузы THICK TASSEL DWARF1 (TD1) и FEA2 являются ортологами CLV1 и CLV2 и действуют аналогичным образом, ограничивая пролиферацию SAM» — это неверно — мутации TD1 влияют на меристемы побегов соцветий, но нет доказательств того, что TD1 ограничивает вегетативный размер САМ.

Как было предложено, мы добавили текст, поясняющий, что WUS не был функционально охарактеризован для кукурузы, а также добавили информацию о функции WUS для риса:

«Два ортолога WUS кукурузы, ZmWUS1 и ZmWUS2, были предсказаны филогенетическим анализом, и репортер ZmWUS1 экспрессируется в предполагаемом организационном центре меристемы побега соцветия (Je et al., 2016), но эти гены не были обнаружены. функционально охарактеризован (Nardmann and Werr 2006).[…] Гомолог WUS риса, TILLERS ABSENT1 / MONOCULM3 , функционирует в формировании меристемы подмышечных побегов (Tanaka et al., 2015; Lu et al., 2015), а функция WUS в апикальных меристемах побегов, по-видимому, была взята на себя. геном WUSCHEL RELATED HOMEOBOX4 (WOX4) (Ohmori et al., 2013) »

Что касается того, влияют ли эти мутации на SAM или меристемы побегов соцветия, это семантический вопрос, поскольку меристема соцветия также является «SAM», так как это меристема побега на вершине соцветия.В целом фасциированные мутации кукурузы действительно увеличивают вегетативный SAM, но гораздо менее драматично. Однако, чтобы уточнить, мы изменили «SAM» на «меристему побега соцветия» во Введении («… и действуют аналогично для ограничения разрастания меристемы побега соцветия…»).

Результаты.

2) Почему нет демонстрации ZmCRN РНК или накопления белка в меристемах побегов кукурузы?

В пересмотренной рукописи мы теперь демонстрируем экспрессию ZmCRN путем гибридизации in situ в меристемах побегов кукурузы. ZmCRN экспрессируется по всей SAM и более сильно в периферическом домене и зачатках листа (рис. 2E). Этот профиль подтверждается данными RNAseq микродиссекции с помощью лазерного захвата для различных доменов SAM (данные из лаборатории Timmermans, доступны из MaizeGDB; https://maizegdb.org/). Эти новые данные добавлены как рисунок 2E и рисунок 2 — дополнение к рисунку 4 и новый текст:

– ZmCRN экспрессировался по всей SAM и более сильно в периферическом домене и зачатках листа (фигура 2E, подтвержденная с помощью микродиссекции лазерного захвата RNAseq, фигура 2 — приложение к рисунку 4).”

3) Выявлена ​​и охарактеризована новая мутация кукурузы в ZmCRN. Генетические данные ясно демонстрируют, что FEA2 / CLV2 эпистатичен как для ZmCRN, так и для CT2, и что ZmCRN и CT2 действуют разными путями.

Спасибо за положительный комментарий!

4) Хотя ранее было показано, что слияние CT2 YFP дополняет мутантный фенотип, никаких анализов функции слитого белка FEA2 или CRN не предусмотрено. Хотя данные, полученные из гетерологичной системы, ясны и показывают, что FEA2 / CLV2 может взаимодействовать как с CT2, так и с ZmCRN — в то время как CT2 и ZmCRN не образуют комплекс в табаке — мне интересно, почему эти гибридные белки не были введены в кукурузу? Это не всегда тривиально из-за сложных проблем с промоутерами, но следует объяснить.

Мы действительно ранее получили трансгенные растения кукурузы pFEA2-FEA2-YFP и увидели четкий сигнал FEA2-YFP на плазматической мембране в меристеме соцветия (http://maize.jcvi.org/cellgenomics/geneDB_list.php. Однако мы этого не сделали). Я не делаю ZmCRN трансгенными растениями, как указывает рецензент, это дорого и требует много времени. Однако, по просьбе рецензента 2, мы добавили доказательства локализации ZmCRN на плазматической мембране и дополнительную поддержку белок-белковых взаимодействий, выполнив взаимные Co-IP и BiFC.Эти данные были добавлены в исправленную рукопись (рисунок 4D, приложение к рисунку 6 и приложение к рисунку 7). Эти дополнительные анализы дают нам дополнительную уверенность в локализации ZmCRN на плазматической мембране и взаимодействиях между ZmCRN и FEA2, даже несмотря на то, что эксперименты проводились на N. benthamiana . Обратите внимание, что мы не обнаруживаем прямое взаимодействие FEA2-CT2 с использованием BiFC, хотя мы неоднократно подтверждали их взаимодействие с помощью in vivo co-IP, и мы полагаем, что другой белок перекрывает их взаимодействие (Q.Wu and DJ, не опубликовано).

«FEA2-YFP, ZmCRN-mCherry, CT2-YFP и ZmCRN-mCherry также были совместно локализованы на плазматической мембране, когда они коэкспрессировались (рисунок 4 — приложение к рисунку 1). […] Наконец, как и ожидалось, не было обнаружено сигнала, когда CT2-NmVen210 коэкспрессировался с ZmCRN-CmVen210 (Рисунок 4 — рисунок в приложении 2), что подтверждает результаты co-IP и поддерживает гипотезу о том, что они не взаимодействуют. ”

5) Данные ясно показывают, что мутанты FEA2 обладают пониженной чувствительностью к пептидам FCP и CLE7, CT2 демонстрирует пониженную чувствительность к своему предполагаемому лиганду CLE7 (но не FCP1), а ZmCRN имеет пониженную чувствительность к FCP1 (его предполагаемому лиганду). , но чувствителен к CLE7.Однако легенда к фиг. 5 описывает мутанты crn как нечувствительные к FCP1, тогда как текст лучше описывает это взаимодействие как «частично устойчивое», поскольку FEA3 предположительно интактен и должен реагировать на примененный лиганд FCP. Лучше всего исправить это несоответствие между описаниями в легенде и текстом рукописи.

Спасибо, что уловили это несоответствие. Мы изменили формулировку легенды на Рисунке 5 на «Zmcrn частично устойчив только к пептиду ZmFCP1», чтобы сделать ее согласованной, как и предполагалось.

Рецензент № 2:

[…] Роль FEA3: Необходимо рассмотреть генетические взаимодействия FEA3 в путях FEA2-CT и FEA2-ZmCRN, чтобы оценить генетическое взаимодействие и данные о применении пептида. И fea2, и fea3 устойчивы к применению пептида ZmFCP1 (рис. 1). Из-за этого частичная чувствительность мутантов Zmcrn к ZmFCP1 (рис. 5D) может опосредоваться через FEA3. Применение пептида на двойных мутантах fea3 Zmcrn могло бы прояснить это.

Мы согласны с рецензентом в том, что важно понимать взаимодействие между FEA3 и ZmCRN , поскольку оба фактора действуют для передачи сигнала ZmFCP1.Поэтому мы добавили новые данные о генетических взаимодействиях между Zmcrn и fea3 (а также ct2 и fea3 ) у двойных мутантов. В популяции сегрегированных двойных мутантов fea3; SAMs двойных мутантов Zmcrn были больше, чем одиночные мутанты, что позволяет предположить, что FEA3 и ZmCRN не функционируют по общему пути. Подобные результаты наблюдались для fea3; ct2 двойные мутанты. Таким образом, fea3 действует аддитивно с Zmcrn , предполагая, что передача сигналов ZmFCP1 опосредуется двумя параллельными путями, один через FEA3, работающий через еще неизвестный нижестоящий компонент (ы), а другой через FEA2, связанный с ZmCRN.Эти генетические данные в значительной степени подтверждают предположение автора обзора о том, что частичная чувствительность мутантов Zmcrn к ZmFCP1 опосредуется через FEA3. Важно отметить, что наши данные предполагают, что CT2 и ZmCRN не действуют как нисходящие компоненты для FEA3 .

Мы не проводили пептидных анализов с fea3; Двойные мутанты Zmcrn , так как мы только что получили их, и потребуется еще 4-5 месяцев, чтобы вырастить растения, чтобы сделать эмбрионы и завершить обработку.Надеемся, что появятся новые данные по fea3; Двойных мутантов Zmcrn достаточно, чтобы убедить обозревателя в том, что FEA3 и ZmCRN действуют параллельно, что объясняет частичную чувствительность мутантов Zmcrn к пептиду ZmFCP1.

Эти новые данные представлены на рисунке 5 — дополнение к рисунку 1 и в тексте:

«Поскольку FEA3 также действует, чтобы передавать сигнал ZmFCP1 (Je et al., 2016), мы использовали генетический анализ, чтобы спросить, функционирует ли ZmCRN также ниже по течению от FEA3.[…] Таким образом, передача сигналов ZmFCP1, по-видимому, опосредуется двумя разными путями, один действует через FEA2 в сочетании с ZmCRN, а другой действует через FEA3, действуя через еще неизвестный нижестоящий компонент (ы) ».

Паттерны экспрессии / локализации ZmCRN: Где экспрессируется ZmCRN? Чтобы ZmCRN функционировал посредством образования гетеродимера с FEA2, их домен экспрессии должен перекрываться в SAM. Авторы могут создать трансгенные линии, экспрессирующие CRN с FP-меткой в ​​кукурузе (что, я согласен, может быть очень сложным и требует времени для кукурузы), или, по крайней мере, авторы должны показать четкие данные гибридизации in situ с FEA2 и CT2.

Спасибо за понимание сложности и продолжительности создания трансгенных растений CRN, меченных FP. По просьбе рецензента 1 мы провели гибридизацию in situ с меристемами побегов кукурузы с использованием антисмыслового зонда ZmCRN . ZmCRN экспрессируется по всей SAM и более сильно в периферическом домене и зачатках листа (рис. 2E). Этот профиль был подтвержден данными RNAseq микродиссекции с помощью лазерного захвата для различных доменов SAM (данные из лаборатории Timmermans, доступны из MaizeGDB; https: // maizegdb.org /). Эти новые данные добавлены как рис. 2E и рис. 2 — дополнение к рисунку 4. Ранее было показано, что CT2 широко экспрессируется в SAM с использованием трансгенных растений CT2-YFP (Bommert et al., 2013a). Кроме того, данные лазерного захвата РНК seq показали, что FEA2, ZmCRN и CT2 все широко экспрессируются во всех доменах SAM, что позволяет предположить, что они коэкспрессируются (рисунок 2 — приложение к рисунку 4).

Эти новые данные добавлены как рисунок 2E и рисунок 2 — дополнение к рисунку 4 и новый текст:

«ZmCRN экспрессировался по всей SAM и более сильно в периферическом домене и зачатках листа (Рисунок 2E, подтвержденный лазерным захватом микродиссекции RNAseq, Рисунок 2 — приложение к рисунку 4).”

Субклеточная локализация в N. benthamiana: авторы показывают, что ZmCRN-mCherry локализуется в PM в эпидермисе табачных листьев. Будет ли ZmFEA2 и / или CT совместно локализоваться с ZmCRN на плазматической мембране табака?

Да, мы наблюдали, что FEA2 были совместно локализованы с ZmCRN на плазматической мембране, когда эти два белка коэкспрессировались в N. benthamiana (приложение к рисунку 6). Мы также наблюдали совместную локализацию CT2-YFP с ZmCRN-mCherry на плазматической мембране, когда они коэкспрессируются (рисунок 4 — приложение к рисунку 1):

«FEA2-YFP, ZmCRN-mCherry, CT2-YFP и ZmCRN-mCherry также были совместно локализованы на плазматической мембране, когда они коэкспрессировались (рисунок 4 — приложение к рисунку 1).”

Анализы белок-белкового взаимодействия: авторы представляют только один тип эксперимента (Co-IP), чтобы сделать вывод, что FEA2 образует отдельный комплекс с ZmCRN и CT2 в зависимости от лигандов. Следующие эксперименты укрепят вывод:

а) Взаимное совместное IP. Авт. Должны взаимно IP FEA2 и подтвердить, что FEA2 действительно снижает ОБЕ CT2 и ZmCRN, когда три белка коэкспрессируются. Я считаю, что этот эксперимент необходимо провести.

Альтернативный экспериментальный подход для поддержки экспериментов in planta Co-IP.Авторы могли бы выполнить тесты BiFC, split-Ub или другие тесты белок-белкового взаимодействия, чтобы подтвердить свое утверждение.

Как было предложено, мы выполнили взаимные Co-IP и IP, используя 3 коэкспрессируемых белка. Первоначально мы показали, что либо ZmCRN-mCherry, либо CT2-YFP могут IP FEA2-myc, а теперь мы добавили новые эксперименты с использованием 3 коэкспрессируемых белков, показывающих, что, когда мы взаимно IP FEA2-myc, мы убираем CT2-YFP и ZmCRN-mCherry. (Рисунок 4D), подтверждая, что FEA2 действительно снижает как CT2, так и ZmCRN, когда три белка коэкспрессируются.

Мы также использовали анализы бимолекулярной флуоресценции (BiFC) для независимого подтверждения наших in planta co-IP. Мы использовали оптимизированную систему BiFC с разделением мономерной Венеры (mVenus) по остатку 210, чтобы уменьшить фон из-за ложноположительных взаимодействий (Gookin et al., 2014). Мы обнаружили сигнал YFP, когда FEA2 был слит с N-концевой частью mVenus (NmVen210), а ZmCRN был слит с C-концевой частью (CmVen210) (Рисунок 4 — приложение к рисунку 2), подтверждая прямое взаимодействие между FEA2 и ZmCRN.Сходные результаты были получены для Arabidopsis с использованием BiFC для обнаружения взаимодействий CRN-CLV2 (Zhu et al., 2010). Однако нам не удалось обнаружить сигнал YFP, когда FEA2-NmVen210 коэкспрессировался с CT2-CmVen210 (рисунок 4 — приложение к рисунку 2). Взаимодействие между FEA2 и CT2 хорошо задокументировано у N. benthamiana , а также у кукурузы в экспериментах in vivo Co-IP (рис. 4C и 4D, Bommert et al., 2013a). Неспособность обнаружить такое же взаимодействие с помощью BiFC предполагает, что их взаимодействие может быть косвенным (рис. 6).Наша лаборатория тщательно изучила взаимодействия FEA2-CT2 и многократно повторила co-IP in vivo, однако в других экспериментах с использованием FRET или BiFC мы не обнаружили взаимодействия, предполагая, что взаимодействие является непрямым, то есть другой белок или белки перекрывают взаимодействие — в настоящее время мы работаем над кандидатом на роль этого связывающего белка.

Наконец, как и ожидалось, не было обнаружено сигнала, когда CT2-NmVen210 коэкспрессировался с ZmCRN-CmVen210 (Рисунок 4 — рисунок в приложении 2), что подтверждает результаты co-IP и поддерживает гипотезу о том, что они не взаимодействуют.Это описано в новом тексте:

«Для проверки этих взаимодействий был проведен эксперимент с реципрокным Co-IP, в котором все три белка были коэкспрессированы, и мы снова обнаружили, что FEA2-Myc может IP CT2-YFP или ZmCRN-mCherry (рисунок 4D), в дальнейшем подтверждая, что FEA2 образует комплексы как с CT2, так и с ZmCRN. […] Наконец, как и ожидалось, не было обнаружено сигнала, когда CT2-NmVen210 коэкспрессировался с ZmCRN-CmVen210 (Рисунок 4 — рисунок в приложении 2), что подтверждает результаты co-IP и поддерживает гипотезу о том, что они не взаимодействуют.”

b) Роль различных пептидов, ZmFCP1 и ZmCLE7, в образовании рецепторного комплекса. Это может быть сделано путем обработки / инфильтрации / совместной экспрессии каждого пептида в листьях N. benthamiana вместе с попарной комбинацией рецепторов.

Как было предложено, мы совместно инфильтрировали ZmFCP1 или ZmCLE7 вместе с экспрессией FEA2-Myc, CT2-YFP и CRN-mCherry и выполнили эксперимент со-IP. Однако добавление пептидов CLE не повлияло на взаимодействие между FEA2-myc и CT2-YFP или CRN-mCherry (рисунок 4 — рисунок в приложении 3).Этот отрицательный результат трудно интерпретировать, но отметим, что подобные эксперименты не проводились даже с Arabidopsis , поэтому нет прецедентов, чтобы полагать, что лиганды CLE должны приводить к изменению образования рецепторных комплексов. Результаты описаны в новом тексте:

«Действительно, эти взаимодействия оказались довольно стабильными, и на них не влияла совместная инфильтрация пептидов CLE (Рисунок 4 — рисунок в приложении 3)».

Рисунок 4C. Полоски геля кажутся сращенными.Это не общепринятая практика или представление данных.

Приносим извинения за недосмотр и вставленные строки, как было предложено. Вестерн-блоты теперь отображаются правильно.

Обсуждение, четвертый абзац (обсуждение того, почему фенотип clv2 слабее, чем clv1). Предыдущий отчет (Diévart et al., 2003) показывает, что миссенс-аллели clv1 действуют доминантно-негативным образом. Пожалуйста, включите это в обсуждение.

Спасибо.Мы добавили эту информацию в Обсуждение:

«Это также объясняет, почему все промежуточные и сильные аллели clv1 являются доминантно-отрицательными, поскольку они, вероятно, мешают активности других рецепторных киназ, которые функционально перекрываются с CLV1 (Dievart et al., 2003; Nimchuk et al. , 2015) ».

Рецензент № 3:

[…] В целом это хорошо написанная рукопись, которая дает новое понимание пути передачи сигналов CLE, участвующего в поддержании стволовых клеток растений.Поскольку я не генетик кукурузы, я сосредоточу свой обзор на а) биохимических экспериментах, представленных в этом исследовании, и б) на обсуждении этих новых открытий:

a) Я понимаю, что очень сложно проводить какие-либо эксперименты с совместным IP на кукурузе, и что по этой причине была выбрана временная система. Тем не менее, я счел бы уместным хотя бы упомянуть в Обсуждении, что описанные взаимодействия были проанализированы не с уровнями нативного белка, а скорее с сильно сверхэкспрессирующими CRN, FEA2 и CT2.

Спасибо за предложение, теперь мы упомянули в разделе «Обсуждение» предупреждение о том, что взаимодействие между ZmCRN и FEA2 осуществлялось в системе с временной сверхэкспрессией:

«… и что FEA2 и ZmCRN взаимодействовали напрямую, используя анализы Co-IP и BiFC белков, временно сверхэкспрессируемых в N. benthamiana, что позволяет предположить, что ZmCRN является сигнальным компонентом в пути FEA2».

Кроме того, в отредактированной рукописи мы предоставили больше доказательств взаимодействия между ZmCRN и FEA2 с использованием взаимного Co-IP и BiFC в N.benthamiana (Рисунок 4D и Рисунок 4 — дополнение к рисунку 2). Эти данные дополнительно подтверждают взаимодействие между FEA2 и ZmCRN. Что касается взаимодействия между CT2 и FEA2, мы также подтвердили взаимодействие в N. benthamiana с помощью экспериментов с реципрокным Co-IP — это взаимодействие ранее было продемонстрировано с использованием нативной экспрессии в трансгенной кукурузе CT2-YFP (Bommert et al., 2013a). Эти новые эксперименты подробно описаны в комментариях для рецензента 2 выше.

b) Почему анализы устойчивости к пептидам проводят с такими высокими концентрациями пептидов (30 мкМ)? Считают ли авторы, что сродство связывания рецепторных комплексов кукурузы намного ниже, чем у Arabidopsis? Или в синтетических пептидах отсутствуют посттрансляционные модификации? Или пептиды плохо усваиваются растительной тканью?

Как и в наших предыдущих публикациях (Bommert et al., 2013a, Je et al., 2016), 5-30 мкМ пептид обычно использовались для анализа корней и эмбрионов кукурузы соответственно. Конечно, мы не можем знать, сколько пептидов проникает в ткани. Одна из причин, по которой необходима такая высокая концентрация, может заключаться в том, что синтетические пептиды не имеют необходимых посттрансляционных модификаций; в Arabidopsis , CLV3 арабинозилирован по остатку, модифицированному гидроксипролином (Matsubayashi, 2011), и эта посттрансляционная модификация имеет решающее значение для его высокоаффинного связывания с его рецептором CLV1 (Ohyama et al., 2009). У томатов мутант по гидроксипролин-O-арабинозилтрансферазе имеет увеличенные меристемы побегов, и мутант может быть спасен арабинозилированным CLV3 (Xu et al., 2015). Таким образом, пептиды CLE с модификациями арабинозилированного гидроксипролина обладают более высокой активностью, чем немодифицированные пептиды.

Три-арабинозилированные пептиды CLE коммерчески недоступны, и группа, которая впервые их опубликовала, не смогла предоставить их нам, поскольку их очень сложно получить. Однако совсем недавно мы получили от нашего соавтора некоторый модифицированный гидроксипролин-триарабинозил пептид ZmCLE7 (аналогичный пептидам, опубликованным в Corcilius et al., 2017). Мы сравнили рост корня кукурузы и SAM после обработки модифицированными или немодифицированными пептидами. Как и предполагалось, арабинозилированный пептид ZmCLE7 был более мощным, чем немодифицированная версия, по нашим оценкам, примерно в 10 раз. Однако наш сотрудник смог предоставить только небольшое количество арабинозилированного пептида CLE7, и этого недостаточно для повторения всех анализов в рукописи. Поэтому мы предлагаем следующую модификацию рукописи:

«Хотя мы использовали высокие концентрации пептидов, известно, что активность CLE-пептидов усиливается триарабинозилированием (Ohyama et al., 2009; Мацубаяси 2011; Сюй и др., 2015; Corcilius et al., 2017), и мы действительно обнаружили, что аналогично модифицированный пептид ZmCLE7 примерно в 10 раз более эффективен, чем немодифицированная форма (Рисунок 5 — рисунок в приложении 2) ».

c) Основываясь на своих выводах, авторы предполагают, что FEA2 / CLV2 является корецептором для нескольких киназ рецептора LRR, воспринимающих CLE пептид. С точки зрения представленной, а также ранее установленной генетики FEA2 / CLV2 это имело бы смысл только в том случае, если действительно функция CLV2 может быть заменена другим корецептором in vivo .Я был бы признателен, если бы авторы могли представить здесь выравнивание последовательностей известных рецептор-подобных белков кукурузы. Есть ли гомологи последовательности для CLV2 у кукурузы (нет очевидных гомологов у Arabidopsis)?

Мы включили филогенетический анализ, подтверждающий идею о том, что, подобно CLV2 в Arabidopsis , FEA2 не имеет близкого гомолога, который мог бы функционировать избыточно в кукурузе (Рисунок 6 — рисунок в приложении 1). Мы думаем, что автор обзора спрашивает, почему тогда фенотипы fea2 не сильнее.Мы полагаем, что это связано с другими избыточными путями, такими как fea3 , которые также обсуждались в нашем ответе рецензенту 2.

«Как кандидатный рецептор или корецептор для различных пептидов, FEA2 не должен иметь каких-либо близких гомологов в геноме кукурузы (Рисунок 6 — рисунок в приложении 1), подобно CLV2 в Arabidopsis , и его относительно скромный фенотип может быть из-за компенсации частично избыточными параллельными путями передачи сигналов, такими как через FEA3 (Je et al., 2016) у мутантов fea2 .”

https://doi.org/10.7554/eLife.35673.031

.