Олимп на макаренко: Спортивный клуб «Олимп» (Макаренко) в Туле

№	Адрес	Начало управления	Площадь м2	Год	Этажей	Жил. помещ.

Пскович Дима Макаренко стал абсолютным чемпионом фестиваля «Маленький чемпион-весна 2019»

Дима Макаренко — самый быстрый малыш.

Фото: Андрей СТЕПАНОВ

Тадам! Это свершилось! Сегодня в спорткомплексе собрались десятки малышей в возрасте от 6 месяцев до 2,5 лет вместе со своими мамами, папами, бабушками, дедушками, братьями , сестрами, другими родственниками и друзьями. Ребятишки -участники преодолевали десятиметровку ползком, а остальные подбадривали и болели, как могли.

«Маленький чемпион»- праздник для всей семьи.

Фото: Дарья ХВАТКОВА

Всего на соревновании состоялось 10 забегов.

В первом забеге самым быстрым оказался Степан Иванов, вторым приползла Ангелина Вакилова, третьей стала Александра Афанасьева.

Во втором забеге самой быстрой была Руслана Дяткинская, следом за ней добралась до финиша Мария Баюр, третьим стал Владимир Самсонов.

В третьем забеге лучшее время оказалось у Дмитрия Карнауха, чуть медленнее оказалась, Надежда Шепелева и третий результат у Ксении Васильевой.

В четвертом забеге самой шустрой была Полина Федорова, второй до финиша добралась Василиса Соляник, третьим по времени стал Данислав Кустков.

В пятом забеге самым быстрым ползунком стала Мария Свидерская, вторую строчку занял Александр Королев, с третьим результатом в чемпионы попала София Прокофьева.

В шестом забеге победителем стал Андрей Речков, на втором месте -Злата Ползохновская, на третьем -Арина Миккуева.

В седьмом забеге самое короткое время у Эллады Максимовой, чуть-чуть от нее отстал Владимир Андреев, и третьим в соревновании стал Алексей Загребин.

В восьмом забеге шустриком оказался Сергей Смирнов, вторым добрался до финиша Михаил Шемякин, а третьим стала Ксения Полозова.

В девятом забеге быстрее всех была Диана Семенова, вторым добрался Константин Григорьев, третью строчку заняла Ирина Щепелева.

В десятом забеге самым быстрым ползунком оказался Дмитрий Макаренко, вторым добрался до конца маршрута Степан Ребезанов, до третьего места дополз Григорий Лукьяненко.

Дима Макаренко — самый быстрый малыш.

Фото: Андрей СТЕПАНОВ

Дима Макаренко стал абсолютным чемпионом фестиваля «Маленький чемпион -весна 2019». Дорожку он преодолел быстрее всех на соревновании — за 8.53 секунды. Самый быстрый маленький чемпион получил помимо медали, диплома и подарка, кубок абсолютного чемпиона и приз от нашего партнера компании «ФрутоНяня».

Абсолютно все малыши участники забегов получили дипломы , подарки и фото на память.

Отличный пример скорости и воли к победе продемонстрировали папы малышей в конкурсе «Самый смелый папа» . Они ползли 30-ти метровку. Самым скоростным среди пап стал Салават Вакилов. Он преодолел дистанцию за 7.26 секунды. Второе место занял Максим Рехин с результатом 7.57 секунды и третьим финишировал Илья Шешокин, его время- 7.59 секунды.

Здорово быть не только быстрыми, но и стильными.

Фото: Михаил ГЛУЩЕНКО

Победителей мы отметили медалями, дипломами и подарками, кроме этого абсолютно все участники забегов также получили дипломы и подарки.

Отдельные призы организаторы вручили за стенгазеты в поддержку маленьких чемпионов и за креативные наряды а конкурсе «Стильная команда» .

КСТАТИ

Следующий праздник «Маленький чемпион » состоится осенью этого года.

ЖК Олимп 3 Сочи

ЖК «Олимп 3»

В зоне повышенной экологичности по улице Макаренко города Сочи,…

45000

Цены

Минимальная: 45 тыс руб за м²

За квартиру: от 1,1 млн руб

Класс жилья:
комфорт-класс

Адрес
Адрес:

Сочи, мкр. Макаренко
Город: Сочи

ЖКХ
Стадия строительства:Котлован
Тип дома: Монолитный
Этажей: 5

Квартиры

Площадь квартир: от 25 м²
Отделка: черновая отделка

В зоне повышенной экологичности по улице Макаренко города Сочи, охарактеризованной неимением производственных мощностей и близким расположением побережья Черного моря, уютно локализовался новый жилой комплекс класса «эконом» «Олимп 3».

Комплекс состоит из трех корпусов, выполненных по типу клубных.

Сдать в эксплуатацию «Олимп 3» планируется в третьем квартале 2013 года.

Особенности жилого комплекса «Олимп 3»

аждое строение жилого комплекса «Олимп 3» представляет собой цельное монолитно здание с хорошей тепло- и шумоизоляцией. Фасад отделан современным строительным материалом высокого качества – штукатуркой «Короед». Во всех корпусах стены бескаркасные, выполненные при помощи гипсокартона.

Квартиры потенциальным покупателям предоставляются с чистовой отделкой. На окнах установлены металлопластиковые стеклопакеты, стоят мощные металлические входные двери. Некоторые квартиры имеют балконы, которые либо застеклены, либо имеют доступ к чистому воздуху.

Коммуникации в жилом комплексе проложены. Водопровод, канализация, электричество, отопление – центральные. Предусмотрена установка приборов учета в квартирах. Отопление в ЖК газовое (индивидуальное, с установкой котлов).

Особенностью комплекса являются обширные балконы с панорамными видами на окрестности Черноморского побережья.

Инфраструктура жилого комплекса «Олимп 3»

Жилой комплекс «Олимп 3» находится в благоприятной зоне, в одном из самых живописных уголков города Сочи. Но, несмотря на это от центра его отделяет всего пять минут пешей ходьбы. Отменная транспортная доступность микрорайона и небольшая удаленность от делового центра Сочи является одним из больших преимуществ проживания в жилом комплексе «Олимп 3».

В распоряжении будущих жителей ЖК будет круглосуточно охраняемая и по высшему классу благоустроенная территория, придомовый паркинг и комфортабельные места для отдыха взрослых и детей. Объекты социальной инфраструктуры не менее привлекательны и расположены они совсем рядом.

Микрорайон располагает детским садом, образовательной школой, медицинскими учреждениями и большим продуктовым рынком. Здесь есть культурно-развлекательные учреждения и места для спокойного отдыха. Порадуют жителей ЖК «Олимп 3» и приветливые пляжи с большим количеством объектов инфраструктуры разного значения, и ласковое море!

Топографическая организация маммиллярного нейрогенеза и эфферентных проекций в мозге мышей

Основные моменты

•

Fezf2 экспрессируется в мультипотентных маммиллярных предшественниках, но не постмитотически

900 +

Fez8 предшественники продуцируют маммиллярные нейроны по принципу «извне-вовнутрь»

•

Маммиллярные эфференты из разных временных когорт организованы топографически

•

Fezf2 можно обойтись для проекции маммиллярных нейронов

и

Резюме

Маммиллярное тело — это ядро ​​гипоталамуса, которое выполняет важные функции в области памяти и пространственной навигации, но принципы его развития остаются недостаточно изученными.Здесь мы идентифицируем специфическую для предшественников экспрессию Fezf2 в развивающемся маммиллярном теле и разрабатываем подход перекрестного картирования судеб, чтобы продемонстрировать, что Fezf2 ⁺ маммиллярные предшественники генерируют маммиллярные нейроны в рострально-дорсально-латеральном и каудальном направлении вентрально-медиальная мода. Отслеживание аксонов из разных временных когорт меченых маммиллярных нейронов показывает их топографическую организацию. Неконтролируемая иерархическая кластеризация, основанная на внутренних свойствах, дополнительно идентифицирует два отдельных нейрональных кластера, не зависящих от дат рождения в медиальных ядрах.Кроме того, мы генерируем мышей с нокаутом Fezf2 и наблюдаем меньшее маммиллярное тело с в основном нормальной анатомией и слегка затронутой клеточной электрофизиологией, в отличие от более серьезных нарушений нейрональной дифференцировки и проекции во многих других областях мозга. Эти результаты показывают, что Fezf2 может по-разному функционировать в маммиллярном теле. Наши результаты дают важную информацию для развития маммиллярной системы и взаимодействия.

Ключевые слова

маммиллярное тело

Fezf2

индуцибельное генетическое картирование судьбы

перекрестное нацеливание

проекционное картирование

топографические принципы

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Просмотр Аннотация

© 2021 Автор (ы).

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или уточнить у системного администратора.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файлах cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Micro 42 Program

NASA / ESA / ISA Орбитальный аппарат Кассини, МКС, узкоугольное изображение.

> Microsymposium 42 Program
Microsymposium 42 Abstracts Программа 42-го Микросимпозиума Брауна-Вернадского по сравнительной планетологии
10-12 октября, Москва, Россия

ПОНЕДЕЛЬНИК 10 октября:

9:15 — 9:30 Церемония открытия: Э.М.Галимов и К.М. Питерс

9:30 — 13:00 Сессия: Mars STUDIES, А. Чикарро и А.А. Костриков, стулья

9:30 — 10:05 НАУЧНЫЙ ОБЗОР MARS EXPRESS ПОСЛЕ ОДНОГО МАРСИАНСКОГО ГОДА НА ОРБИТЕ. А. Чикарро (m42_11)

10:05 — 10:40 МАРС АТМОСФЕРА И КЛИМАТОЛОГИЯ С МАРС-ЭКСПРЕСС: ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ С РОССИЙСКИМ УЧАСТИЕМ. О.И. Кораблев, Л. Засова, А.А. Федорова, А. Родин, Н. Игнатьев, А. Рыбакова, В. Формизано, Ж.-Л. Берто, Ж.-П. Бибринг и все члены команд PFS, SPICAM и OMEGA (m42_33)

10:40 — 11:10 Измерения синоптического ветра в марсианской атмосфере вблизи перигелия.В. Кайдаш, М. Креславский, Ю. Шкуратов, Г. Видин, М. Вольф, Дж. Белл (m42_29)

11:10 — 11: 40 СЕЗОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СВЯЗАННОЙ ВОДЫ НА ПОВЕРХНОСТИ МАРТИАН: ГЛОБАЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ПОЛОСЫ ЭМИССИИ 6,1 мкм НА ОСНОВЕ ДАННЫХ. Р.О. Кузьмин, П.Р. Кристенсен, М.Ю. Золотов, С. Анвар (m42_42)

11:40 — 12:00 КАРТИРОВАНИЕ АДСОРБИРОВАННЫХ И СВЯЗАННЫХ ВОД В MARS REGOLITH НА ОСНОВЕ ДАННЫХ MARS EXPRESS / OMEGA. Евдокимова, Р.О.Кузьмин, А.В. Родин, А.А. Федорова, Ж.-П. Бибринг и команда OMEGA (m42_16)

12:00 — 12:30 НАПРЯЖЕНИЕ ТРЕЩИН ПО СПИРАЛЬНЫМ ЛИНИЯМ КАК ПРОИСХОЖДЕНИЕ СПИРАЛЕЙ МАРСИАНСКОГО СЕВЕРНОГО ПОЛЯРНОГО КОЛПАЧКА Костриков А.

12:30 — 13:00 КЛИМАТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КРАТЕРОВ НА СЕВЕРНЫХ РАВНИНАХ МАРСА. Креславский М.А., Хед Дж. У. (m42_39)

13:00 — 14:00 Перерыв на обед

14:00 — 18:00 Сессия: Mars STUDIES (продолжение.), В.-П. Костама и Т.В. Гудкова, стулья

14:00 — 14:30 МОДИФИКАЦИЯ ГРАНИЦЫ ДИХОТОМИИ НА МАРСЕ СРЕДНЕШИРОТЕЛЬНЫМ АМАЗОНСКИМ РЕГИОНАЛЬНЫМ ОЛЕДЕНЕНИЕМ. J.W. Руководитель, А. Л. Нахм, Д. Р. Марчант, Г. Нойкум и команда Mars Express HRSC. (m42_20)

14:30 — 15:00 ВОДА И ЛЕД В CENTRAL NOACHIS TERRA, МАРС? Я. Кортениеми, М. Айттола, Т. Эман, Т. Тёрманен и Й. Райтала (m42_36)

15:00 — 15:30 Эволюция речной системы Рейл Валлис, Марс. В.-П. Костама, М. Иванов, Я. Кортениеми и Я. Райтала (m42_37)

15:30 — 16:00 ДЕЛЬТЫ ОБРАЗОВАНИЯ ДРЕВНЕГО КРАТЕРНОГО ОЗЕРА В РЕГИОНЕ НИЛИ-ФОССАЭ НА МАРСЕ. К. И. Фассетт и Дж. У. Хед (m42_17)

16:00 — 16:20 Перерыв на кофе

16:20 — 16:50 ВНУТРЕННЯЯ СТРУКТУРА МАРСА. В.Н. Жарков, Т.В. Гудкова

16: 50-17: 20 ЭВОЛЮЦИЯ ЩИТОВОГО ВУЛКАНА ALBA PATERA, МАРС.Иванов М. Голова.

17:20 — 17:50 ГЕОЛОГИЯ ВОСТОЧНОГО БЕРЕГА ВУЛКАНА OLYMPUS MONS НА ИЗОБРАЖЕНИЯХ МАРСА MEX HRSC. А. Т. Басилевский, Г. Нойкум, С. Вернер, С. ван Гассельт, К. Гвиннер, Б. А. Иванов (m42_06)

18:00 — 20:30 Слайд-сессия и американский фуршет

Вторник, октябрь 11: 9:30 — 12:50, сессия: Lunar STUDIES, Д. Станкевич и С.Г. Пугачева, председатели.

9:30 — 10:00 ЛУННАЯ МИНЕРАЛОГИЧЕСКАЯ КАРТА (M3): НАУКА И РАЗВЕДКА. К. М. Питерс и команда M3 (m42_57)

10:00 — 10:30 ударное плавление частиц реголита микрометеоритами как основной механизм созревания почвы: поверхностные и объемные эффекты. Л. В. Старухина (m42_63)

10:30 — 11:00 ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ В МИКРОКРИСТАЛЛАХ ЛУННОГО ОЛИВИНА ПОД СОЛНЕЧНЫМ КОСМИЧЕСКИМ ЛУЧОМ. Кашкаров Л. Шилобреева, Г.В. Калинина (м42_28)

11:00 — 11:20 Перерыв на кофе

11:20 — 11:50 Анализ основных компонентов данных Консорциума по характеристике лунных почв.Д. Станкевич, Ю. Шкуратов, К. Питерс (m42_62)

11:50 — 12:20 ПАРАМЕТРЫ, ВКЛЮЧАЕМЫЕ В МОДЕЛЬ ХАПКЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ СОСТАВА ЛУННЫХ ОБОЛОЧЕНИЙ EJECTA. С.Г. Пугачева, В.В. Шевченко (м42_60)

12:20 — 12:50 ПРОИСХОЖДЕНИЕ ТОРИЙ БАССЕЙНА ЮЖНОГО ПОЛЮСА-АЙТКЕН. В.И. Чикмачев, С.Г. Пугачева (m42_12)

12:50 — 14:00 Перерыв на обед

14:00 — 15:30 УСТНЫЕ ПОСТЕРЫ 1, J. Кортениеми и Г.Г. Кочемасов, ведущие заседания. Плакаты размещаются на пронумерованных стендах и выдаются по заданным номерам.

MARS STUDIES

1. ГЕОМЕТРИЯ И ПАРАМЕТРЫ ПОТОКА ЛАВ OLYMPUS MONS VOLCANO: MARS. Базилевская Е.А., Нойкум Г. (m42_07)

2. ГЛУБОКОЕ РАДИОЛОКАЦИОННОЕ ЗОНДИРОВАНИЕ МОРСКИХ ПОЛЯРНЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ: МОДЕЛИ ПЕРЕДАЧИ ИЗЛУЧЕНИЯ.Я. А. Ильюшин (m42_15)

3. КОЛУМБИЯ ХИЛЛС, МАРС: FE-POOR, P-RICH, S-RICH И ДРУГИЕ РАЗНООБРАЗИЯ СЛОЯЩИХСЯ ЩЕЛОЧНЫХ ПОРОД ПОДОБНЫ НЕФЛИНОВЫМ СИЕНИТАМ СЛОЙНОГО МАССИФА ЛОВОЗЕРО, КОЛЬСКИЙ ПОЛУОСТРОВ, РОССИЯ. Кочемасов Г.Г. (m42_32)

4. ВЕНТИЛЯТОРНЫЙ КАНАЛ ПРИВЕСТИ К ОБРАЗОВАНИЮ АЛЛЮВИАЛЬНЫХ ВЕНТИЛЯТОРОВ В ПЛАНЕ ИКАРИА, МАРС J. Korteniemi, J. Raitala, M. Aittola, V.-P. Костама, Э. Хаубер, П. Кронберг, Г. Нойкум и группа соисследователей HRSC (m42_35)

5. РАЗРАБОТКА НЕОБЫЧНОГО КРАТЕРА В АРАБИИ ТЕРРА, МАРС Х. Лахтела, К. Попа, Дж. Кортениеми, Дж. Ди Акилле, Г. Г. Ори, Г. Нойкум и группа соисследователей HRSC (m42_43)

6. РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ПРОИСХОЖДЕНИЕ ОРИЕНТИРОВАННЫХ И НЕОРИЕНТИРОВАННЫХ ПОЛИГОНАЛЬНО ИЗОБРАЖЕННЫХ ЗЕМЛЕЙ В МУЛЛИНАХ И ЦЕНТРАЛЬНЫХ ДОЛИНАХ МЯКА, АНТАРКТИКА: ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛЕДНИКОВОГО ПОТОКА И СУБЛИМАЦИИ В МАРС-АНАЛОГОВОЙ СРЕДЕ. Дж. С. Леви, Дж. У. Хед, III, и Д. Р. Марчант (m42_47)

7.COPRATES CHASMA СЕВЕРНАЯ СТЕНА ВНУТРЕННЕГО СЛОЕВОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ: ИЗМЕРЕНИЯ СЛОЯ И СРАВНЕНИЕ С JUVENTAE CHASMA ILDS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТЕРЕОКАМЕРЫ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ MARS EXPRESS, ПОЛУЧЕННОЙ ТОПОГРАФИИ. Майкл, Г., Э. Хаубер, К. Гвиннер, Р. Стески, Ф. Фютен, Д. Рейсс, Х. Хоффманн, Р. Яуманн, Г. Нойкум, Т. Зегерс и группа соисследователей HRSC (m42_50 )

ЛУННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

8. АБСОЛЮТНАЯ КАЛИБРОВКА ДАННЫХ ЛУННОЙ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ. Акимов Л.А., И. Великодский (m42_02)

9. УСИЛЕННОЕ ОБРАТНОЕ РАССЕЯНИЕ ПОЛЯРИЗОВАННОГО СВЕТА: ВЛИЯНИЕ ФОРМЫ ЧАСТИЦ РЕГОЛИТА НА ОППОЗИЦИОННЫЙ ПИК ЯРКОСТИ, ПРОЯВЛЯЕМЫЙ НЕКОТОРЫМИ ТЕЛАМИ СОЛНЕЧНОЙ СИСТЕМЫ. Я. М. Длугач, М. И. Мищенко (m42_14)

10. Перекалибровка ИНТЕГРАЛЬНОЙ ФОТОМЕТРИИ ЛУНЫ ПО ТЕЛЕСКОПИЧЕСКИМ И КЛЕМЕНТИННЫМ НАБЛЮДЕНИЯМ. В.В. Корохин, Ю.И. Великодский, В. Кайдаш, Ю.Г. Шкуратов (m42_34)

11.МОДЕЛИРОВАНИЕ ПОЛЯРИЗАЦИОННЫХ СВОЙСТВ ЛУННОГО РЕГОЛИТА С Т-МАТРИЧНЫМ ПОДХОДОМ. Д.В. Петров, Э. Зубко, Е. Синельник, Ю.Г. Шкуратов (m42_56)

12. Оптимальные условия наблюдений поверхности планеты для восстановления рельефа фотометрическим методом. Скуратовский С.И., Дулова И.А. Корниенко В.В., Бондаренко Н.В. (m42_61)

13. Влияние шероховатости поверхности на рассеивающие свойства длинноволновых частиц, имитирующих зерна реголита. Э. Зубко, К. Муйнонен, Т. Ноусиайнен, Ю. Шкуратов, Г. Видин (m42_71)

VENUS STUDIES

14. СМЕШИВАНИЕ ЛИНИЙ И КОЛЛИЗИОННОЕ УШИРЕНИЕ ТЕПЛОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ АТМОСФЕРЫ НИЖНЕЙ ВЕНЕРА :. Т.С. Афанасенко и А.В. Родин (m42_01)

15. СТРУКТУРА КОЛЬЦА КОЛОРАДО: ВОЗМОЖНЫЙ АНАЛОГ КОРОНЫ НА ВЕНЕРЕ. Г. А. Бурба (m42_09)

16. НИКОЛАЕВА ПАТЕРА В ASTERIA REGIO НА ВЕНЕРЕ: МАЛЕНЬКАЯ КОРОНА ПРИ СОЕДИНЕНИИ ДВУХ РЕГИОНАЛЬНЫХ ПОЯСОВ.Г. А. Бурба (m42_10)

15:30 — 16:00 Перерыв на кофе

16:00 — 17:30 УСТНЫЕ ПОСТЕРЫ 2. Я. Кортениеми, О.Б. Хаврошкин, ведущие заседания. Плакаты размещаются на пронумерованных стендах и выдаются по заданным номерам.

МЕТЕОРИТЫ

17. СОЛНЕЧНАЯ АКТИВНОСТЬ И КЛИМАТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЗЕМЛИ. Алексеев В.А. (m42_05)

18. ПРИРОДНАЯ ТЕРМОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ И ОРБИТЫ МЕТЕОРИТОВ. А.И. Ивлиев, В.А. Алексеев (m42_27)

19. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МАГНИТНЫХ И НЕМАГНИТНЫХ ФАЗ У ABEE (Eh5): ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РОДИТЕЛЬСКОГО ОРГАНА EH. З.А. Лаврентьева, А.Ю. Люль, Н.А.Шубина, Г. Колесов (м42_44)

ОБЩАЯ ПЛАНЕТОЛОГИЯ

20. О КЛЮЧЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕОДНОРОДНОСТИ И ДЕФОРМАЦИИ ПЛАНЕТНОЙ КОРЫ.О. Хаврошкин, В.В. Цыплаков, В. Расхожев (м42_30)

21. УРОК КАССИНИ: КВАДРАТНЫЕ КРАТЕРЫ, РОВНО РАЗМЕРЫ ПЛЕЧЕЙ К ПЛЕЧУ И В СЕТКАХ КРАТЕРЫ, ИМЕЮЩИЕ ВОЛНОВЫЕ ИНТЕРФЕРЕНЦИИ, ДОЛЖНЫ БЫТЬ ИЗБЕГАНЫ ИЗ СТАТИСТИКИ УДАРНЫХ КРАТЕРОВ, ЧТОБЫ СДЕЛАТЬ ЕГО НАСТОЯЩИМ. Г.Г. Кочемасов (m42_31)

22. Применение адаптивного динамического регрессионного моделирования для обработки и анализа некоторых изменений продолжительности земного среднего дня.Куркина С.В. (m42_41)

23. ЛУННАЯ И ЗЕМНАЯ ДУГИ. Г.Ф. Макаренко (m42_49)

24. ВОЗМОЖНОСТЬ УМЕНЬШЕНИЯ СЛАБОСИДЕРОФИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ПРИ УДАРНОМ ПРОЦЕССЕ. О.И. Яковлев, Ю. П. Диков, М. В. Герасимов (m42_70)

АККРЕЦИЯ, КОМЕТЫ, АСТЕРОИДЫ, ТИТАН
25. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КОМЕТУ. В.А. Алексеев, А. Кондратенко и А.Е. Полтанов (m42_03)

26.ОЦЕНКА ВРЕМЕНИ КОНСОЛИДАЦИИ И РАСПАДА АСТЕРОИДА — РЕЗИНОВОЙ ГОЛОВКИ. ПРОСТОЙ МОДЕЛЬ. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ. Г.А. Лейкин и А. Санович (m42_46)

27. РАННИЕ ИМЕНА НА ТИТАНЕ: СИСТЕМА НОМЕНКЛАТУРЫ ДЛЯ ЕЩЕ ОДНОГО МИРА. Т. К. Оуэн, К. Акснес, Р. Бибе, Дж. Блю, А. Брахич, Г. А. Бурба, Б. А. Смит и В. Г. Тейфель (m42_52)

28. РАЗВИТИЕ КОНДЕНСАЦИЙ В ПРЕДПЛАНЕТАРНОМ ДИСКЕ И ОБРАЗОВАНИЕ ПЛАНЕТ.Г.В. Печерникова, А.В. Витязев (м42_54)

18:00 — 22:00 РОССИЙСКИЕ ХОЗЯЙСТВА ПРИНИМАЮТСЯ В ДОМЕ ИНОСТРАННЫХ ГОСТЕЙ

СРЕДА 12 ОКТЯБРЯ: АККРЕЦИЯ, АСТЕРОИДЫ, СПУТНИКИ, УДАР, Р. Вагнер и И.В. Немчинов, стулья

9:30 — 10:00 Диссипативные столкновения тел размером с астероид. М.П. Лазарев, А.В. Витязев (м42_45)

10:00 — 10:30 МОДЕЛИРОВАНИЕ ТУРБУЛЕНТНОЙ АККРЕЦИОННОЙ ПОДНЕБУЛЫ И ФОРМИРОВАНИЕ СПУТНИКОВ.Макалкин А. Дорофеева, Е.Л. Рускол (м42_48)

10:30 — 11:00 КОСМИЧЕСКОЕ ВРЕМЯ ЛОКАЛИЗАЦИИ НЕОБЫКНОВАННЫХ ПЛАНЕТАРНЫХ СПУТНИКОВ. Н.И. Перов, А.А. Находнев (m42_55)

11:00 — 12:00 ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ СУПЕРНОВОГО ВЗРЫВА ТИПА Ia В ФОРМИРОВАНИИ СОЛНЕЧНОЙ СИСТЕМЫ. Устинова Г.К. (m42_66)

12:00 — 12:30 ГЕОЛОГИЯ И СТРАТИГРАФИЯ СПУТНИКОВОГО ДИОНА САТУРНА НАБЛЮДЕНИЕ КАМЕРЫ МКС КАССИНИ.Р. Вагнер, Г. Нойкум, Т. Денк, Б. Гизе, Т. Роатч и команда МКС Кассини (m42_68)

12:30 — 13:00 Возмущения ионосферы и магнитосферы, вызванные ударами астероидов и комет. Немчинов, Ю.В. Зетцер И., Ковалев А. Т., Шувалов В. В. (m42_51)

13:00 — 14:00 Перерыв на обед

ВЕНЕРА, ЗЕМЛЯ, ТИТАН, КОМЕТА

14:00 — 14:40 VENUS ВЫРАЖАЕТ НАУЧНЫЕ ЦЕЛИ, НАГРУЗКИ И ЗАПЛАНИРОВАННЫЕ НАБЛЮДЕНИЯ.Д. В. Титов, Х. Сведхем, Л. Маринанджели (m42_64)

14:40 — 15:05 МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ТОПОГРАФИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ EPONA CORONA: ПРИМЕР МНОЖЕСТВЕННОЙ КОРОНЫ НА ВЕНЕРЕ. Т. Торманен, В.-П. Костама, М. Аиттола и Дж. Райтала (m42_65)

15:05 — 15:30 Детальное исследование анизотропии ШЕРОХОВАТОСТИ венерианских равнин. Бондаренко Н.В., Креславский М.А., Хед Дж. У. (m42_08)

15:30 — 16:00 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ЗАВИСИМОСТИ ЭНЕРГИИ ПРОЕКТА ОТ РАЗМЕРА КРАТЕРА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПАРАМЕТРОВ ИСКУССТВЕННОГО КРАТЕРА НА COMET 9P / TEMPEL 1.В.Г. Кручиненко, К. Чурюмов, А.А. Вальтер, Ю.П. Добрянский, Л.С. Чубко (m42_40)

16:00 — 16:20 Перерыв на кофе

16:20 — 16:50 ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ «ГРЯЗНОГО ВУЛКАНИЗМА» ВЕРОЯТНО БУДЕТ СУЩЕСТВОВАТЬ НА ТИТАНЕ. В.А. Алексеев (m42_04)

16:50 — 17:20 Статистический анализ сейсмической активности Земли на основе DRM-ПОДХОДА. Валеев С.Г., Куркина С.В. (m42_67)

17:20 Перерыв

18:00 22:00 КУЛЬТУРНАЯ ПРОГРАММА

ТОЛЬКО ДЛЯ ПЕЧАТИ РЕЗЮМЕ:

МАРС НАБЛЮДАЛИСЬ НА ЗАМОРОЗНЕННЫХ ЛИЦАХ ДЮНЫ НА ЮЖНОМ СРЕДНЕМ ШИРОТЕ МАРСА: ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ЦЕЛИ ДЛЯ ВЫСОКОГО РАЗВИТИЯ И КРИЗМА.Дж. Л. Диксон, Дж. У. Головка (m42_13)

ЭРОЗИЯ МАРСА И ИНВЕРСИЯ НА ТЕРРАХ СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ АРАВИИ. К. И. Фассет, Дж. У. Хед (m42_18)

МАРС ВЫСОКОШИРОТНЫЕ ХОЛОДНЫЕ ЛЕДНИЧНЫЕ ОТЛОЖЕНИЯ НА МАРСЕ: НЕСКОЛЬКО НАЛОЖЕННЫХ КАПЕЛЬ МОРЕНА В ИНТЕРЬЕРЕ КРАТЕРА НА 70 ° С. Дж. Б. Гарвин, Дж. У. Хед, Д. Р. Марчант, М. А. Креславский (m42_19)

МАРС ДИХОТМОТИЯ ГРАНИЦА ЛЕДНИКА НА СРЕДНИХ ШИРОТАХ: ДЕГРАДАЦИЯ СТЕН И ЦЕНТРАЛЬНЫХ ПИКОВ КРАТЕРА MOREUX (ДИАМЕТР 135 КМ).Дж. У. Хед и Д. Р. Марчант (m42_23)

ПЛОТИНЫ BRECCIA В УДАРНЫХ КРАТЕРАХ НА ЗЕМЛЮ: ХАРАКТЕРИСТИКИ И КРИТЕРИИ ПРИЗНАНИЯ НА МАРСЕ. Дж. У. Хед и Дж. Ф. Мастард (m42_24)

ПЛОТИНЫ BRECCIA В УДАРНЫХ КРАТЕРАХ НА МАРСЕ: ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ПОЛ КРАТЕРА ДИАМЕТРОМ 85 КМ НА ГРАНИЦЕ ДИХОТОМИИ. Дж. У. Хед и Дж. Ф. Мастард (m42_25)

СИСТЕМА ГУЙГЕНС-ЭЛЛАС-ГИГАНТ НА ​​МАРСЕ: ПОСЛЕДСТВИЯ ДЛЯ ПОЗДНЕГО НОКА-РАННЕГО ГЕСПЕРИАНСКОГО ВУЛКАНИЧЕСКОГО ОБНОВЛЕНИЯ И ЭВОЛЮЦИИ КЛИМАТА.Дж. У. Хед, Л. Уилсон, Дж. Диксон, Г. Нойкум и команда HRSC (m42_21)

СОБЫТИЕ ПО УЛУЧШЕНИЮ ПОСТЛЕДНИКОВОГО ДАЙКА В ARSIA MONS, МАРС: КОНУСЫ ИЗВЕРЖЕННЫХ БРЫЗГОВ, КОНУСЫ ТЕФРА И ПОТОКИ ПО ДАЙКУ. Дж. У. Хед, Д. Э. Шин и Л. Уилсон (m42_22)

ГИГАНТСКИЕ МАРСОВЫЕ УДАРНЫЕ БАССЕЙНЫ — ЧИСЛЕННОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ. Иванов Б.А. (m42_26)

КИНЕМАТИКА ПЛАСТИН И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КАК ИНДИКАТОР МЕХАНИЧЕСКОГО ХАРАКТЕРА ЛИТОСФЕРЫ ЕВРОПА.Дж. У. Паттерсон и Дж. У. Хед (m42_53)

НАЧАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КУБИЧЕСКОЙ И ВАРИАЦИОННОЙ НЕЯВНОЙ ИНТЕРПОЛЯЦИИ ДЛЯ КОМБИНИРОВАНИЯ СТЕРЕОТОПОГРАФИИ HRSC С ЛАЗЕРНОЙ АЛЬТИМЕТРИЕЙ MOLA. Прабхат и К. И. Фассетт (m42_59)

ИНТЕРАКТИВНОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ ПОВЫШЕНИЕ КОНТРАСТНОСТИ ДАННЫХ ИЗОБРАЖЕНИЯ. Прабхат, Д. Шин, А. Форсберг, Дж. У. Хед III (m42_58)

ВЗРЫВНЫЕ ВУЛКАНИЧЕСКИЕ ИЗВЕРЖЕНИЯ НА МАРСЕ: АККРЕЦИОННОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ЛАПИЛЛИ И ИХ ПРИЗНАЧЕНИЕ В ГЕОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАПИСИ.Л. Уилсон и Дж. У. Хед (m42_69)

Пространственная количественная оценка фенотипа синаптической активности в больших популяциях нейронов с помощью марковских случайных полей | Биоинформатика

Аннотация

Мотивация

Коллективная и скоординированная синаптическая активность больших популяций нейронов имеет отношение к развитию нейронов, а также к ряду неврологических заболеваний. Количественная оценка синаптически-опосредованной нейронной передачи сигналов позволяет проводить дальнейший анализ, а также потенциальное применение в проверке достоверности мишеней и скрининговых анализах in vitro и . Наша цель — разработать фенотипическую количественную оценку данных визуализации нейрональной активности больших популяций нейронов, в частности, в отношении пространственного компонента активности.

Результаты

Мы расширяем возможности использования моделей марковского случайного поля (MRF) для достижения этой цели. В частности, мы рассматриваем байесовские апостериорные плотности параметров модели в гауссовых MRF, чтобы напрямую моделировать изменения интенсивности флуоресценции кальция, а не использовать последовательности спайков.В основе нашей модели лежит определение «соседей» нейрона по относительному пространственному положению сомат нейронов, полученному из данных изображения, тогда как ранее это ограничивалось определением искусственной квадратной сетки в поле зрения и биннингом спайков. Мы демонстрируем, что наша пространственная фенотипическая количественная оценка применима как для in vitro , так и для in vivo данных, состоящих из тысяч нейронов за сотни временных точек. Мы покажем, как наш подход обеспечивает понимание, выходящее за рамки того, что достигается обычным подсчетом спайков, и обсудим, как его можно использовать для облегчения скрининговых анализов на модификаторы связанных с заболеванием дефектов связи между клетками.

Доступность и реализация

Мы предоставляем код MATLAB и данные для получения всех результатов в статье.

1 Введение

Синаптическая нейротрансмиссия и активность нейронов важны для развития и совершенствования зрелой нервной системы (Blanquie et al. , 2017; Sigler et al. , 2017). Известно, что нарушения синаптической нейротрансмиссии и пластичности вносят вклад в такие заболевания, как эпилепсия, нейропатическая боль и депрессия (Doucet et al. , 2012 г .; Jacobs et al. , 2000; Чжо, 2008). Было обнаружено, что спонтанная нейронная активность играет особенно важную роль в установлении мозговых цепей во время развития (Куцарова и др. , 2017; Лейтон и Ломанн, 2016; Пратт и др. , 2016) и может также способствовать такие расстройства, как фантомная боль в конечностях (Blumberg and Dooley, 2017). Использование систем культивирования ex vivo в качестве моделей развития нейронов и болезней дает многочисленные преимущества, такие как возможность помочь в открытии основных регуляторных механизмов.Нейроны, выделенные из незрелой коры головного мозга, способны развивать функциональные синаптические связи в культуре. Они демонстрируют спонтанное волнообразное распространение пиков кальция (Дополнительный фильм S1), которые обладают фармакологической чувствительностью, указывающей на участие потенциалов действия и рецепторов нейромедиаторов (Dravid and Murray, 2004). Эти свойства предполагают, что такие культуры могут обладать способностью моделировать аспекты развития и заболевания, связанные с синаптической функцией, и поэтому могут использоваться в скринингах для идентификации молекул, изменяющих синаптическое поведение.

Хорошо известно, что вклад нейронной активности в функцию мозга лежит в пределах скоординированной активности больших популяций нейронов, а не независимой активности отдельных нейронов (Tkačik et al. , 2014). Поэтому мы не предлагаем анализировать поведение отдельных нейронов, а вместо этого стремимся представить нейронную коммуникацию в более крупных популяциях. Мы стремимся количественно оценить эту синаптически управляемую активность, в частности связанную с пространственной структурой активности, как интересующий фенотип на экране или в экспериментальной установке.Это требует совокупного анализа до тысяч нейронов за сотни временных точек.

Общим первым шагом в анализе больших нейронных временных данных является уменьшение размерности, применяемое либо к временным рядам (Breakspear, 2017; Cunningham and Byron, 2014), либо к низкоуровневым характеристикам, таким как морфология клеток (Sharma ). и др. , 2012). Этот подход напрямую привел к применению в декодировании (классификации), например, классификации изображений / видео естественных сцен с использованием соответствующей индуцированной активности нейронов сетчатки (Ahmadian et al. , 2011 г .; Onken et al. , 2016). Другие общие аналитические методы включают попарные или популяционные кросс-корреляционные исследования временных рядов (Okun et al. , 2015; Smith and Häusser, 2010) или использование скрытых марковских моделей для вывода основных состояний активности (Mazzucato et al. др. , 2016). Непространственный анализ цепочек спайков (двоичные временные ряды спайков нейронов) использует статистику «подсчета спайков», такую ​​как средняя частота возбуждения и интервал между спайками, или усреднение данных каким-либо другим способом, например, с использованием временных гистограмм ( Hill et al., 2015).

Особым исключением из непространственного анализа данных нейронной активности является использование моделей случайного поля Маркова (MRF) (Абдаллахи и др. , 2003; Франсуа и др. , 2000; Макаренко и др. ). , 1997). Однако до этого момента такой анализ ограничивался данными поездов всплесков, для чего требовалась временная схема объединения всплесков. Модели Изинга — это особый тип MRF, который также использовался при анализе цепочки шипов (Nirenberg and Victor, 2007; Roudi et al., 2009 г .; Schneidman et al. , 2006 г .; Шленс и др. , 2006), но где парные взаимодействия рассматривались для каждой возможной пары нейронов, или, другими словами, все нейроны считаются одинаково смежными в пространстве. Явно пространственный компонент может быть достигнут с использованием модели MRF путем определения квадратной сетки через поле зрения, где каждая область взаимодействует только со своими четырьмя ближайшими соседями (Абдаллахи и др. , 2003; Франсуа и др., 2000; Макаренко и др. , 1997). Такая схема разреженного взаимодействия означает, что можно реально проанализировать гораздо больше данных, чем при предыдущем использовании моделей Изинга (всего ∼10 ячеек), однако определение такой сетки требует также схемы разбиения пиков в пространстве.

Здесь мы используем гауссовскую модель MRF (Rue and Held, 2005) с попарными взаимодействиями и где нейронная связь моделируется на основе относительного пространственного расположения сомат нейронов. Следовательно, мы рассматриваем не квадратную сетку, а скорее триангуляцию, фактически соответствующую отдельным нейронам, но которая также приводит к разреженной матрице смежности (дополнительный рис.S1). Мы непосредственно анализируем нейронную активность, извлеченную из данных изображения, то есть измерения уровней кальция на основе флуоресцентных красителей, а не последовательности спайков. Кроме того, вместо точечной оценки параметров модели, как это было достигнуто ранее, мы будем рассматривать апостериорные плотности соответствующих параметров модели в полностью байесовской структуре. Следовательно, мы количественно оцениваем пространственный компонент нейронной активности с помощью нашей модели, которая основана на новом использовании гауссовских MRF для непосредственного моделирования интересующего процесса.

Последние достижения в области визуализации с высоким разрешением больших популяций нейронов во многих областях мозга (Sofroniew et al. , 2016), а также потенциальных приложений для скрининга большого поля (LF) in vitro (~ 5000 отдельных клеток; ~ 6000 временных точек) предоставил возможность специально использовать пространственный компонент данных синаптической активности. Мы рассматриваем данные экспериментов по моделированию, данные, полученные из культур ex vivo нейронов специально для этого исследования, а также свободно доступные данные из исследований in vivo , опубликованные в литературе (Chen et al., 2016; Ли и др. , 2015b; Sofroniew et al. , 2016). Мы показываем, что наш подход может обеспечить понимание, выходящее за рамки обычного подсчета всплесков, а также согласование и дополнение ранее достигнутых результатов. Мы также обсуждаем, как наш подход может быть использован для облегчения скрининговых анализов.

2 Материалы и методы

2.1 Препарат нейрональной культуры

Культуры корковых нейронов крыс получали, как описано ранее (Li et al., 2013) в среде NeurobasalA с добавлением 1,5–2% B27 (Life Technologies-Thermo). Половину среды заменяли свежей каждые 3 дня. Клетки высевали в 96-луночные микропланшеты Cellstar (Greiner, дно 0,19 мм) для LF-визуализации или 96-луночные планшеты Cellstar (Greiner, 1 мм дно) для визуализации в среднем поле. На 9 (эксперимент LF) или 16 (эксперимент со средним полем) дни in vitro среду на кортикальных культурах заменяли не содержащей отмывкой среды для загрузки красителя репортерного кальциевого репортера {с конечными концентрациями 2 мкМ Fluo4AM, 0.01% плуроновая кислота, 0,1% BSA и краситель ДНК Hoechst 33342 в растворе на основе SGG [NaCl 137,5 мМ, KCl 5,3 мМ, CaCl ₂ 2 мМ, MgCl ₂ 1 мМ, HEPES 10 мМ, глюкоза 30 мМ, глицин 1 мМ; (Bading et al. , 1993)]} с добавлением 0,5 мМ пирувата натрия, 2,5 мМ NaHCO ₃ и 10% минимально необходимой среды (MEM Gibco-Thermo cat # 11700077) для визуализации в условиях окружающей среды и инкубирования в течение 1 час, чтобы позволить красителю впитаться.

2.2 Получение данных изображения

Для получения изображений LF изображения были получены через объектив 4x (NA 0,16, Olympus) с использованием специализированного микроскопа IX70, как описано ранее (Li et al. , 2015a). Поле освещалось светодиодным источником с длиной волны 460 нм (XLED1, LDGI). Эмиссионный свет собирали через длиннопроходный фильтр 510 нм. Камера Hamamatsu Flash 4.0 была запущена с использованием программного обеспечения HCimage (Hamamatsu) с объединением 2 × 2 для создания изображений 1024 × 1024 пикселей с глубиной 16 бит и временем интеграции 0.300 с. Поле (размер 3,2 × 3,2 мм) содержало до 10 ⁴ клеток и снималось каждые ∼0,375 с, всего 418 кадров (общее время ∼156,75 с). Данные, соответствующие этой настройке, в дальнейшем называются данными LF.

Для получения изображений клеток до, во время и после добавления фармакологических ингибиторов использовался автоматический сканер изображений, оборудованный камерой для визуализации клеток (установленной на 5% CO ₂ , 37 ° C), содержащей гентри для пипетирования (BD Pathway 855 High Content Analyzer).Среду для культивирования клеток сначала удаляли вручную и заменяли МЕМ (64 мкл / лунку) с добавлением 5 мкМ конечного пикротоксина, ингибитора рецептора ГАМК-А, для обеспечения воспроизводимого уровня спонтанной активности в культурах. Каждую из 30 культур в лунках последовательно загружали (с интервалами 45 с) кальциевым красителем, добавляя на стадии 6 мкл 10-кратной не содержащей отмывки среды для загрузки красителя-репортера кальция в MEM, используя одноканальный пипеточный дозатор автоматизированного имидж-сканера. .

Клетки обрабатывали во время третьего цикла визуализации либо 0.1 мкМ тетродотоксина (ТТХ) (Ascent Scientific) для полного блокирования потенциалов действия или 0,2 мкМ MK-801 (Tocris) для частичного снижения кальциевых ответов, управляемых рецептором NMDA, в 10 повторных лунках для каждого состояния. Добавки производили из 10 × штоков в MEM с использованием настольного дозатора. Контрольные образцы не трогали после добавления красителя. В этой системе используется менее чувствительная камера (Hamamatsu Orca-ER CCD, 1344 × 1024 пикселей, используется при биннинге 2 × 2), что требует использования большего увеличения и объективов с более высокой числовой апертурой, что приводит к уменьшению количества ячеек на поле (∼ 300). Изображения были получены через 10-кратный объектив с большим рабочим расстоянием (NA 0,3, Olympus) для 45 кадров на окно сбора данных (~ 35 с в одном окне сбора данных, что позволяет ~ 10 с для перемещения объектива к следующей лунке и перефокусировки, что дает ∼20 мин между циклами сбора данных). Было два окна измерений до лечения, одно во время лечения и четыре окна после лечения. Данные, соответствующие этой настройке, в дальнейшем называются данными среднего поля (MF).

2.3 мозаики и триангуляции Вороного

Тесселяция определяется как разделение двумерного пространства на набор областей, называемых плитками. Когда набор плиток находится во взаимно однозначном соответствии с набором начальных точек в пространстве, так что любая точка, лежащая в пределах плитки, находится ближе всего к соответствующей начальной точке этого фрагмента, это называется тесселяцией Вороного. Затем мы можем построить соответствующий граф, рассматривая исходные точки как вершины и наличие ребра между любыми двумя вершинами, которые имеют смежные соответствующие плитки в поле зрения. Следовательно, мы заканчиваем триангуляцией, хотя заметим, что это не триангуляция Делоне, поскольку смежность плиток Вороного ограничена существованием только в пределах указанного поля зрения.

Пример тесселяции Вороного, полученный из данных изображения нейрональной культуры, приведен на рисунке 1. У нас есть проекция стандартного отклонения данных изображения временного ряда (рис. 1a), которая затем используется для маски сегментации для нейронных клеток (рис. . 1b). Центры сегментированных областей — это исходные точки, используемые для определения мозаики Вороного с использованием евклидова расстояния (рис.1в). Наконец, обнаруживается триангуляция, приводящая к графику, в котором каждая вершина соответствует нейронной клетке, а каждое ребро соответствует «соседям» нейронной клетки, как показано в мозаике Вороного (рис. 1d). Следовательно, нейроны являются только «соседями», соответствующими соседним плиткам Вороного, а не всем другим нейронам (дополнительный рисунок S1).

Рис. 1.

Получение мозаики и графика Вороного. ( a ) Проекция стандартного отклонения (во времени) для примера поля зрения культивируемых нейронов.( b ) Маска сегментации нейрональных клеток. ( c ) Тесселяция Вороного, где исходные точки являются центрами каждой из сегментированных ячеек. ( д ) Соответствующий график триангуляции. То есть нейроны, представленные в виде вершин, имеют соседей, представленных через ребра, соответствующие соседним плиткам Вороного, а не все другие нейроны (дополнительный рис. S1).

Рис. 1.

Получение тесселяции и графа Вороного. ( a ) Проекция стандартного отклонения (во времени) для примера поля зрения культивируемых нейронов.( b ) Маска сегментации нейрональных клеток. ( c ) Тесселяция Вороного, где исходные точки являются центрами каждой из сегментированных ячеек. ( д ) Соответствующий график триангуляции. То есть нейроны, представленные в виде вершин, имеют соседей, представленных через ребра, соответствующие соседним плиткам Вороного, а не все другие нейроны (дополнительный рисунок S1)

Дополнительный рисунок S2a показывает пример тех же данных флуоресцентного изображения, F _t представлен как «кинопленку».Первые разностные изображения, ΔFt = Ft-Ft-1, также даются как «пленка» (дополнительный рисунок S2b), на которые затем накладываются соответствующие маски сегментации и мозаика Вороного (дополнительный рисунок S2c). Затем извлеченные данные временных рядов активности нейронов, среднее значение интенсивности флуоресценции каждой ячейки в каждый момент времени, визуализируются на мозаике Вороного путем окрашивания каждой плитки на основе значения временного ряда (дополнительный рисунок S2d). Те же данные представлены в дополнительном фильме S2.Обратите внимание, что размеры плиток Вороного не имеют никакого значения в нашем анализе, но тесселяция — это полезная визуализация данных временных рядов, которая поддерживает информацию о пространственной смежности.

2.4 Пространственная модель нейрональной активности

Предположим, что у нас есть набор нейронов с соответствующим графом G = (V, E) и что X _i для i∈V являются случайными величинами измеряемой активности нейронов. Для удобства ниже мы будем считать, что индекс i соответствует отдельным нейрональным клеткам, а соображения относительно времени рассматриваются ниже.Мы пишем X = {Xi | i∈V} (все измерения) и XV \ i = {Xj | j∈V \ i} (все измерения, кроме i th). Пусть множество ребер E = {eij∈ {0,1} | eij = eji, для всех i, j∈V} — множество всех ребер между каждой парой нейронов, где нейроны i и j являются соседями тогда и только тогда, когда e _ij = 1. Пусть степень вершины i будет ∂i = ∑j∈Veij с e _ii = 0 для всех i∈V⁠.

Условно-авторегрессивные (CAR) модели — это гауссовские MRF, определенные серией полных условных распределений

Xi | XV \ i∼N (ϕ∑j∈V \ ieij∂iXj, σ2∂i)

для всех i∈V . То есть каждая переменная X _i имеет условное гауссовское распределение со средним значением, средним значением в масштабе ϕ ее соседних значений и дисперсией σ2, масштабированной по количеству ее соседей. Совместное распределение X существует и уникально (Rue and Held, 2005), записывается

X∼N (0, σ2 (D (I − ϕW)) — 1)

, где D — диагональная матрица с элементами Dii = ∂i для всех i∈V⁠, I — это единичная матрица, а W известна как матрица смежности с элементами W _ij = e _ij для всех i, j∈V ⁠.Для того чтобы ковариационная матрица была положительно определенной, ϕ∈ (−1,1) и σ2> 0 (Гельфанд и Вунацу, 2003). Если ϕ = 0, то X имеет диагональную ковариационную матрицу и, следовательно, каждый из одномерных маргинальных распределителей независим. Значение ϕ> 0 приводит к пространственной автокорреляции между соседними переменными (легче всего увидеть в полных условных распределениях), в то время как ϕ <0 приводит к пространственной антиавтокорреляции. Следовательно, ϕ известен как параметр пространственной автокорреляции.

Методы, основанные на правдоподобии (Cressie et al., 2005), а также приближенные алгоритмические методы (Banerjee et al. , 2014) существуют для вывода параметра пространственной автокорреляции ϕ и точности τ = 1σ2⁠. Хотя модели CAR часто используются как один компонент в более крупных иерархических моделях (Banerjee et al. , 2014), в отличие от картирования болезней с ковариатами, здесь нет необходимости, и мы можем найти явное выражение для апостериорной плотности пространственной автоматической -корреляционный параметр ϕ в рамках байесовской модели (Bell, Broemeling, 2000; De Oliveira, 2012; Ren, Sun, 2013).Положим априорные значения π (ϕ) ∝ постоянными и π (τ) ∝τ − 1⁠, и мы предполагаем a priori , что ϕ и τ независимы, то есть π (ϕ, τ) = π (ϕ) π (τ ) = τ − 1⁠.

Теперь вероятность равна

π (x | ϕ, τ) ∝ | D (I − ϕW) | 12τn2 exp ⁡ {−τ2xT (D (I − ϕW)) x}.

Следовательно, совместное апостериорное распределение равно

π (ϕ, τ | X = x) ∝π (x | ϕ, τ) π (ϕ, τ)

= | D (I − ϕW) | 12τn2−1 exp ⁡ { −τ2xT (D (I − ϕW)) x}.

При фиксированном ϕ видно, что τ имеет гамма-распределение,

τ | {ϕ, X = x} ∼Γ (n2,12xT (D (I − ϕW)) x).

Чтобы найти апостериорную плотность ϕ, мы проинтегрируем π (ϕ, τ | X = x) по τ, используя свойства гамма-распределения, чтобы получить

π (ϕ | X = x) ∝ | D (I −ϕW) | 12 (XT (D (I − ϕW)) X) −n2.

Следовательно, мы можем брать выборку из π (ϕ | X = x) ⁠. То есть для данного набора измерений активности нейронов X = x , мы можем сделать выборку из апостериорного распределения ϕ в модели CAR, чтобы оценить объем пространственной автокорреляции, присутствующей в данных. как измерено ϕ⁠.

В приведенном выше представлении индекс случайных величин X явно не соответствует ни пространству, ни времени. Матрица пространственной смежности может соответствовать любому графу, например графу, приведенному на рисунке 1d.Чтобы моделировать во времени, можно рассматривать идентичные графы для каждой временной точки и добавлять дополнительные ребра между этими графами, чтобы представить временную смежность между каждым нейроном во времени. Затем параметр автокорреляции можно разложить на пространственную и временную составляющие, ϕW = ϕspaceWspace + ϕtimeWtime, где Wspace и Wtime — матрицы смежности, соответствующие пространственной и временной смежности, соответственно. Хотя матрица смежности W в принципе может принимать любую форму, на практике W обычно является разреженной матрицей, что позволяет практически осуществить вывод модели.Разреженность автоматически возникает из-за того, что матрица смежности соответствует смежным плиткам в тесселяции Вороного в нашей модели.

3 Результаты и обсуждение

3.1 Модель MRF позволяет получить точные оценки параметра автокорреляции ϕ в модельных экспериментах

Сначала рассмотрим моделирование модели MRF с известными параметрами. Одна тысяча точек была равномерно распределена в поле зрения, и были получены соответствующие мозаика и график Вороного. На рисунке 2 показаны реализации модели MRF как для высоких, так и для низких значений параметра пространственной автокорреляции ϕ (обратите внимание, что мы рассматриваем только один момент времени, поэтому нет необходимости учитывать ϕtime, и мы устанавливаем τ = σ2 = 1 для всех моделирования). Под смоделированными данными на рис. 2 представлена ​​гистограмма выборки из соответствующей апостериорной плотности ϕ⁠. Мы можем видеть, что когда истинное значение ϕ = 0 (отсутствие пространственной автокорреляции между соседними ячейками), апостериорная плотность центрируется вокруг 0, а когда истинное значение ϕ = 0.99 (высокая пространственная автокорреляция между соседними ячейками), апостериорная плотность сосредоточена около 0,9.

Рис. 2.

Моделирование из MRF на основе мозаики Вороного для 1000 равномерно распределенных точек данных в пространстве. Плитки Вороного раскрашены так же, как на дополнительном рисунке S2d. ( a ) Параметр истинной автокорреляции ϕ = 0 и гистограмма выборки из апостериорной плотности, приведенной ниже. ( b ) Параметр истинной автокорреляции ϕ = 0.99 и гистограмма выборки из апостериорной плотности, приведенной ниже.

Рис. 2.

Моделирование из MRF на основе мозаики Вороного 1000 равномерно распределенных точек данных в пространстве. Плитки Вороного раскрашены так же, как на дополнительном рисунке S2d. ( a ) Параметр истинной автокорреляции ϕ = 0 и гистограмма выборки из апостериорной плотности, приведенной ниже. ( b ) Параметр истинной автокорреляции ϕ = 0,99 и гистограмма выборки из апостериорной плотности, приведенная ниже

Дополнительный рисунок S3 показывает прямоугольные диаграммы выборок из апостериорной плотности ϕ для диапазона истинных значений ϕ для каждого из 10, 100, 1000 и 10 ⁴ смоделированных точек в поле зрения.Мы можем видеть, что по большей части апостериорные выборки сосредоточены вокруг истинных соответствующих значений ϕ⁠ с большей точностью и меньшей дисперсией по мере увеличения количества точек данных, как ожидалось. Этот график предлагает нижний предел около 1000 точек данных, необходимых для получения разумных апостериорных распределений. Когда истинное значение ϕ = 0,99⁠, центры апостериорных выборок для 1000 и 10 ⁴ смоделированных точек кажутся смещенными, составляя около 0,9. Однако в этом случае мы находимся прямо на краю области ϕ, и поэтому неудивительно, что центры апостериорных распределений находятся дальше от этого края.

Вышеупомянутые модели соответствуют одной временной точке, тогда как на практике у нас есть данные временных рядов. Как обсуждалось выше, включение компонента времени в модель может быть достигнуто путем установки ϕW = ϕspaceWspace + ϕtimeWtime⁠. На дополнительном рисунке S4 показаны ящичковые диаграммы выборок из апостериорных плотностей ϕspace для диапазона истинных значений как ϕspace, так и ϕtime⁠. Однако в каждом случае апостериорные плотности ϕspace были найдены при фиксированном ϕtime = 0. То есть, ϕtime, по-видимому, является вспомогательным средством для точного вывода о ϕspace, по крайней мере, с точки зрения центра апостериорной выборки. Поэтому во всех случаях ниже мы полагаем ϕtime = 0 и пишем ϕ вместо ϕspace⁠. Поскольку нас больше всего интересует пространственная автокорреляция популяций нейронных клеток, это делает анализ намного более ясным, а также означает, что для нахождения апостериорной плотности требуется гораздо меньше вычислительных затрат.

В случае, когда у нас меньше 1000 ячеек в поле зрения (например, с данными MF), мы можем ожидать низкой точности и высокой дисперсии в наших выборках апостериорной плотности на основе дополнительного рисунка S3.Однако дополнительный рисунок S4 также демонстрирует, что в случаях, когда у нас есть данные временных рядов, эквивалентное количество точек данных, используемых для вычисления апостериорной плотности, представляет собой количество ячеек в поле зрения, умноженное на количество временных точек. Следовательно, даже несмотря на то, что есть только ~ 200 ячеек на поле зрения для данных MF, у нас есть 45 кадров в каждом окне сбора данных, и, следовательно, эквивалентное количество точек данных составляет 200 × 45 = 9000. Следовательно, в более общем случае мы можем ожидать апостериорного образцы с низкой дисперсией и высокой точностью.

3.2 Модель MRF может различать чисто пространственные различия в волновой активности нейронов

Теперь рассмотрим имитационный эксперимент, основанный на данных LF. Сами эти данные были получены в качестве теста системы, поэтому рассматривается только одно поле зрения с необработанными клетками, демонстрирующими спонтанную сетевую активность и волнообразное распространение сигнала (дополнительный фильм S1). Скорость распространения волны (<8 мм / с) значительно ниже сообщаемых скоростей распространения потенциала действия в нейронах коры и гиппокампа [∼240–470 мм / с (Gulledge and Stuart, 2003; Kress et al., 2008 г .; Schmidt-Hieber et al. , 2008)]. Это, вместе с устранением спонтанной активности с помощью TTX (см. Ниже; Dravid and Murray, 2004), убедительно доказывает, что наблюдаемое волновое распространение является результатом синаптической активации через несколько последовательных локальных синапсов, а не приходом одного длинного диапазона входной синапс на нескольких ячейках. В последнем случае максимальная задержка активации в поле изображения будет 10 мс, а не 300 мс, как здесь.

Всего в поле зрения 5366 сегментированных ячеек, а данные состоят из 418 временных кадров (417 первых разностных кадров).Дополнительный рисунок S5 показывает распределение степеней вершин в соответствующем графе. Мы рассматриваем две разные схемы моделирования с использованием данных LF путем перестановки временных рядов либо в пространстве, либо во времени. В случае «перестановочного пространства» наблюдаемые временные ряды случайным образом переставляются между ячейками. В случае «перестановки времени» временные ряды случайным образом сдвигаются во времени для каждой ячейки (и при необходимости оборачиваются). Исходные данные и два смоделированных случая можно увидеть в дополнительном фильме S3, а соответствующие временные ряды приведены на дополнительном рисунке S6.

Ящичковые диаграммы выборок из апостериорных плотностей ϕ приведены для различных временных окон на рисунке 3. Мы можем видеть, что пространственный компонент данных отчетливо виден в апостериорных выборках ϕ⁠. То есть волнообразное распространение активности, которое видно в исходных данных и больше не видно после пространственной перестановки (дополнительный фильм S3). Обратите внимание, что такой анализ, как подсчет пиков, даст одинаковый результат как для исходных данных, так и для случая с пространственной перестановкой, поскольку пространственный компонент данных просто не принимается во внимание.Пространственная автокорреляция равна нулю после временной перестановки, так как выброс был полностью десинхронизирован. Если бы временные ряды представляли собой шипованные поезда, статистика, такая как средняя скорость стрельбы, не изменилась бы ни при пространственной, ни при временной перестановке.

Рис. 3.

Коробчатые диаграммы выборок из апостериорной плотности ϕ для схемы моделирования на основе данных LF для различных временных окон с также предоставленным медианным значением. При рассмотрении 10 временных точек эквивалентное количество точек данных составляет ∼5 × 104, тогда как при рассмотрении всех временных точек эквивалентное количество точек данных составляет ∼2 × 106, и, следовательно, дисперсия выборки настолько мала (сравните с дополнительным рис.S3). Соответствующие данные активности нейронов представлены в дополнительном фильме S3

Рис. 3.

Коробчатые диаграммы выборок из апостериорной плотности ϕ для схемы моделирования, основанной на данных LF для различных временных окон с также предоставленным медианным значением. При рассмотрении 10 временных точек эквивалентное количество точек данных составляет ∼5 × 104, тогда как при рассмотрении всех временных точек эквивалентное количество точек данных составляет ∼2 × 106, и, следовательно, дисперсия выборки настолько мала (сравните с дополнительным рис.S3). Соответствующие данные об активности нейронов представлены в дополнительном фильме S3

. 3.

3 Модель MRF может количественно определять подавление клеточной коммуникации, вызванное фармакологическими соединениями

Наша цель — разработать фенотипическую количественную оценку нейронной коммуникации, которая может быть использована для клеточного скрининга реагентов с потенциальной фармакологической активностью. Поэтому мы оценили использование параметра пространственной автокорреляции для количественной оценки влияния конкретных соединений на клеточную коммуникацию.В данных MF контрольное условие сравнивали с двумя фармакологическими обработками: ТТХ в концентрации 0,1 мкМ для устранения потенциалов действия и MK-801 в концентрации 0,2 мкМ для частичного ограничения потока кальция через каналы рецепторов NMDA, каждый из которых был воспроизведен в 10 лунках. Распределение степеней вершин (дополнительный рис. S7) очень похоже для каждой лунки со средней степенью ∼5 и низким разбросом (сравнение с дополнительным рис. S5 демонстрирует неизменность размера клеточного окружения, определяемого тесселяцией Вороного для различные размеры полей, что говорит о масштабируемости нашего подхода). Количество ячеек на лунку также очень схоже с общим медианным значением чуть менее 200. На одно окно сбора данных приходится 45 временных рамок, поэтому для каждой лунки и каждого окна мы производим выборку из апостериорного значения ϕ, где есть эквивалент ∼9000 данных. точки.

Для каждой скважины мы учитываем два окна сбора данных до обработки и четыре окна сбора данных после обработки. На рисунке 4 показаны прямоугольные диаграммы параметра пространственной автокорреляции, где для каждой обработки и для каждого окна сбора данных есть прямоугольная диаграмма для каждого из 10 повторов.Примеры временных рядов для трех скважин также приведены на дополнительном рисунке S8. Напомним, что клетки предварительно обрабатывали низкой концентрацией пикротоксина, ингибитора рецептора GABA-A, чтобы первоначально стимулировать спонтанную активность сетей. Следовательно, во всех временных окнах визуализации до лечения нейроны имеют сильно синхронизированный импульс (⁠ϕ≈0,99⁠).

Рис. 4.

Коробчатые диаграммы выборок из апостериорной плотности ϕ для данных MF. Было 6 окон сбора данных (2 до обработки, 4 после обработки) с 10 повторами для каждого состояния

Рис.4.

Коробчатые диаграммы выборок апостериорной плотности ϕ для данных MF. Было 6 окон сбора данных (2 до лечения, 4 после лечения) с 10 повторами для каждого состояния

Добавление ТТХ приводит к резкому подавлению выбросов кальция, поскольку лечение эффективно устраняет потенциалы действия, от которых зависит внутринейронная коммуникация (рис. . 4). Таким образом, не ожидается, что клетки будут подвергаться воздействию синаптически высвобождаемого передатчика, и сетевая активность прекращается.В необработанном состоянии, используемом в качестве контроля, мы можем видеть, что клетки постепенно становятся менее синхронизированными (рис. 4 и дополнительный рис. S8). Это, вероятно, отражает адаптацию сети к потере тормозного входа в результате продолжающегося воздействия на сеть пикротоксина посредством синаптического масштабирования или другого гомеостатического механизма (Fernandes and Carvalho, 2016).

Блокатор открытых каналов рецепторов NMDA MK-801 в концентрации 2 мкМ предотвращает кальциевые ответы, вызванные NMDA (Courtney et al., 1990; Ли и др. , 2013) и, в пилотных экспериментах, устраняет всю активность (данные не показаны), в отличие от обработки ТТХ 0,1 мкМ. По этой причине мы использовали 0,2 мкМ MK-801 только для частичного снижения кальциевых ответов, вызванных NMDA. Это условие приводит только к небольшому и очень запоздалому падению автокорреляции по сравнению с добавлением TTX. Это видно только во время последнего окна сбора данных (Рис. 4 и Дополнительный Рис. S8). Такое поведение предполагает, что скорость адаптации сетевой активности к пикротоксину, измеряемая как автокорреляция кальциевых ответов, сама зависит от притока кальция через рецепторы NMDA, что приводит к автокоррелированной активности кальция.Это согласуется с адаптацией сети к источнику изменения активности и с известной ролью активности рецептора NMDA в событиях синаптического масштабирования, происходящих в диапазоне часов и времени (Fernandes and Carvalho, 2016; Pawlak et al. , 2005).

Следует подчеркнуть, что контрольный образец не получил холостой пробы, но был нетронутым в течение периода измерения. То есть, хотя очевидная адаптация к пикротоксину (добавленная за 1 час до начала первого временного окна) становится видимой, никакого лечения не применялось.Кроме того, интересно отметить, что поведение управляющих данных MF со временем сходится к поведению данных LF (см. Временные ряды на дополнительных рисунках S6 и S8 и пространственную автокорреляцию на рисунках 3 и 4), которые выражают базовый уровень спонтанная активность и отсутствие добавок пикротоксина. Это подтверждает наше вышеупомянутое предложение о том, что контрольные образцы, обработанные низким уровнем пикротоксина, постепенно адаптируются и начинают восстанавливать исходное состояние. Как видно из необработанных трасс (дополнительный рис.S8), что не только постепенно исчезают кальциевые спайки, но и часть клеток приобретает гетерогенное состояние кальция, отличное от их начальных уровней между спайками (панель «Pre1») и ингибированных уровней в клетках, обработанных либо TTX, либо MK.

Мы исследовали потенциальную фототоксичность в данных MF, поскольку освещение было больше (∼8 раз) и в течение более длительного периода времени в этом эксперименте по сравнению с установкой LF. Токсичность оценивали по лизису клеток во время эксперимента, который измеряли как заметно сниженный сигнал флуоресценции, то есть если интересующая область (клетка) показывала максимальную интенсивность в последнем окне визуализации, которая была меньше минимальной интенсивности той же области. в первом окне изображения, полученном на ∼2 ч раньше.Токсичность могла быть результатом процедуры загрузки, деэтерификации ацетоксиметил-производного красителя, недостаточного увлажнения в камере для визуализации, фототоксичности, непрерывного воздействия 5 мкМ пикротоксина, используемого для усиления синаптической активности, или комбинации этих факторов. В дополнение к этим неоптимальным условиям, общим для всех образцов, некоторые образцы подвергались действию ингибиторов на протяжении всего процесса визуализации. Несмотря на это, токсичность, как определено выше, составила менее 1% в течение 2-часового периода во всех 10 контрольных образцах и 8 образцах, обработанных MK801.Токсичность была выше (в среднем ~ 4%; максимум ~ 8%) в образцах, обработанных ТТХ. Примечательно, что все эти образцы получали одинаковое количество света, что позволяет предположить, что фототоксичность не была основной причиной потери клеток в ходе этого эксперимента.

Приведенные здесь данные были получены в качестве доказательства концепции для оценки применения параметра пространственной автокорреляции для различения различной нейрональной активности, вызванной стандартными фармакологическими манипуляциями. В сценарии скрининга потребуются тысячи точек данных на выборку, но это может быть достигнуто из данных изображения, полученных за несколько временных точек.Такая система потенциально может быть применена к клеточным моделям заболевания и для идентификации соединений, корректирующих связанные с заболеванием дефекты межклеточной коммуникации.

3.4 Модель MRF может использоваться для анализа

данных in vivo и позволяет делать выводы, согласующиеся с предыдущими анализами

Мы стремились дополнительно оценить применение подхода MRF к данным временного анализа in vivo кальция. Мы рассмотрели данные изображений из двух различных экспериментов in vivo с использованием мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки-сенсоры кальция в своих нейронах.В первом случае мы рассматриваем данные 2-фотонного мезоскопа с произвольным доступом (2pRAM), которые состоят из изображений с высоким разрешением активности популяций нейронов, одновременно полученных из нескольких областей мозга (Sofroniew et al. , 2016). Авторы оригинального исследования выбрали четыре различных региона в пределах большего изображения всего мозга, с ~ 100 нейронами на регион и 6000 временных рамок (их рис. 8). В качестве примера последующего анализа была проанализирована корреляция Пирсона «средней» активности (вычисленной путем взятия максимальных значений во временном ряду) в области 1 (соответствующей соматосенсорной коре) по отношению к отдельным клеткам в других регионах (Sofroniew и другие. , 2016). В результате было показано, что активность отдельных нейронов в одной части мозга можно сравнить с активностью в других областях, которые одновременно отображались (Sofroniew et al. , 2016).

Мы рассматриваем те же четыре области данных 2pRAM и исследуем параметр пространственной автокорреляции. На рисунке 5 мы можем видеть, что существует различная пространственная автокорреляция, наблюдаемая в каждой из четырех областей в разных временных окнах. Интересно, что первая (соматосенсорная кора) и третья (ретроспленальная кора) области демонстрируют совершенно разную пространственную автокорреляцию в разных временных окнах, в то время как области два и четыре, которые, по-видимому, находятся в первичной соматодвигательной коре, имеют более последовательную пространственную автокорреляцию. .Во всех случаях, когда рассматривается все больше и больше таймфреймов, параметр автокорреляции, кажется, сходится и стабилизируется. Опять же, в выборках есть небольшая разница, поскольку у нас есть эквивалент до ∼6 × 105 точек данных (хотя это тот же порядок, что и данные LF, обратите внимание, что здесь меньше ячеек и намного больше временных точек).

Рис. 5.

Коробчатые диаграммы выборок апостериорной плотности ϕ для данных 2pRAM (Sofroniew et al., 2016) (четыре области можно увидеть на рис. 8) для разных временных окон с указанием медианного значения. При рассмотрении всех временных точек эквивалентное количество точек данных составляет ∼6 × 105

Рис. 5.

Коробчатые диаграммы выборок из апостериорной плотности ϕ для данных 2pRAM (Sofroniew et al. , 2016) области можно увидеть на их рис. 8) для разных временных окон с указанием медианного значения. При рассмотрении всех временных точек эквивалентное количество точек данных составляет ∼6 × 105

Эти наблюдаемые различия между регионами не были идентифицированы с использованием корреляции Пирсона, как первоначально описано (Sofroniew et al., 2016). На дополнительном рисунке S9 представлены прямоугольные диаграммы корреляции Пирсона, рассчитанной между каждой парой нейронов в каждой области для тех же временных окон, что и на рисунке 5. Корреляция Пирсона центрирована близко к нулю во всех случаях, как и в исходном выходе (Sofroniew et al. , 2016) трудно интерпретировать. Наш параметр пространственной автокорреляции дает количественную оценку нейронной активности на основе модели, тогда как при более специальном подходе есть множество возможностей без явно наиболее подходящего выбора.Например, корреляция Пирсона может быть рассчитана между каждой парой нейронов или между каждым нейроном и средним (Okun et al. , 2015) или максимальным (Sofroniew et al. , 2016) временными рядами, не говоря уже о с учетом взаимной корреляции и запаздывания.

Во-вторых, мы рассмотрели данные изображения, полученные из левой передней моторной коры (ALM) у мышей, выполняющих задачу направленного облизывания, для исследования, направленного на локализацию планирования двигательной активности (Li et al. , 2015b).Доступны данные о четырех разных мышах, облизывающих вправо или влево в ответ на тактильный сигнал (Chen et al. , 2016). Каждому сеансу визуализации соответствует отдельная мышь и определенная глубина в левом ALM. Всего было 59 сеансов, из которых 53 были использованы (где временной ряд не содержал ни Inf, ни NaN). Было доступно 20 сеансов для мыши A19 и 11 сеансов для мыши друг друга. Множественные повторы обеих задач по лизанию были измерены за один сеанс.Среднее количество ячеек в поле зрения составляет 88, а при 91 временной точке для каждого сеанса эквивалентное количество точек данных составляет ∼8000.

Мы вычисляем пространственную автокорреляцию нейронной активности, наблюдаемой в поле визуализации для каждого сеанса для задач вылизывания слева и справа отдельно, и наносим на график средние значения на рисунке 6. По большей части мы обнаружили, что активность нейронов ( который был записан только в левом ALM) оказывается более пространственно автокоррелированным для случаев «лизать вправо» по сравнению с «лизать влево».Это согласуется с исходным отчетом по этим данным о том, что нейроны, отображаемые в левом ALM, реагировали больше во время проб правого лизания (Li et al. , 2015b). Примечательно, что этот результат был первоначально получен не из подсчета спайков в зарегистрированной популяции нейронов, а в результате дополнительных оптогенетических экспериментов (Li et al. , 2015b), предполагая, что явный пространственный компонент нашего подхода может дать значительную пользу для анализа. корреляции активность-поведение in vivo .

Рис. 6.

Медианные значения выборок из апостериорной плотности ϕ для каждого сеанса (мыши A19, A22, A23 и A26 на разных глубинах визуализации) в данных ALM (Chen et al. , 2016; Li и др. , 2015b). Глубина изображения указана в цветовой шкале (мкм). Не было меченых нейронов PT для сеансов с глубиной <450 мкм (над слоем 5), а также для некоторых сеансов на большей глубине.

Рис. 6.

Медианные значения выборок из апостериорной плотности ϕ для каждого сеанса (мыши A19, A22, A23 и A26 на разной глубине изображения) в данных ALM (Chen et al., 2016; Ли и др. , 2015b). Глубина изображения указана в цветовой шкале (мкм). Не было помеченных нейронов PT для сеансов с глубиной <450 мкм (над слоем 5), а также для некоторых сеансов на большей глубине

Данные на рисунке 6 также окрашены по глубине измерения, подчеркивая, что наибольшие различия в ϕ в основном соответствуют к сеансам визуализации на более низких глубинах. Сеансы визуализации без нейронов пирамидного тракта (ПВ) также идентифицируются и, по-видимому, аналогичным образом соответствуют этой разнице.Обратите внимание, что нет нейронов PT для сеансов с глубиной <450 мкм (то есть выше уровня 5), но есть некоторые более глубокие сеансы, в которых также отсутствуют идентифицированные нейроны PT. Также обратите внимание, что в нашем анализе учитывались все нейроны независимо от идентификации PT. Еще раз, мы также рассматриваем корреляцию Пирсона между каждой парой нейронов в каждом сеансе и видим, что медианная корреляция Пирсона в целом низкая (дополнительный рисунок S10). Хотя можно утверждать, что корреляция Пирсона выше в исследованиях «правильного выбора», этот результат гораздо яснее и более интерпретируемым с помощью нашего параметра пространственной автокорреляции на основе модели на рисунке 6.

3.5 Обсуждение установки модели

Кинетическая LF-визуализация нервной ткани и образцов in vivo обычно не позволяет полностью захватить все нейриты, которые могут включать в себя структуры, меньшие, чем разрешающая способность обычно используемых методов микроскопии. Использование мозаики Вороного в качестве основы для нейронных связей в нашей модели явно не отражает полного физического и химического взаимодействия между нейронами. Тем не менее, он позволяет нам реально описать коллективное поведение, такое как мотивирующая волновая синаптическая активность (дополнительный фильм S1), без исчерпывающего рассмотрения мельчайших деталей, некоторые из которых могут даже не быть зафиксированы в исходных данных изображения.Результирующая матрица смежности модели является разреженной, что позволяет сделать возможный вывод. Кроме того, использование тесселяции Вороного приводит к графам с очень похожими распределениями степеней вершин вне зависимости от общего количества нейронов (дополнительные рисунки S5 и S7), что указывает на то, что наш метод по своей сути масштабируем для различных размеров полей.

В рамках нашей установки максимальный размер клики равен 3 (триангуляция), однако клики размера 2 уже создают пространственную структуру, а клики большего размера используются редко, поскольку считается, что они вносят сложность с небольшой выгодой (Banerjee et al., 2014). Следовательно, мы рассматривали только пары нейронов (клики размера 2), которые были более предпочтительными (Nirenberg and Victor, 2007; Tkačik et al. , 2014). Анализ может быть легко распространен на данные трехмерных (3D) изображений, поскольку существует трехмерный аналог мозаики Вороного. Входными данными для нашего подхода также не обязательно являются данные изображения, но в принципе это может быть пространственно реконструированная нейронная активность на основе электрофизиологических данных, полученных, например, с помощью крупномасштабных многоэлектродных решеток (Hilgen et al., 2017). Другие возможности для интеграции данных включают в себя то, как параметр пространственной автокорреляции соотносится с параллельными измерениями, например, сигналами fMRI BOLD.

Мы рассмотрели парные взаимодействия в нашей модели на основе относительного пространственного положения нейрональных сомат. Хотя нейроны хорошо известны своей способностью передавать сигнал на большие расстояния, между нейронами также существует множество локальных связей, которые особенно важны во время развития нейронов (Luhmann et al., 2016). Кроме того, патологические изменения в свойствах локальной цепи связаны с множественными расстройствами нервного развития и психическими расстройствами (Tatti et al. , 2017). Локальное волнообразное распространение спонтанной активности в пределах одного поля (Дополнительный фильм S1), распространяющееся по крайней мере в 50 раз медленнее, чем потенциал действия, и вовлекающее транссинаптическую передачу сигналов (Раздел 3.2), побудило нас рассмотреть применимость подхода, приоритезирующего размер популяции нейронов на больших расстояниях.

Во всех наших приложениях мы считали, что параметр пространственной автокорреляции ϕ постоянен в пространстве. Это соответствует предположению, что этот компонент активности нейрона одинаков во всем поле зрения. Это предположение кажется правдоподобным для культуры, поскольку в принципе не должно быть отдельных регионов в поле зрения или ориентации на культуру. Как правило, это предположение не будет реалистичным для данных визуализации ткани in vivo или даже ex vivo .Однако, когда поле обзора достаточно мало, как в случае данных ALM (~ 88 ячеек) или 4 областей данных 2pRAM (~ 100 ячеек), это все же может быть разумным предположением. Для данных изображения большего размера наш метод может быть применен с помощью окна по полю зрения, чтобы получить ряд локальных значений ϕ⁠, что, по сути, имело место в случае с четырьмя областями из данных изображения большего размера 2pRAM.

Дополнительным допущением в модели является то, что параметр пространственной автокорреляции был постоянным во времени, то есть сам не изменяется во времени.Предположение о постоянстве ϕ во времени хорошо согласуется с экспериментальной установкой данных MF, поскольку любое изменение ϕ учитывается между окнами сбора данных, а не внутри какого-либо одного окна. Это также не представляет особых проблем для данных ALM, поскольку интерес представляет сравнение сеансов с одинаковыми временными рамками. В более общем плане предположение о постоянстве ϕ во времени также можно было бы рассмотреть в рамках статистики оконного управления для анализа временных рядов, как это было представлено для данных LF и 2pRAM.

Еще один аспект, связанный с параметрами модели, заключается в том, что мы не учитывали ϕtime и параметр точности τ. Основная проблема здесь — вычислительная, поскольку установка ϕtime = 0 приводит к (разреженной) блочной диагональной матрице смежности W , и поэтому добавление сотен временных точек мало влияет на время вычислений. Если мы рассмотрим ϕtime ≠ 0, то матрица смежности будет трехдиагональной, и вычисление определителя станет вычислительно невыполнимым с большим количеством моментов времени.Однако мы показали, что мы все еще можем получить точные оценки для ϕspace, просто удерживая ϕtime = 0 фиксированным. Кроме того, отсутствие учета параметра точности τ упрощает анализ и интерпретацию ϕ, поскольку апостериорная плотность τ в любом случае зависит от ϕ. Исследование ϕtime и τ может быть рассмотрено в дальнейшей работе.

3.6 Реализация в MATLAB и вычислительные затраты

Модель MRF была реализована в MATLAB на MacBook Pro середины 2012 года с 2.Процессор Intel Core i7 с тактовой частотой 6 ГГц (четырехъядерный) и 16 ГБ оперативной памяти. Данные LF были самыми затратными с точки зрения вычислений: 5366 идентифицированных ячеек в одном поле зрения. В этом случае потребовалось ∼15 с для расчета мозаики Вороного и ∼60 с для расчета апостериорной плотности ϕ (с использованием всех 417 временных рамок). Расчет апостериорной плотности для данных 2pRAM занял всего ~ 10 с с использованием всех 6000 временных кадров, поскольку в поле зрения для каждой области находится только ~ 100 ячеек. Мы предоставляем код MATLAB для получения результатов, представленных в статье.

4 Заключение

Мы показали, что модель MRF может количественно определять пространственную автокорреляцию в данных нейронной активности и может применяться к данным, полученным как в экспериментах in vitro , так и in vivo . Сначала мы проанализировали эксперименты по моделированию, чтобы продемонстрировать модель, прежде чем продемонстрировать ее использование для выявления чисто пространственных различий в активности нейронов. Мы рассмотрели доказательство концепции скрининга, где мы количественно оценили изменения нейрональной активности in vitro в ответ на четко определенные условия.Наконец, мы показали, что модель MRF применима к данным экспериментов in vivo и позволяет сделать выводы, согласующиеся с предыдущими анализами. Более того, мы продемонстрировали, как наш подход может обеспечить вывод на основе данных наблюдений за кальцием, который не был получен при анализе подсчета спайков, и, тем не менее, совместим с независимыми, более инвазивными, оптогенетическими экспериментами.

Цель фенотипической количественной оценки соответствует конкретным характеристикам данных, которые мы рассматриваем.То есть анализ совокупной активности больших популяций, состоящих из нескольких тысяч нейронов, а не специфической активности отдельных нейронов. Мы особенно используем пространственные аспекты данных, где «соседи» нейрона в модели основаны на относительном пространственном положении ячеек и соответствующей тесселяции Вороного. Тогда полученная разреженная матрица смежности и предположение марковского моделирования — это то, что позволяет сделать возможный вывод. Рассмотрение всех возможных пар нейронов, как это делается в других местах, в частности, с моделями Изинга, ограничивает анализ только горсткой клеток из-за вычислительных затрат.Мы рассмотрели данные, содержащие до 5366 нейронов (данные LF) и 6000 временных точек (данные 2pRAM). Мы предоставляем данные и код MATLAB, чтобы получить все результаты в статье.

Благодарности

нейронов были щедро предоставлены Лили Ли (Центр биотехнологии Турку). Для этой работы были использованы помещения отделения биоимиджинг-скрининга Турку. Авторы выражают благодарность редактору и рецензенту за ценные комментарии и, в частности, предложения по связанной литературе.

Финансирование

Эта работа была поддержана кафедрой математики и статистики Университета Турку и Финским культурным фондом, Региональным фондом Варсинай-Суоми (SR) и Национальным институтом рака Университета Турку и Национальными институтами здравоохранения (NIH). Грант № R01CA200417 (MJC).

Конфликт интересов : не объявлен.

Список литературы

Абдаллахи

Л.МАМА.

et al. (

2003

)

Оценка параметров в модели для многомерной записи нейронных данных: подход приближения Гиббса

.

Biol. Cybern

.,

89

,

170

—

178

.

Ахмадиан

Y.

et al. (

2011

)

Эффективные методы Монте-Карло с цепями Маркова для декодирования последовательностей нейронных пиков

.

Neural. Расчет

.,

23

,

46

—

96

.

Бадинг

H.

et al. (

1993

)

Регуляция экспрессии генов в нейронах гиппокампа с помощью различных путей передачи сигналов кальция

.

Наука

,

260

,

181

—

186

.

Banerjee

S.

et al. (

2014

) Иерархическое моделирование и анализ пространственных данных , 2-е изд. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press.

Bell

B.S.

,

Broemeling

L.Д.

(

2000

)

Байесовский анализ пространственных процессов применительно к картированию болезней

.

Stat. Мед

.,

19

,

957

—

974

.

Blanquie

O.

et al. (

2017

)

Гомеостатическое взаимодействие между электрической активностью и апоптозом нейронов в развивающемся неокортексе

.

Neuroscience

,

358

,

190

—

200

.

Блумберг

М.С.

,

Дули

J.C.

(

2017

)

Фантомные конечности, нейропротезы и происхождение варианта реализации

.

Trends Neurosci

.,

40

,

603

—

612

.

Breakspear

M.

(

2017

)

Динамические модели крупномасштабной мозговой деятельности

.

Нац. Neurosci

.,

20

,

340

—

352

.

Чен

Т.-W.

et al. (

2016

) Ответы на изображение кальция от нейронов передней боковой моторной коры (ALM) взрослых мышей, выполняющих тактильное поведение решения. CRCNS , DOI: 10.6080 / K04M92GX.

Courtney

M.

et al. (

1990

)

Взаимодействие между деполяризацией плазматической мембраны и активацией глутаматных рецепторов в регуляции цитоплазматического свободного кальция в культивируемых гранулярных клетках мозжечка

.

Дж. Neurosci

.,

10

,

3873

—

3879

.

Cressie

N.

et al. (

2005

)

Оценка на основе правдоподобия для гауссовских MRF

.

Stat. Методол

.,

2

,

1

—

16

.

Cunningham

J.P.

,

Byron

M.Y.

(

2014

)

Снижение размерности для крупномасштабных нейронных записей

.

Нац. Neurosci

.,

17

,

1500

—

1509

.

Де Оливейра

В.

(

2012

)

Байесовский анализ моделей условной авторегрессии

.

Ann. Inst. Стат. Математика

.,

64

,

107

—

133

.

Doucet

M.V.

et al. (

2012

)

Комплекс PSD-95 / nNOS: новые лекарства от депрессии?

Pharmacol. Ther

.,

133

,

218

—

229

.

Дравид

S.M.

,

Мюррей

T.F.

(

2004

)

Спонтанные синхронизированные колебания кальция в нейронах неокортекса в присутствии физиологических [Mg (2+)]: вовлечение AMPA / каинатных и метаботропных рецепторов глутамата

.

Brain Res

.,

1006

,

8

—

17

.

Fernandes

D.

,

Carvalho

A.L.

(

2016

)

Механизмы гомеостатической пластичности в возбуждающем синапсе

.

J. Neurochem

.,

139

,

973

—

996

.

François

O.

et al. (

2000

)

Статистические процедуры для пространственно-временных нейронных данных с приложениями к оптической записи слуховой коры

.

Neural. Расчет

.,

12

,

1821

—

1838

.

Гельфанд

А.Е.

,

Вунацу

П.

(

2003

)

Правильные многомерные условные авторегрессионные модели для анализа пространственных данных

.

Биостатистика

,

4

,

11

—

15

.

Гулледж

A.T.

,

Стюарт

G.J.

(

2003

)

Возбуждающее действие ГАМК в коре головного мозга

.

Нейрон

,

37

,

299

—

309

.

Hilgen

G.

et al. (

2017

)

Неконтролируемая сортировка пиков для крупномасштабных многоэлектродных решеток с высокой плотностью

.

Cell Rep

.,

18

,

2521

—

2532

.

Hill

M.R.

et al. (

2015

)

Количественная оценка и классификация нейронных ответов на сглаженных ядром гистограммах перистимула во времени

.

J. Neurophysiol

.,

113

,

1260

—

1274

.

Jacobs

K.

et al. (

2000

)

Эпилепсия после поражения: предельная пластичность мозга

.

Эпилепсия

,

41

,

S153

.

Кресс

G.J.

et al. (

2008

)

Высокий порог, проксимальная инициация и медленная скорость проведения потенциалов действия в мшистых волокнах нейрона зубчатых гранул

.

J. Neurophysiol

.,

100

,

281

—

291

.

Куцарова

Е.

и др. (

2017

)

Правила формирования нейронных связей в развивающемся мозге

.

Фронт. Нейронные схемы

,

10

,

111.

Leighton

A.H.

,

Lohmann

C.

(

2016

)

Соединение развивающихся сенсорных цепей — от структурированной спонтанной активности до механизмов синаптической пластичности

.

Фронт. Нейронные схемы

,

10

,

71.

Li

L. -L.

et al. (

2013

)

Путь nNOS-p38MAPK опосредуется NOS1AP во время гибели нейронов

.

J. Neurosci

.,

33

,

8185

—

8201

.

Li

L.-L.

et al. (

2015

)

Неожиданное гетеродивалентное рекрутирование NOS1AP в nNOS обнаруживает множественные места для фармакологического вмешательства в моделях нейрональных заболеваний

.

J. Neurosci

.,

35

,

7349

—

7364

.

Li

N.

et al. (

2015

)

Схема моторной коры для планирования моторики и движения

.

Природа

,

519

,

51

—

56

.

Luhmann

H.J.

et al. (

2016

)

Спонтанная нейронная активность в развитии неокортикальных сетей: от отдельных клеток до крупномасштабных взаимодействий

.

Фронт. Нейросхемы

,

10

,

40.

Макаренко

В.И.

et al. (

1997

)

Новый подход к анализу многомерной нейронной активности: марковские случайные поля

.

Нейронная сеть

.,

10

,

785

—

789

.

Mazzucato

L.

et al. (

2016

)

Стимулы снижают размерность корковой активности

.

Фронт. Syst. Neurosci

.,

10

,

11.

Nirenberg

S.H.

,

Victor

J.D.

(

2007

)

Анализ активности больших популяций нейронов: насколько разрешима проблема?

Curr.Мнение. Нейробиол

.,

17

,

397

—

400

.

Окунь

М.

и др. (

2015

)

Разнообразная связь нейронов с популяциями сенсорной коры

.

Природа

,

521

,

511

—

515

.

Онкен

А.

и др. (

2016

)

Использование матричной и тензорной факторизации для однократного анализа последовательностей всплесков популяции

.

PLOS Comput. Биол

.,

12

,

e1005189.

Pawlak

V.

et al. (

2005

)

Нарушение синаптического масштабирования в нейронах гиппокампа мышей, экспрессирующих рецепторы NMDA с пониженной проницаемостью для кальция

.

J. Physiol

.,

562

,

771

—

783

.

Pratt

K.G.

et al. (

2016

)

Эволюционно законсервированный механизм развития зрительной цепи, зависимого от активности

.

Фронт. Нейронные схемы

,

10

,

79.

Ren

C.

,

Sun

D.

(

2013

)

Объективный байесовский анализ для моделей CAR

.

Ann. Inst. Стат. Математика

.,

65

,

457

—

472

.

Роуди

Y.

et al. (

2009

)

Парные модели максимальной энтропии для изучения больших биологических систем: когда они могут работать, а когда нет

.

PLOS Comput. Биол

.,

5

,

e1000380.

Rue

H.

,

Held

L.

(

2005

)

Гауссовские марковские случайные поля: теория и приложения

.

Бока-Ратон, Флорида

:

CRC Press

.

Schmidt-Hieber

C.

et al. (

2008

)

Инициирование и распространение потенциала действия в аксонах мшистых волокон гиппокампа

.

J. Physiol

.,

586

,

1849

—

1857

.

Schneidman

E.

et al. (

2006

)

Слабые парные корреляции подразумевают сильно коррелированные состояния сети в нейронной популяции

.

Природа

,

440

,

1007

—

1012

.

Шарма

P.

et al. (

2012

)

Высокопроизводительный скрининг первичных нейронов

.

Методы Энзимол

.,

506

,

331

—

360

.

Шленс

J.

et al. (

2006

)

Структура паттернов возбуждения нескольких нейронов в сетчатке приматов

.

J. Neurosci

.,

26

,

8254

—

8266

.

Sigler

A.

et al. (

2017

)

Формирование и поддержание функциональных шипов в отсутствие пресинаптического высвобождения глутамата

.

Нейрон

,

94

,

304

—

311

.

Смит

S.L.

,

Häusser

M.

(

2010

)

Параллельная обработка зрительного пространства соседними нейронами зрительной коры головного мозга мыши

.

Нац. Neurosci

.,

13

,

1144

—

1149

.

Sofroniew

N.J.

et al. (

2016

)

Двухфотонный мезоскоп с большим полем зрения и субклеточным разрешением для визуализации in vivo

.

Элиф

,

5

,

e14472.

Tatti

R.

et al. (

2017

)

Нейрофизиология и регулирование баланса между возбуждением и торможением в контурах неокортекса

.

Biol. Психиатрия

,

81

,

821

—

831

.

Ткачик

Г.

и др. (

2014

)

Поиск коллективного поведения в большой сети сенсорных нейронов

.

PLOS Comput. Биол

.,

10

,

e1003408.

Чжо

М.

(

2008

)

Корковое возбуждение и хроническая боль

.

Trends Neurosci

.,

31

,

199

—

207

.

© Автор (ы) 2018. Издано Oxford University Press. Все права защищены. Для получения разрешений обращайтесь по электронной почте: journals. [email protected]

Использование подпороговых событий для характеристики функциональной архитектуры электрически связанной сети нижних олив

Существенные изменения:

Эксперименты и моделирование выполнены хорошо, анализы интересны, а выводы исследования потенциально очень важны.Есть несколько опасений по поводу основных результатов — происхождения IRE и сетевого анализа (нейронного кластера), который необходимо рассмотреть при пересмотре. Подробные комментарии рецензентов усиливают эти основные необходимые изменения, описанные ниже; при пересмотре основное внимание следует уделять этим основным моментам, а не незначительным различиям в комментариях рецензента.

Спасибо за обнадеживающий ответ. Рецензенты проделали тщательную работу, которая завершилась важными комментариями, которые, несомненно, приведут к значительному улучшению презентации и заключений этого исследования.В отредактированной рукописи мы реорганизовали описание данных, существенно расширили описание статистических методов, используемых для фармакологического лечения и подхода к моделированию, и сделали все возможное, чтобы ответить на все комментарии рецензентов. Тем не менее, это исследование представляет собой попытку изучить структуру электрически связанных сетей путем анализа подпороговых событий, которые представляют электрическую связь. Таким образом, основной проблемой является идентификация этих событий. В наших записях нейронов нижних олив мы встретили электрически связанные колоски, а также другие подпороговые события, IRE, которые необходимо было идентифицировать, прежде чем исключить их из анализа.Мы предполагаем, что они представляют собой регенеративные ответы в шипах, которые расположены в начальном сегменте аксона. Мы согласны с тем, что это «важное новое открытие», которое требует тщательного изучения. Фактически, мы начали новое направление исследований, в котором анатомические, физиологические и методы визуализации будут использоваться для проверки нашего предположения о происхождении этих событий. Таким образом, в настоящее время мы можем предоставить только анекдотические наблюдения за шипами на аксоне мыши. Тщательное изучение распределения спайков во многих нейронах, а также корреляция между количеством шипов и количеством IRE в данном нейроне и специфической активацией этих шипов абсолютно необходимы и не могут быть предоставлены на данном этапе. Тем не менее, мы постарались ответить на комментарии рецензентов и надеемся, что они получат ваше одобрение.

1) Все рецензенты согласны с тем, что синаптическая фармакология должна быть лучше как для IRE, так и для рассказов о колосках. Авторы заявляют, что они протестировали 19 ячеек в CNQX / APV, поэтому, возможно, все, что осталось, — это провести более подробный анализ и задокументировать его в документе.

В отредактированной рукописи мы предоставили лучшее и более полное описание фармакологических экспериментов.Сначала мы сравнили частоту возникновения спонтанных событий, демонстрируя, что, хотя частота колосков резко снижена (n = 9 клеток), IRE полностью отсутствуют (n = 4 клетки). Как было предложено, мы добавили подробное описание влияния синаптических блокаторов на форму колосков и появление вызванных колосков (Рисунок 2 — дополнение к рисунку 1; Рисунок 6 — приложение к рисунку 1), чтобы показать, что снижение частоты происходит из-за снижение возбудимости сети, и не потому, что некоторые из регистрируемых нами колосков имеют синаптическое происхождение.

IRE, которые являются внутренними событиями, не встречаются в присутствии синаптических блокаторов, но также не имеют синаптического происхождения, как показано на рисунке 2 (рисунок 3 в исходной рукописи). Поскольку большая часть потенциалов действия в нейронах IO запускается IRE, в присутствии синаптических блокаторов частота потенциалов действия сильно снижается, а значит, и частота колосков. Однако колоски все еще могут быть вызваны синаптическими блокаторами, когда потенциалы действия вызываются в связанной клетке (рисунок 6 — рисунок в приложении 1).

Мы изменили порядок появления рисунков 2 и 3 оригинальной рукописи, чтобы объяснить и обсудить эти результаты.

2) Действительно ли аксональные шипы так же обычны и красивы в клетках мыши, как показал Де Зеув у кошек? Авторы уже имели заполненные красителем IO-клетки мыши, но не показали их в статье. Эти иглы должны быть задокументированы в документе (уровень LM), и, возможно, эти данные уже доступны.

Изображение ответа автора 1 представляет собой рисунок, показывающий шипы аксонов оливарного нейрона мыши с использованием процедуры редкой вирусной маркировки (A).Область, где аксон ответвляется от сомы, показана в большом увеличении (B) и схематически изображены шипы аксонов (C). При необходимости этот рисунок может быть добавлен как дополнительный. На данном этапе мы не можем предоставить более подробное описание шипов аксонов, поскольку идентификация аксона в IO-клетках — непростая задача из-за обширных бифуркаций дендритов и тенденции аксонов выходить из дендрита.

3) Могут ли авторы предоставить более прямые доказательства того, что IRE происходят от шипов? Моделирования недостаточно, особенно когда мы даже не знаем, существуют ли аксонные шипы.Большинство людей считают, что спайки инициируются в начальных сегментах аксона из-за высокой плотности там Na-каналов, и есть хорошие маркеры для начальных сегмент-специфичных белковых комплексов (например, иммуно для анкирин-G или самих Na-каналов). Такой демонстрации в аксональных шипах (уровень LM) было бы достаточно. Лучшая электрофизиология (извлечение глутамата, запись аксонов) также была бы замечательной, но, вероятно, потребовала бы слишком много времени для проверки.

Как было сказано выше, мы работаем над этой проблемой, но в настоящее время не можем предоставить эту информацию.Мы надеемся, что демонстрации их существования будет достаточно для настоящего отчета.

4) Что касается функционального значения IRE, авторы никогда не упоминают, запускают ли эти большие подпороговые IRE события, распространяемые электронным путем (маленькие колоски?) В связанных клетках. Это данные, которые авторы уже должны иметь из своих парных записей. В общем, совсем не ясно, как IRE, колоски, спонтанные колебания и полные спайки взаимодействуют в связанных сетях нейронов IO; авторы должны представить более целостный взгляд на то, как взаимодействуют все эти мембранные события.

В рукописи мы специально сообщили, что при парной записи мы никогда не встречали коррелированного сигнала с IRE. Фактически, это было нашим основным побуждением к поиску альтернативной возможности. Если бы IRE происходили на дендритном уровне, они должны были привести к гораздо более высокому сигналу в постсоединительном нейроне. Мы добавили более четкое описание этой проблемы в раздел «Результаты».

Мы добавили наш целостный взгляд на взаимодействие между этими событиями в Обсуждение.

5) Другая важная и потенциально интересная, но проблематичная часть статьи касается колосков, сцепления и кластеризации. Авторы, возможно, смогут усилить это, не проводя дополнительных экспериментов, если они смогут решить некоторые технические проблемы, поднятые в обзорах (о ясности описания, порогах шума и обнаружения, альтернативных схемах подключения в модели, статистической надежности соответствия кривой моделирования. , так далее).

Мы решили все технические проблемы, как было предложено рецензентами, перечисленными в каждом конкретном пункте ниже.

Рецензент №1:

Есть несколько проблем:

— В статье два раздела: анализ подпороговых ответов и использование колосков для анализа сетевых подключений. Хотя первый раздел читается очень хорошо, у меня возникли проблемы с переходом на сетевой анализ. Я нашел два предложения в начале параграфа два подраздела «Оценка сетевой архитектуры на основе двухячеечной записи одновременно встречающихся колосков» очень запутанными.Пришлось читать их несколько раз. Имеется мало информации о том, как общие амплитуда и соотношение колосков используются для создания групп. Хотя я понимаю эту идею, детали мне до сих пор не ясны. Критерии и полезность этих значений для группировки колосков должны быть явными и не позволять читателю гадать.

Мы перефразировали эти предложения в разделе «Результаты» и в разделах «Материалы и методы».

— Связывание между нижними оливарными нейронами является гетерогенным, и одна клетка может дифференциально соединяться со своими соседями. Я не уверен, как это повлияет на анализ, проведенный авторами, в частности, на соотношение обычных колосков. Была ли учтена неоднородность связи в компьютерном моделировании? Авторы должны решить эту проблему.

Мы не уверены, относится ли комментарий к неоднородной силе связи или к неоднородному количеству нейронов, которые связаны с каждым нейроном. В модели количество подключенных нейронов было неоднородным (рис. 8C). Проводимость каждого щелевого соединения была идентична, но положение на дендритном дереве, а также морфология и свойства мембран клеток были разными, что создавало неоднородность колосков, как показано на рисунке 8B и на рисунке в ответ на комментарий рецензента №3 5 .

— Я предлагаю сделать заголовок специфичным для низшей оливы, возможно, «Использование подпороговых событий для характеристики функциональной архитектуры низшей оливы». Хотя количество связанных клеток не было неожиданностью и согласуется с предыдущими отчетами с использованием другой методологии, анализ, выполненный авторами, дает дальнейшее понимание организации сетей (способствует существованию компартментов функционально связанных нейронов), и это должно быть отражено. в названии.Кроме того, хотя это теоретически возможно, неясно, можно ли использовать этот метод для анализа других, менее известных сетей. Предлагают ли авторы этот метод применять в других сетях? Если да, им следует отдельно обсудить этот момент в разделе «Обсуждение».

Благодарим рецензента за предложенное название. Мы изменили название, чтобы быть более конкретным для низшей оливы: «Использование подпороговых событий для характеристики функциональной архитектуры электрически связанной сети низшей оливы».

Кроме того, актуальность нашего подхода к другим сетям была добавлена ​​в последний раздел раздела «Обсуждение».

Рецензент № 2:

У меня есть несколько предложений по улучшению рукописи:

— Частота всплесков IO-ячеек была приблизительной, и, следовательно, возможный источник систематической ошибки. Хотя авторы действительно говорят, что они оценивали частоту возникновения спонтанных медленных событий, а не скорость всплеска зарегистрированных клеток, поскольку на них влияет внутриклеточный раствор, мне интересно, в какой степени оценки изменчивости и частоты Частота стрельбы клеток определяется записью, прикрепленной к клеткам.

Комментарий нам непонятен. Чтобы избежать артефактов пиковой активности из-за процедуры записи, мы оценили скорость возбуждения по частоте общих колосков, которые отражают активность в отдельных клетках, не нарушенных записью. В наших экспериментах мы не использовали записи с привязкой к клеткам.

— Что касается источника быстрых спонтанных событий, или «внутренних регенеративных событий (IRE)», авторы находят, что эти IRE не зависят от щелевых соединений, а происходят от шипов в аксонном холмике клетки.Я считаю эту гипотезу вполне правдоподобной и привлекательной, но мне интересно, можно ли провести дополнительные электрофизиологические эксперименты, с извлечением глутамата из каркаса или, возможно, с применением глутамата или AMPA с помощью вторичной пипетки с «выдуванием». Это могло бы подтвердить эффекты этих «перекрывающих» аксональных шипов на нейроны IO. В частности, было бы неплохо увидеть эксперимент с прямой и / или одиночной стимуляцией аксональных шипов.

См. Ответ на пункт № 3 редактора.

— Авторы предполагают, что амплитуды IRE в основном определяются длиной шеи. Однако мне интересно, почему наблюдаемые амплитуды не распределены нормально, а имеют форму синусоиды (см. Рисунок 1B). Я предполагаю, что длины шеи позвоночника будут распределены нормально. Если предположить, что более высокие амплитуды являются результатом суммирования, тогда мне интересно, почему синусоида такая чистая (потому что переменная длина шейки снизит точность формы синусоиды, так как отдельные события, составляющие суммированное событие, будут больше также переменная).Кроме того, как упоминается в тексте, De Zeeuw et al., 1990 показали, что до 8 шипов отходят от начального сегмента аксона. Не ожидали бы авторы большего разброса амплитуд, если бы это было так?

Действительно, квантово-подобное распределение — интересное наблюдение, однако оно наблюдалось не во всех ячейках. Изображение ответа автора 2 (A) представляет собой другой пример, в котором амплитуды распределены неравномерно.

Мы не предполагаем, что более высокие амплитуды являются результатом суммирования, поскольку это влечет за собой, что оба шипа иннервируются одним и тем же аксоном.Мы действительно наблюдали очень мало IRE, где четко наблюдался перерыв во времени нарастания (стрелка в B). Мы предполагаем, что это результат суммирования активности двух шипов. Однако эти IRE не были включены в анализ.

Мы не ожидаем большего разброса амплитуд, так как согласно De Zeeuw et al., 1990 обнаруживается до 8 шипов, некоторые из них получают только ГАМКергическую иннервацию, что не приводит к IRE.

— Учитывая, что медленные колоски преимущественно встречаются поверх STO, учитывая, что потенциалы действия в одной клетке часто приводят к колоскам в электронно связанных клетках, и учитывая, что IRE часто вызывают потенциалы действия, разве авторы не ожидали бы большего количества колосков вне нормальное СТО-колосок-окошко? Или авторы предполагают, что афференты к аксонным шипам каким-то образом также находятся под влиянием STO? Или эффекты ИРЭ зависят от фазы подпороговых колебаний? Если бы это было так, не было бы несколько затруднено функционирование возникающего индуктора потенциала действия, который исключает дендритный ввод?

Как показано на Рисунке 2H (бывший Рисунок 3H), в отличие от колосков, частота IRE зависит от мембранного потенциала, таким образом, IRE с меньшей вероятностью может быть вызвана на дне STO. Более того, менее вероятно, что IRE вызовет потенциал действия во впадине колебаний. Таким образом, хотя кажется, что «афференты к шипикам аксонов каким-то образом также подвержены влиянию STO», вероятно, это результат чувствительности к напряжению этих событий.

— Существует зависимость между основными колебаниями и количеством медленных колосков. Однако колоски будет труднее обнаружить в фазах крутого подъема колебаний. Как авторы справились с этим потенциальным препятствием?

Колоски в осцилляторных трассах были обнаружены после вычитания трассы, отфильтрованной нижними частотами, из необработанной трассы.Таким образом можно было легко обнаружить даже небольшие колоски на переднем и заднем фронтах. Мы добавили эту разборку в раздел «Материалы и методы» «Анализ данных и статистика».

— Распределение данных об амплитудах и времени, вероятно, ненормально, поэтому может быть лучше сообщать медианы и квартили, а не средние и стандартные отклонения по всей статье.

Согласно критерию нормальности Шапиро-Уилка, некоторые распределения являются нормальными или близкими к нормальным, а соотношение медиана / среднее в некоторых случаях> 0.95 и в других> 0,9. Расчет медианы и квартилей дал следующие результаты, которые не сильно отличаются от среднего + std:

Время нарастания быстрого события 1,4 ± 0,4 мс (медиана 1,333)

Продолжительность 4,2 ± 1,3 мс (медиана 3,86)

Время нарастания медленных событий 2,5 ± 0,6 мс (медиана 2,4)

Продолжительность 12,7 ± 3,9 мс (медиана 12,6)

Таким образом, мы предпочитаем использовать описание mean + std, поскольку оно более читабельно. Если все еще необходимо, мы с радостью заменим все номера.

— Мне не хватает графика распределения амплитуд STO, особенно в контексте утверждения, что щелевые переходы необходимы для спонтанных колебаний. Наше текущее понимание клеточных механизмов, генерирующих колебания, предполагает, что STO могут генерироваться в нескольких ячейках с высокой амплитудой, при этом другие клетки либо сообщают об этих колебаниях, либо действительно участвуют в них. Возможно, в сети, в которой ячейки соединены щелевыми соединениями, существует комбинация этих двух явлений.Фактически, Leznik и Llinas, 2004, показали, что STO поддерживаются в отдельных ячейках после блокировки щелевого соединения, хотя синхронизация сети нарушается. Итак, на мой взгляд, это комбинация, в которой уровень связи будет способствовать уровню STO, в то время как связь не является абсолютно необходимой.

— В рукописи создается впечатление, что клетки либо колеблются, либо нет, тогда как в литературе сообщается о промежуточных клетках «условных осцилляторах». Это важный момент, поскольку анализ динамической системы показывает, что неколеблющуюся ячейку можно быстро заставить колебаться при возмущении (Schweighofer et al., 1999).

— Хотя вполне вероятно, что колебания усиливаются связью, «сетевые колебания» в пару мВ могут быть просто считыванием осцилляторов высокой амплитуды. Пожалуйста, обсудите этот момент более подробно.

Эти комментарии озадачивают нас. Действительно, механизм генерации STO в оливковом ядре обсуждается, но это не является предметом настоящего исследования. В анализе, показанном на рисунке 6 (бывший рисунок 2), где использовались только стабильные колеблющиеся клетки, мы использовали появление колосков как показатель того, что в этой электрически связанной сети все связанные нейроны колеблются с одинаковой частотой, что согласуется с различные взгляды на источник колебаний ввода-вывода и далее не обсуждаются.

— Было бы неплохо увидеть симуляцию с двумя альтернативными сценариями подключения. Один с меньшим количеством соединений, другой с большим — последнее отражает возможный сценарий в неповрежденном препарате.

Мы не уверены, полностью ли понимаем комментарий. В ответе на комментарий 6 рецензента №3 мы представляем больше сценариев подключения.

Рецензент № 3:

Эксперименты и моделирование были выполнены хорошо, анализ интересен, а выводы исследования потенциально важны. Если небольшие шипообразные события действительно происходят из шипообразных структур на начальном сегменте аксона, это было бы новым и уникальным наблюдением, насколько мне известно. Если спайклеты, генерируемые электрическими синапсами, можно будет использовать для надежной оценки размера и структуры кластеров нейронов, связанных с щелевыми соединениями, это станет важным вкладом в нейробиологию IO и, возможно, в более широком смысле. Однако, как здесь представлено, я не думаю, что оба вывода убедительно подтверждаются доказательствами.

1) Это исследование полностью основано на свойствах небольших подпороговых событий, поэтому четкое описание их характеристик имеет решающее значение.Вопрос первого порядка заключается в том, представляет ли какое-либо из этих событий химический синаптический ввод. Они ВПСП? Они вызваны EPSP? Ответы здесь расплывчаты. Авторы сообщают, что применение CNQX снизило частоту «унитарных униполярных событий» в среднем с 0,7 Гц до «ниже 0,02 Гц» (параграф 1 результатов), но подробностей не приводится. Эта контрольная скорость, по-видимому, была взята из большой группы клеток, а не из 19 клеток, на которые наносили лекарство. Авторы должны правильно сообщить данные с измерениями одних и тех же нейронов до и после CNQX.Они также должны сообщать характеристики подпороговых событий, оставшихся после CNQX, включая амплитуды и кинетику, и сравнивать их с событиями, происходящими в тех же клетках в отсутствие препарата. Позже авторы говорят, что быстрые события «не зависят от химической передачи», но они не приводят никаких доказательств этого. Все это связано с ключевым вопросом: какой вклад ВПСП вносят в подпороговые события и их свойства?

См. Развернутый ответ на комментарий редактора 1.

2) Все ли данные на Рисунке 1 были записаны в отсутствие CNQX? Если ответ положительный, и CNQX снизил частоту этих подпороговых событий на 97% (см. Предыдущий комментарий), то не следует ли ожидать, что большая часть подпороговых событий будет спонтанными ВПСП, а не колосками?

Да, CNQX не использовался ни в одном из нейронов, представленных на рисунке 1. Уменьшение количества колосков под действием CNQX объясняется уменьшением возбуждения в сети.Мы добавили новый дополнительный рисунок (рисунок 2 — рисунок в приложении 1) и обсудили проблему далее в разделе «Результаты».

3) Запись и анализ подпороговых событий ограничены порогами обнаружения и отношениями сигнал / шум. Некоторые из событий (колоски и, возможно, IRE), по-видимому, слишком малы, чтобы их можно было увидеть. Это имеет значение для выводов, которые можно сделать из записей, включая оценки размера кластера связанных нейронов. Уровни шума здесь не сообщаются.Моделирование авторов может предоставить оценки пределов их обнаружения с учетом ограничений отношения сигнал-шум и, возможно, поддержать надежность их оценок кластеров. Авторы должны обсудить этот вопрос.

Мы согласны с тем, что анализ ограничен отношением сигнал / шум. Действительно, мы обсуждали, что наши результаты, вероятно, будут недооценкой числа колосков и общих групп. Однако это ограничение могло лишь существенно повлиять на наш вывод о том, что подключение организовано в кластеры.Чтобы проверить, будет ли это препятствовать нашей способности отвергать конфигурацию, зависящую от расстояния, мы уменьшили вдвое (6 пар) количество пар без общих групп и равномерно распределили эти 6 пар в общих группах (см. Изображение ответа автора 3). Эти модифицированные данные по-прежнему отвергают модель, зависящую от расстояния (A, значение p <0,002) и поддерживают организацию кластера (B, значение p> 0,05). Кроме того, следует отметить, что в случае 12 пар, не имеющих общих групп, мы тщательно проверили, что спайклеты в одной ячейке никогда не совпадают с каким-либо изменением напряжения в другой ячейке.

4) Как говорят авторы (дважды), происхождение IRE «остается загадкой». Доказательства того, что маленькие колоски являются постсинаптическим результатом пресинаптического потенциала действия, проходящего через электрические синапсы, весьма убедительны. Дымящийся пистолет взят из записей парных клеток, которые были продемонстрированы различными лабораториями много лет назад.Однако доказательства того, что более крупные и быстрые «IRE» возникают в шипах аксонов, смежных с сомой, являются слабыми, предполагаемыми и косвенными.

Результаты моделирования IRE наводят на размышления, но я согласен с авторами в том, что «места и механизм генерации IRE полностью не решены». На самом деле, без дополнительных экспериментальных доказательств, я не считаю эту часть истории убедительной. Это, конечно, не соответствует преувеличению в абстракции: «быстрые события представляют собой регенеративную реакцию в уникальных возбудимых шипообразных структурах в бугре аксона».Во-первых, неясно даже, существуют ли аксонные шипики в IO клетках мыши. Если да, то их следует проиллюстрировать. Авторы ссылаются на оригинальные данные по аксональным шипам от De Zeeuw, но эта работа была проведена на нейронах кошек. Во-вторых, некоторые более прямые доказательства местонахождения генерации IRE помогли бы сделать вывод убедительным, например прямые записи из начальных сегментов аксона или шипов с использованием электродов или фотоиндикаторов, или молекулярные / структурные демонстрации натриевых каналов высокой плотности в шипах аксонов.

Мы полностью согласны с тем, что источник и механизм IRE далеко не убедительны и потребуют тщательной работы, которой мы сейчас занимаемся. Однако, чтобы решить, следует ли включать или исключать IRE из анализа организации электрически связанной сети, мы должны были предоставить достаточно указаний на то, что они не представляют потенциалы электрической связи. Мы добавили предварительное наблюдение о существовании аксональных шипов в IO-клетках мыши и изменили формулировку в аннотации.См. Наш подробный ответ на комментарий редактора №2.

5) Анализ групп «общих колосков» в парных записях (рис. 7) как способ сделать вывод о размере электрически связанных кластеров клеток интересен и умен. Однако мне интересно узнать об ограничениях данных и их значении для оценок размера кластера. Проиллюстрирован один пример пары, из которой были заявлены четыре группы общих колосков (рис. 7E). Амплитуды колосков, конечно, небольшие и изменчивые, и выборки общих (и необычных) колосков в каждой ячейке также были небольшими (всего два в примере пары).В материалах и методах нет четкого определения статистической надежности такой формы кластерного подсчета. Например, два кластера колосков справа на рис. 7E для меня не сильно отличаются, особенно с учетом того, что образцы такие маленькие, а размеры / формы колосков очень разные. Распределение размеров колосков на Рисунке 1 также подразумевает большую и непрерывную дисперсию (а не пиковые распределения, показанные для IRE). Слабые критерии кластеризации колосков могут привести к завышенным оценкам размера электрически связанных кластеров. Показанная пара ячеек (рисунок 7E) имеет одно из наименьших количеств предполагаемых соединений (рисунок 7F). Кажется, что проблема определения отдельных общих кластеров колосков (и оценки связей) также должна возрастать по мере увеличения количества кластеров в ячейке. Этот вопрос требует более строгого обоснования и обсуждения.

Мы согласны с рецензентом, что неправильная кластеризация колосков будет препятствовать нашей оценке связанных ячеек, и по этой причине мы приложили все усилия, чтобы разработать анализ, который будет правильно кластеризовать трассы.Верно, что, как показано на рисунке 1, распределение амплитуд колосков велико. Однако если взять 3 параметра: амплитуда общего колоска в первой ячейке; амплитуда общего колоска во второй ячейке; Разница между двумя амплитудами дает очень четкие скопления колосков.

И в экспериментальной, и в моделирующей части мы изначально использовали алгоритм кластеризации DBSCAN для кластеризации общих колосков в соответствии с их пиковыми амплитудами и различиями между амплитудами. Однако, хотя алгоритм хорошо работает для модели, он менее идеален для зашумленных экспериментальных трасс, хотя количество групп, обнаруженных алгоритмом, существенно не отличалось от ручного курирования. На изображении ответа автора 4 мы сравниваем ручное курирование с результатами DBSCAN в другой паре примеров. В то время как схожесть двух режимов анализа четко видна, алгоритм предсказал 7 групп, тогда как ручной анализ привел к 6 группам. Во-первых, очевидно, что ручное курирование более точное.Во-вторых, как мы продемонстрировали выше (ответ на комментарий 3), небольшое изменение числа общих групп не повлияло на значимость нашего утверждения.

В примере, показанном на рисунке 7, два правых кластера действительно имеют похожие черные следы, но красные следы можно легко сгруппировать в два разных кластера в соответствии с их амплитудами. Мы выбрали этот пример, поскольку считаем, что это простой пример для объяснения нашего методологического подхода.

Мы добавили более четкое описание анализа в раздел «Материалы и методы».

Результаты моделирования на рисунке 8 в некоторой степени проверяют анализ, показанный на рисунке 7, путем изменения периода выборки и частоты срабатывания. Однако смоделированные данные выглядят гораздо менее изменчивыми (по амплитуде), чем реальные данные (см., Например, рисунок 8B с 7B и E). Из описаний я также делаю вывод, что в модельной сети не было шума.

Действительно, в примере, приведенном на рис. 8, есть небольшие различия, однако это не было общей чертой, как показано в другом примере на изображении ответа автора 5. Разница в амплитуде колосков возникла из-за разницы в расположении GJ и морфология клеток и свойства мембран. Также был шум, возникающий из-за разницы в средней скорости срабатывания ячеек, эффект, который мы количественно оценили на Рисунке 8 — добавлении к рисунку 1. Шум не добавлялся к графикам напряжения.

6) Моделирование на Рисунке 8 не обеспечивает убедительной поддержки гипотезы авторов о кластеризации связности щелевых соединений по сравнению с простой зависимой от расстояния моделью связи. Похоже, это сводится к еще одному сопоставлению оценок, полученных в результате анализа колосков на Рисунке 7, с результатами модели (Рисунок 8).В частности, авторы приходят к выводу, что модель расстояния «не смогла воспроизвести распределение общих групп, обнаруженное экспериментально (рис. 8F)», тогда как модель кластеризации «воспроизвела зависящую от расстояния вероятность соединения (рис. 8H)». На мой взгляд, посадки на рис. 8F и H кажутся примерно одинаково хорошими (или плохими). Интересно, что авторы приходят к выводу, что соответствие измерениям данных на рис. 8E и H примерно одинаково хорошо, но, на мой взгляд, соответствие на рис. 8H выглядит примерно так же хорошо (или плохо), как и на рис. 8F и H.Другими словами, результаты моделирования кажутся очень слабым доказательством выбора между этими сценариями кластерной зависимости или сценариями зависимости от расстояния.

В этом отношении может показаться, что экспериментальные исследования связывания индикаторов между IO-клетками (как у Devor and Yarom, 2004; Placantonakis et al., 2006; Hoge et al., 2011) на тех же срезах, что и анализируемые с помощью Общий метод колосков был бы более надежным способом определить, является ли электрическая связь случайной / зависимой от расстояния или определяется кластеризацией.

Спасибо за комментарий. Мы провели полный статистический анализ по этому вопросу, который обсуждается в новом разделе «Материалы и методы» и на дополнительном рисунке (рисунок 8 — рисунок в приложении 2).

Короче говоря, мы добавили значение p для рис. 8F и 8I (<0,002 для 8F и 0,907 и 0,125 для черного и серого 8I, соответственно). А также для рисунков 8E и H (все> 0,05).

Кроме того, в оригинальной рукописи мы протестировали общее групповое распределение только для одной конфигурации связи, зависящей от расстояния.Здесь мы подтвердили, что наши результаты не ограничиваются только этой конкретной дистанционно-зависимой конфигурацией, на что также указали два других рецензента. На изображении ответа автора 6 представлен анализ связности сетей с различной вероятностью связности, зависящей от расстояния (слева), в котором Σ и σ (см. Материалы и методы, матрицы связности) различны, а также соответствующее распределение общих соседей (справа). Для всех этих конфигураций подключения значения p для общего распределения соседей были <0.05.

7) Авторы обсуждают возникновение «обычных колосков», но мало говорят о IRE и электрическом взаимодействии. Что происходит в электрически связанной ячейке, когда IRE возникает в парной ячейке? Можно ли вообще обнаружить эти события? В Обсуждении просто говорится: «IRE в одном нейроне никогда не совпадало с колоском в другом нейроне», но я не верю, что в статье говорится, что действительно совпадает с IRE.

Мы не наблюдали каких-либо событий или изменений мембранного потенциала в одной клетке, в то время как IRE проявлялась в другой клетке, а также мы не наблюдали IRE в одной клетке из-за пика в другой клетке. Эти данные в значительной степени подтверждают гипотезу о том, что IRE не вызываются в дендритах, поскольку они будут проходить через щелевые соединения к связанным нейронам. Это действительно была наша причина искать другую возможность происхождения IRE после того, как мы отклонили возможность прямых-косвенных колосков, которая представлена ​​на рисунке 4 — рисунок в приложении 1.Этот момент был подробно рассмотрен в разделе «Результаты» и «Обсуждение».

[Примечание редакции: до принятия были предложены дальнейшие исправления, как описано ниже. ]

Основным изменением текущего представления является полное удаление аксональных шипов и сосредоточение внимания на организации сети.

В текущей версии мы также ответили на комментарии рецензента:

а) Провел новую серию фармакологических экспериментов, показавших, что быстрые события блокируются синаптическими блокаторами, тогда как колоски все еще присутствуют и, следовательно, могут отражать электрическую связь.Как отмечали авторы обзора, тот факт, что частота колосков значительно снижается под действием лекарств, может предполагать, что некоторые из медленных подпороговых событий могут быть химическими синаптическими событиями, что может поставить под сомнение использование спонтанных событий для изучения сетевой организации. . Чтобы решить эту проблему, мы сначала сравнили спонтанные колоски с вызванными (в парных записях) и показали их сходство. Во-вторых, мы проанализировали новую серию экспериментов с вызванными светом химическими синапсами у мышей Thy1, продемонстрировав, что их форма волны и амплитуда отличаются от спонтанных и вызванных медленных событий. Таким образом, мы заключаем, что большая часть, если не все, спонтанных медленных событий действительно происходит из-за электрической связи.

Кроме того, мы обсуждаем снижение активности колосков в условиях приема лекарств, утверждая, что спонтанная пиковая активность запускается быстрыми событиями и что блокирование быстрых событий приводит к снижению частоты колосков.

b) Мы изучаем роль шума в обнаружении общих групп колосков, предполагая либо отказ, либо чрезмерное обнаружение. Это показано на Рисунке 7.Мы также добавили моделирование ожидаемого распределения общих групп при различных предположениях. Во всех этих симуляциях довольно ясно, что сеть, в которой вероятность соединений зависит только от расстояния, не может учитывать экспериментально наблюдаемое распределение. Таким образом, главный вывод этого исследования о том, что ядро ​​нижней оливы организовано в кластеры связанных клеток, полностью подтверждается экспериментальными наблюдениями.

На наш взгляд, убедительно то, что мы предлагаем новый экспериментальный и теоретический подход к исследованию электрически связанных сетей, и надеемся, что он найдет ваше одобрение.

Рецензент № 3:

Авторы устранили некоторые недостатки оригинальной рукописи. Однако я все же считаю, что есть серьезные недостатки. На мой взгляд, аргумент о том, что IRE, вероятно, происходят из шипиков аксонов, неубедителен. Анализ и моделирование колосков — более сильная история, но моделирование не учитывает эффекты шума в клетках. Кроме того, фармакологические результаты по-прежнему описываются неправильно.

1) Истоки IRE и отростки аксонов.Авторы несколько смягчили свой провокационный вывод о том, что IRE генерируются в аксональных шипах, хотя в аннотации все еще говорится: «Мы предполагаем, что быстрые события представляют собой регенеративную реакцию в уникальных возбудимых шипообразных структурах в аксонном холмике». На мой взгляд, данные, подтверждающие это предположение, все еще очень слабы по следующим причинам:

A) Доказательства авторов даже о существовании аксональных шипов в нейронах мышей неубедительны. В ответе авторов на обзоры было представлено только одно изображение одного нейрона IO мыши (изображение ответа автора 1).Разрешение изображения низкое, и каждый предполагаемый аксональный позвоночник, кажется, представлен небольшим количеством пикселей. Увеличенное изображение на изображении ответа автора 1B включает пунктирный контур (нарисованный от руки?), Который является чрезмерно оптимистичной интерпретацией пикселей, а рисунок в изображении ответа автора 1C представляет собой просто мультипликационную версию изображения ответа автора 1B. Я понимаю, что визуализация этих небольших структур технически сложна, но, не зная, распространены ли шипы, насколько они велики, где они расположены и насколько хорошо они коррелируют с IRE, вывод о том, что IRE генерируются аксонными шипами, просто не убедительно.

B) Авторы не предоставили никаких дополнительных морфологических, молекулярных или электрофизиологических доказательств, которые помогли бы связать происхождение IRE с шипами аксонов (как они ответили: «… мы работаем над этим вопросом, но в настоящее время мы не можем предоставить эту информацию. Мы надеюсь, что демонстрации их существования достаточно для настоящего отчета ».) Но их рукопись выходит далеко за рамки простой демонстрации существования или IRE. Размышления об экзотических механизмах должны дождаться подтверждающих доказательств.

C) Авторы смоделировали несколько возможных механизмов генерации IRE. Сначала они показали, что IRE-подобные события могут быть сгенерированы путем моделирования «горячих точек» возбудимости в дендритах или, альтернативно, путем моделирования сбоев спайков во все более удаленных узлах аксонов. Затем они отклонили эти возможности, заявив, что «трудно представить себе биологический механизм, который либо конкретно локализует каналы в ограниченной дендритной« горячей точке », либо одновременно блокирует два, три или более Узлов Ранвье» (четвертый абзац, подраздел «Моделирование Внутренние регенеративные события (IRE) »).Возможно, так, хотя две статьи, цитируемые авторами, демонстрируют доказательства относительно высокой плотности натриевых каналов в дендритных шипах (Araya et al., 2007; Bywalez et al., 2015). Мне так же трудно представить себе горячие точки ионных каналов в биологически уникальных аксональных шипах, которые не были четко продемонстрированы ни в изучаемых оливковых клетках, ни, действительно, в любом другом классе нейронов позвоночных.

D) Моделирование генерации спайков в предполагаемых аксональных шипах (рис. 5) исследовало очень ограниченное и биологически неоправданное пространство параметров.Авторы включили высокие плотности натриевых и калиевых каналов (идентичные таковым в начальном сегменте аксона) как в головках позвоночника, так и в бугорке аксона, в то время как возбудимость аксональных узлов Ранвье была фактически устранена (возбудимый бугорок и непоколебимый бугорок). аксоны упоминаются только в Материалах и методах, а не в основном тексте или легенде). Консенсус в этой области состоит в том, что плотность каналов в бугорках аксонов нейронов позвоночных довольно низкая, особенно по сравнению с начальным сегментом.Возможно, оливковые клетки мыши не похожи на другие нейроны, но в отсутствие доказательств мы просто не знаем. Что послужило причиной сделать остальную часть аксона совершенно неуправляемой при моделировании возбудимых шипов? В рукописи проиллюстрированы лишь некоторые результаты этого моделирования; насколько надежны эти результаты? Каковы последствия различной плотности и типов каналов, их распределения, пространственного рисунка, морфологии и количества шипов и т. Д.?

Как упоминалось выше, эта часть удалена.

2) Сетевое моделирование и отсутствие шума. Самый новый и интересный вывод из моделирования сети состоит в том, что ячейки ввода-вывода могут быть организованы в электрически связанные кластеры ячеек (прогнозы вероятности соединения в значительной степени согласуются с широко варьируемым диапазоном, предложенным в предыдущих исследованиях).

Спасибо. Мы, безусловно, согласны с этим описанием.

Заключение о кластеризации полностью основано на совпадении распределений «общих колосков» в зарегистрированных парах ячеек с предсказаниями сетевой модели.Авторы отмечают, что точность смоделированных распределений соединений сильно зависит от частот срабатывания ячеек и длины записывающих образцов. Не должно ли это также зависеть от шума? Важной особенностью биологического препарата, которая отсутствует в модели, является любой источник шума или изменчивости (кроме пуассоновского времени соматических токов, запускающих всплески), особенно в подпороговых мембранных напряжениях.

Мы изучаем роль шума в обнаружении общих групп колосков, предполагая либо отказ, либо чрезмерное обнаружение.Это суммировано на новом рисунке 7, где показано, что даже если мы предположим, что обнаружение общей группы не удалось или неточность в определении количества общих групп, кластерная организация по-прежнему остается единственным возможным объяснением. Кроме того, мы исследовали несколько возможностей связи, зависящих от расстояния, и ни одна из них не дала распределения общих групп, которое соответствует экспериментальным результатам. Таким образом, мы можем заключить, что единственное объяснение наблюдаемого распределения — это кластерная организация.

Записи авторов подразумевают, что блокирование быстрых рецепторов глутамата резко снижает частоту спонтанных всплесков, поэтому можно сделать вывод, что обычно существует значительный химический синаптический шум в дополнение к другим потенциальным источникам.

Как упоминалось выше, снижение активности колосков сильно коррелирует со снижением быстрых событий, которые в IO запускают пиковую активность (рисунок 3 — приложение к рисунку 2). Таким образом, блокирование быстрых событий приведет к снижению пиковой активности с последующим уменьшением колосков.Синаптические потенциалы, запускающие быстрые события, не могут быть записаны в соматическом месте. Спонтанные синаптические события встречаются редко. Однако, чтобы изучить возможное участие химических синапсов в спонтанной активности, мы проанализировали синаптические события, которые были вызваны активацией ChR возбуждающих аксонов, проецируемых на нейроны IO у мышей Thy1. Используя минимальную продолжительность освещения, мы смогли активировать предположительно унитарные события. Затем мы сравнили формы сигналов синаптических потенциалов с формами сигналов медленных событий.Как показано на Рисунке 3 (приложение 1 к рисунку), форма волны и амплитуда синаптических потенциалов явно отличаются от спонтанного медленного события (n = 17 ячеек). Кроме того, мы демонстрируем (рис. 2), что колоски нечувствительны к мембранному потенциалу. Это, что было исследовано на большой популяции нейронов, еще раз подтверждает наш вывод о том, что большинство, если не все, медленных событий являются отражением электрического взаимодействия. Можно утверждать, что нечувствительность к мембранному потенциалу может быть связана с дистальным расположением синапса, однако форма колосков не поддерживает такую ​​возможность.

3) Фармакология. Фармакологические данные (синаптические блокаторы) все еще описываются запутанно и не очень полезны. Из результатов, подраздел «Спонтанные единичные события, регистрируемые в нейронах нижней оливы»: «Однако применение синаптических блокаторов (см. Материалы и методы) полностью исключило наличие быстрых событий (n = 19 нейронов; в 4 из этих нейронов где CNQX был добавлен во время записи, частота изменилась с 0,017 ± 0,005 Гц до 0 Гц), тогда как частота спонтанных медленных событий значительно снизилась (с 0.92 ± 0,73 Гц 163 до 0,26 ± 0,16 Гц, p = 0,019, парный t-критерий, n = 9 нейронов) «Мои вопросы:

А) Какие были блокираторы? В этом предложении результатов указано только CNQX, в легенде к рисунку 2 — в приложении к рисунку 1 указано APV плюс CNQX или DNQX, а в материалах и методах просто перечислены все препараты.

B) Размеры протестированных выборок по-прежнему неоднозначны. Фраза о быстрых событиях говорит n = 19, но затем говорит о n = 4 «где был добавлен CNQX». Не добавляли ли препарат в остальные 15 клеток? Во фразе о медленных событиях упоминается n = 9.Были ли протестированы одни и те же клетки до и после добавления блокаторов? Являются ли 4 и 9 ячеек подмножествами 19 или разными выборками? Просьба уточнить.

C) Авторы говорят, что они провели «тщательный анализ» эффектов блокаторов на формы волны медленных событий, но на самом деле они сообщают данные только из двух примеров ячеек на рисунке 2 — рисунок в приложении 1. Эти данные показали время нарастания и половину длительности, но не амплитуды.

Мы добавили новую когорту данных и упростили описание эффекта препарата.Как упоминалось выше, мы показали, что препарат полностью устранял быстрые события, сопровождающиеся значительным снижением активности колосков. Это было добавлено к тексту и к рисунку 3 — добавление к рисунку 1, и мы надеемся, что теперь оно ясно.

https://doi.org/10.7554/eLife.43560.sa2

HCF243 кодирует белок, локализованный в хлоропласте, участвующий в стабильности белка D1 комплекса Arabidopsis Photosystem II

• © 2011 Американское общество биологов растений. Все права защищены.

Abstract

Было идентифицировано множество вспомогательных ядерных факторов, участвующих в динамике комплекса фотосистемы II (ФСII). В этом исследовании мы охарактеризовали мутант с высокой флуоресценцией хлорофилла 243 ( hcf243 ) арабидопсиса ( Arabidopsis thaliana ), который демонстрирует более высокую флуоресценцию хлорофилла и имеет серьезный дефицит в накоплении суперкомплексов ФСII по сравнению с диким типом. Количество основных субъединиц было значительно уменьшено, в то время как внешние антенные субъединицы и другие субъединицы практически не пострадали в hcf243 .Эксперименты по мечению белков in vivo показали, что скорость синтеза белков D1 и D2 сильно снизилась в hcf243 , в то время как не было обнаружено изменений в скорости других белков, кодируемых пластидом. Более того, скорость деградации белка D1 коровой субъединицы PSII выше у hcf243 , чем у дикого типа, а сборка PSII значительно замедляется у мутанта hcf243 . HCF243 , ядерный ген, кодирует белок хлоропласта, который взаимодействует с белком D1. HCF243 Гомологи были идентифицированы у покрытосеменных с одной или двумя копиями, но не были обнаружены у низших растений и прокариот. Эти результаты предполагают, что HCF243, который возник после происхождения высших растений, может действовать как кофактор для поддержания стабильности белка D1 и способствовать последующей сборке комплекса PSII.

PSII — это комплекс из нескольких субъединиц белок-пигмент, встроенный в тилакоидную мембрану, который использует световую энергию для расщепления воды на кислород, протоны и электроны.Он включает более 20 различных субъединиц, большинство из которых являются интегральными мембранными белками и связывают многочисленные кофакторы (Wollman et al., 1999; Iwata and Barber, 2004; Nelson and Yocum, 2006). Комплекс реакционного центра PSII состоит из белков D1 и D2, α- и β-субъединиц цитохрома b ₅₅₉ и белка PsbI. Гетеродимеры D1 и D2 связывают все важные окислительно-восстановительные компоненты ФС II, необходимые для разделения первичного заряда и последующего переноса электронов (Nanba and Satoh, 1987).Кроме того, коровые комплексы ФСII также содержат собственные белки, связывающие хлорофилл a (CP43 и CP47), внешний кислород-выделяющий комплекс (белки 33, 23 и 17 кДа) и другие низкомолекулярные белки. массовые белки (Bricker, Ghanotakis, 1996). Функциональная форма PSII в тилакоидной мембране состоит из ядра PSII и связанного с ним светособирающего комплекса (Nelson and Yocum, 2006).

Несмотря на значительные успехи в выяснении структуры и функции PSII, знания о сборке этого мультипротеинового комплекса находятся только в зачаточном состоянии.Ряд исследований доказали, что эта сборка может включать многоступенчатые процессы (Rokka et al., 2005). Первым этапом является формирование реакционного центра PSII, в котором белок D1 включается в прекомплекс, вероятно, состоящий из белков D2, цитохрома b ₅₅₉ и PsbI (Adir et al., 1990; van Wijk et al. al., 1997; Müller, Eichacker, 1999; Zhang et al., 1999). Впоследствии CP47 и CP43, субъединицы ядра антенны, которые связывают хлорофилл и , рекрутируются для образования основного комплекса PSII, который делает возможным дальнейшее связывание белков-энхансеров, выделяющих кислород, включая PsbO, PsbP и PsbQ.D1, D2 и CP47, по-видимому, накапливаются скоординированным образом (Jensen et al., 1986; de Vitry et al., 1989; Yu and Vermaas, 1990). CP43 синтезируется независимо и является динамическим компонентом ФСII с постоянно меняющейся диссоциацией и реассоциацией (de Vitry et al., 1989; Zhang et al., 2000). Интеграция низкомолекулярных белков в PSII, как было обнаружено, происходит на разных стадиях процесса сборки PSII (Hager et al., 2002; Suorsa et al., 2004; Rokka et al., 2005). Окончательное установление функциональной ФСII включает димеризацию мономеров ФСII и ассоциацию тримеров LHCII (Rokka et al., 2005).

Из-за структурной сложности PSII функциональная сборка этого очень сложного олигомерного белка должна требовать точно контролируемых механизмов. Специфические механизмы должны работать, чтобы позволить стехиометрическое накопление различных субъединиц, кодируемых двумя генетическими компартментами, необходимыми для сборки PSII (Choquet and Vallon, 2000). К настоящему времени идентифицирован ряд кодируемых ядром вспомогательных и регуляторных белков, которые должны участвовать в этом динамическом процессе (Goldschmidt-Clermont, 1998; Barkan and Goldschmidt-Clermont, 2000; Leister, 2003).Например, хотя кодируемые пластидами белки обычно синтезируются в мутанте с высокой флуоресценцией хлорофилла136 ( hcf136 ) Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ), сборка реакционных центров PSII блокируется и стабильные комплексы PSII, по-видимому, не накапливаются, поскольку недостатка белка HCF136 (Meurer et al., 1998; Plücken et al., 2002). Точно так же накопление суперкомплексов PSII нарушено в мутанте Arabidopsis low psii accumulation2 ( lpa2 ), а белок LPA2 напрямую взаимодействует с ALB3 и может образовывать комплекс, который специфически участвует в эффективной сборке CP43 внутри PSII ( Ma et al., 2007).

Кроме того, фотосинтетическое расщепление воды неизбежно связано с образованием активных форм кислорода, за которым следует цикл фотоокислительного повреждения и восстановления ФС II (Andersson and Aro, 1997; Keren et al., 2005). Во время этого прогресса белок D1 является основной мишенью для индуцированного светом повреждения среди белков PSII (для обзора см. Prasil et al., 1992; Aro et al., 1993), и он подвергается очень высокому светозависимому обмену и показывает очень высокие скорости как синтеза, так и разложения (Sundby et al., 1993). Истощение поврежденного белка D1 следует рассматривать как первую фазу в цикле репарации ФСII, и были предприняты большие усилия для выявления протеаз, ответственных за деградацию белка D1 (Adam and Clarke, 2002; Yoshioka and Yamamoto, 2011). . Фотоповрежденный белок D1 постоянно заменяется вновь синтезированным белком D1, который был описан как событие котрансляции, поддерживающее PSII в функциональном состоянии (Aro et al., 1993). Следовательно, многие исследования были сосредоточены на обороте D1, и сообщалось о многочисленных регулирующих факторах.Напр., PAM68, консервативный интегральный мембранный белок, обнаруживаемый в тилакоидах цианобактерий и эукариот, также, как предполагается, играет роль в стабильности и созревании D1 (Armbruster et al., 2010). LPA1, по-видимому, является интегральным мембранным шапероном, который способствует эффективной сборке PSII за счет прямого взаимодействия с D1 (Peng et al., 2006), а REP27 необходим для оборота белка D1, позволяя завершить процесс трансляции, созревания и активации D1 в функциональный комплекс реакционного центра PSII (Park et al., 2007). Ossenbühl et al. (2006) далее обнаружили, что Srl1471p, гомолог ALB3, важен для интеграции предшественника D1 в тилакоидную мембрану, приводя к накоплению предшественника D1 в фазе мембраны.

Несмотря на эти достижения, сборка и стабилизация белка D1 в PSII и его механизм регуляции остаются плохо изученными (Aro et al., 1993; Yokthongwattana and Melis, 2006). Скрининг мутантов с измененной флуоресценцией хлорофилла оказался специфическим и эффективным способом анализа молекулярных механизмов, лежащих в основе биогенеза фотосистем (Peng et al., 2006), поскольку изменения флуоресценции хлорофилла указывают на дефекты фотосинтетической цепи переноса электронов, которые могут быть результатом изменений в структуре или функции тилакоидной мембраны (Miles, 1994). В данном исследовании мы охарактеризовали мутант hcf243 Arabidopsis. Анализ РНК-гель-блоттинга и иммуноблоттинг показал, что в мутанте присутствовали мРНК, кодируемые пластидами для ядерных субъединиц PSII, но соответствующие субъединицы были резко уменьшены. Исследования по маркировке белков показали, что накопление белка D1 было значительно снижено у мутанта hcf243 .Эти результаты показывают, что ген HCF243 кодирует кофактор, который участвует в динамике D1 и, следовательно, в стабильности и сборке комплекса PSII.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Фенотип мутанта

hcf243

Для исследования генов, участвующих в биогенезе комплекса PSII, мы провели скрининг коллекции мутантов Т-ДНК из Центра биологических ресурсов Arabidopsis (Weigel et al., 2000) на предмет наличия фенотип с высокой флуоресценцией хлорофилла, о котором сообщалось ранее (Meurer et al., 1996; Peng et al., 2006) и выделили hcf243 , ранее не идентифицированный мутант. Генетический анализ показал, что мутация hcf243 является рецессивной. Маркер устойчивости к фосфинотрицину, переносимый Т-ДНК и мутантным фенотипом hcf243 , косегрегирован, что указывает на то, что мутация произошла из-за вставки Т-ДНК (данные не показаны).

Помимо фенотипа с высокой флуоресценцией хлорофилла, мы обнаружили, что мутант hcf243 также влияет на рост растений (рис.1А). Стебли соцветий мутанта hcf243 были короче по высоте, а его розеточные листья бледнее и меньше по размеру (рис. 1А). Площадь листьев 6-недельных мутантных растений hcf243 была примерно на 70% меньше, чем у растений дикого типа (рис. 1В). Фенотип с высокой флуоресценцией хлорофилла в hcf243 указывает на нарушение фотосинтеза, что, в свою очередь, приводит к фенотипам бледных листьев и снижению роста растений.

Рисунок 1.

фенотипов дикого типа (WT), hcf243 и hcf243 комплементарных растений.A, шестинедельные растения дикого типа (слева), hcf243 (в центре) и hcf243 комплементированные (справа). В. Кинетика роста мутантов hcf243 по сравнению с растениями дикого типа. Показанные значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех биологических повторов; каждая повторность представляет шесть трансгенных растений.

Активность ФСII резко снижена в мутанте

hcf243

Неинвазивный флуорометрический анализ был проведен для исследования фотосинтетических характеристик мутанта hcf243 .Эксперименты по индукции флуоресценции хлорофилла показали, что отношение переменной флуоресценции к максимальной флуоресценции ( F _v / F _m ; что указывает на максимальный потенциал фотохимических реакций PSII) резко снизилось у мутанта hcf243 (0,42 ± 0,02) по сравнению с растениями дикого типа (0,82 ± 0,03; рис. 2А), указывая на то, что мутант hcf243 имеет дефекты в передаче энергии внутри ФСII. Кроме того, следует отметить, что содержание P700 было ниже у мутанта hcf243 , чем у растений дикого типа (рис.2B), предполагая, что P700 может быть частично окислен, но PSI является функциональным в мутанте hcf243 , как это наблюдается в мутантах lpa1 и lpa2 (Peng et al., 2006; Ma et al., 2007). Очевидно, эти данные демонстрируют, что мутация hcf243 вызывает резкое снижение активности ФСII.

Рисунок 2. Спектроскопический анализ

дикого типа (WT), hcf243 и hcf24 3 дополненных растений. A, индукция флуоресценции хлорофилла.Минимальный выход флуоресценции ( F ₀ ) адаптированных к темноте растений измеряли с использованием импульсного измерительного луча красного света. Максимальный выход флуоресценции ( F _m ) определяли после насыщающего импульса белого света в адаптированных к темноте листьях. B, окислительно-восстановительная кинетика P700. Кинетику окислительно-восстановительного потенциала исследовали путем измерения изменений оптической плотности P700 при 820 нм, индуцированных дальним красным светом (FR; 720 нм). AL, Актинический свет (120 мкмоль м ⁻² с ⁻¹ ).

HCF243 участвует в индукционной кинетике флуоресценции хлорофилла

Чтобы определить генетическую основу фенотипа hcf243 , геномные области, фланкирующие левую границу Т-ДНК, были выделены с помощью термической асимметричной ПЦР с чересстрочной разверткой. Анализ последовательности показал, что Т-ДНК была вставлена ​​в 5′-нетранслируемую область At3g15095 . В базе данных информационных ресурсов Arabidopsis есть три различные модели генов для At3g15095 .Клонированная последовательность гена HCF243 соответствует At3g15095.1 и была представлена ​​в GenBank (номер доступа HM748832). Чтобы оценить влияние вставки Т-ДНК на экспрессию гена, анализ обратной транскрипции (RT) -PCR и Нозерн-блоттинг показал, что экспрессия гена HCF243 в изолированном мутанте практически не обнаруживается по сравнению с таковой в растениях дикого типа. (Рис.3, А и Б). Дальнейшие иммуноблот-анализы с поликлональным антителом HCF243, которое было индуцировано против рекомбинантного белка HCF243 (аминокислоты 221–408), также показали, что сигнал не был обнаружен в препаратах общего белка (рис.3С).

Рисунок 3.

Характеристика мутанта hcf243 . A, RT-PCR анализ экспрессии гена HCF243 . ОТ-ПЦР выполняли с актин-специфическими праймерами и специфическими праймерами для At3g15095 , At3g15090 и At3g15110 . B, Нозерн-блоттинг экспрессии гена HCF243 в растениях дикого типа (WT) и hcf243 . Тридцать микрограммов общей РНК от растений дикого типа и растений hcf243 фракционировали по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану и зондировали с помощью зонда кДНК HCF243 , меченного ³² P.рРНК обнаруживали окрашиванием бромистым этидием. C. Иммунодетекция HCF243 с помощью специфического антитела против HCF243.

Мы восстановили гомологичные гены или последовательности белков от всех видов покрытосеменных с полными последовательностями генома. Однако соответствующих гомологичных генов у низших растений и прокариот, например, Selaginella moellendorffii , Physcomitrella patens и цианобактерий, выявлено не было. Прогнозируемые белковые последовательности всех гомологичных генов сильно изменчивы, и отдельный домен не был идентифицирован (дополнительный рис.S1). Эти выровненные белки идентичны друг другу на 36-86% (в среднем 48%). Две копии были обнаружены для четырех видов: Zea mays , Populus trichocarpa , Glycine max и Manihot esculenta , в то время как для остальных была восстановлена ​​только одна копия. Остается неизвестным, существуют ли гомологичные гены у голосеменных, потому что полная последовательность генома этой группы не сообщается. Сравнение показывает, что HCF243 является новым геном и может быть обнаружен только у высших растений.Филогенетический анализ далее показал, что две копии у нескольких видов покрытосеменных из-за дупликации возникали независимо после происхождения каждой отдельной линии (дополнительный рис. S2). Кроме того, в некоторых таких линиях (например, линия передачи Sorghum-Zea ) одна дублированная копия, по-видимому, снова была потеряна (дополнительный рис. S2).

Чтобы доказать, что нарушение At3g15095.1 отвечает за фенотипы, наблюдаемые у мутанта hcf243 , выделенную полноразмерную кДНК HCF243 слили с промотором 35S вируса мозаики цветной капусты в векторе трансформации растений. pSN1301 и вводили в гомозиготный hcf243 мутант методом окунания в цветочек с помощью Agrobacterium tumefaciens .Были регенерированы двадцать пять независимых трансгенных растений. Уровни белка HCF243 в дополненных растениях были сравнимы с таковыми в растениях дикого типа (фиг. 3C), и их кинетика индукции флуоресценции хлорофилла также была неотличима от таковой у растений дикого типа (фиг. 2A). Эти результаты недвусмысленно демонстрируют, что нарушение гена At3g15095.1 отвечает за фенотипы мутанта hcf243 .

Состав белка тилакоидной мембраны в мутанте

hcf243

Блок передачи энергии внутри ФСII, обнаруженный в мутанте hcf243 , может быть результатом дефекта в комплексе ФСII.Чтобы рассмотреть эту возможность, мы проанализировали предполагаемые структурные изменения фотосинтетических белковых комплексов в мутанте, а комплексы хлорофилл-белок подвергали синему нативному анализу (BN) / SDS-PAGE. После первичного разделения в присутствии красителя Кумасси синий G-250 было обнаружено шесть основных комплексов хлорофилл-белок, отмеченных от I до VI (рис. 4A). Положения многочисленных тилакоидных мембранных комплексов были идентифицированы из аналогичных гелей с помощью иммуноблот-анализа с различными антителами и, по-видимому, представляли собой суперкомплексы ФСII (полоса I), мономерные ФСI и димерные ФСII (полоса II), мономерные ФСII (полоса III), CP43 минус ФСII (полоса IV), тримерный LHCII (полоса V) и мономерный LHCII (полоса VI; Li et al., 2003; Guo et al., 2005). Как ясно показано на фиг. 4A, суперкомплексы PSII почти отсутствовали, и как полоса II (мономерный PSI и димерный PSII), так и полоса III (мономерный PSII) были резко снижены у мутанта по сравнению с растениями дикого типа. Анализ двумерных гелей SDS-мочевина-ПААГ после окрашивания кумасси синим также подтвердил, что относительные количества субъединиц белковых комплексов PSII были значительно снижены у мутанта (фиг. 4B). Кроме того, чтобы проверить стабильные уровни изменения тилакоидного белка, был проведен иммуноблот-анализ со специфическими антителами против субъединиц фотосинтетических белковых комплексов.Наши результаты показали, что уровни кодируемых пластидами основных субъединиц PSII D1, D2, CP47 и CP43 были резко снижены у мутанта hcf243 по сравнению с таковыми у растений дикого типа; Интересно, что измененное накопление предшественника D1 было полностью обнаружено у мутанта (рис. 4C), тогда как не было обнаружено значительных изменений ни в кодируемых пластидом белках (PsaA / B, Cytf, Cytb6), ни в белках, кодируемых ядром (LHCII, PsbO). ; Фиг. 4С), что согласуется с результатами двумерного SDS-мочевины-PAGE (фиг.4Б). В целом, накопление PSII и его основных субъединиц значительно нарушается из-за прерывания HCF243, , что должно подтверждать частично неэффективную активность PSII, доказанную выше с помощью спектроскопического анализа (рис. 2).

Рисунок 4.

Анализ тилакоидных белков из растений дикого типа (WT) и hcf243 растений. A, Двумерное разделение белковых комплексов в тилакоидных мембранах. Разделенные с помощью BN-PAGE тилакоидные белки на одной дорожке от геля BN разделяли во втором измерении с помощью 15% SDS-мочевины-PAGE и окрашивали кумасси синим.B, BN-гель-анализ тилакоидной мембраны (10 мкг хлорофилла) из растений дикого типа и растений hcf243. солюбилизировали и разделяли с помощью гель-электрофореза BN. Положения белковых комплексов идентифицировали с помощью соответствующих антител (Guo et al., 2005). С. Иммуноблот-анализ тилакоидных белков дикого типа и hcf243 . Белки тилакоидной мембраны разделяли с помощью SDS-мочевины-PAGE, и блоты зондировали специфическими анти-D1, анти-D2, анти-CP47, анти-CP43, анти-CF1β, анти-LHCII, анти-PsbO, анти- Cytf и антитела против Cytb6.

Устойчивые уровни мРНК и полисомная ассоциация

hcf243 основных субъединиц PSII

Чтобы проверить, является ли наблюдаемое значительное снижение комплексов PSII мутанта результатом одного или нескольких нарушенных транскрипций основных субъединиц PSII, эффекта hcf243 Мутацию в транскрипции ядерных субъединиц PSII исследовали с помощью нозерн-блоттинга. Результаты ясно показали, что количества psbA , psbB , psbC и psbD (кодирующих субъединицы D1, CP47, CP43 и D2 PSII соответственно) были почти идентичны в мутантных и диких животных. типовые растения (рис.5А). Способность хлоропластов к синтезу белка была дополнительно изучена путем анализа изменений в полисомной ассоциации транскриптов psbA , psbB , psbC и psbD после фракционирования в градиенте Suc. Интересно, что не наблюдалось явных различий в ассоциации этих транскриптов с полисомами между мутантными растениями и растениями дикого типа (рис. 5B).

Рисунок 5. Экспрессия мРНК

в хлоропластах и ​​ассоциация полисом мРНК хлоропластов.A, Нозерн-блоттинг-анализ транскриптов в растениях дикого типа (WT) и hcf243 растений. Транскрипты генов psbA , psbB , psbC и psbD были обнаружены путем зондирования фильтра соответствующими ген-специфическими зондами. B, ассоциация полисом в растениях дикого типа и hcf243 мРНК, кодирующих белки хлоропластов ( psbA , psbB , psbC и psbD ). Полные экстракты были приготовлены и разделены на градиентах Suc.Десять фракций равного объема собирали сверху вниз градиентов Suc, и нозерн-блот-анализ выполняли на равных пропорциях РНК, очищенной из каждой фракции. рРНК обнаруживали окрашиванием бромистым этидием.

Синтез и стабилизация основных субъединиц PSII in vivo в мутанте

hcf243

Чтобы определить, вызвано ли нарушение накопления субъединиц комплекса PSII сниженной трансляцией или ускоренной деградацией, скорость синтеза кодируемых хлоропластами Белки тилакоидной мембраны изучали с помощью импульсного мечения мутантных листьев [ ³⁵ S] Met в присутствии циклогексимида в качестве ингибитора цитоплазматической трансляции.Как показано на рис. 6, A и B, скорости синтеза субъединиц CP43 и CP47 PSII, белков A / B реакционного центра PSI и субъединиц АТФ-синтазы хлоропластов (CF1α / β) в 12-дневной -старый и 4-недельный мутанты были сопоставимы с таковыми у их аналогов дикого типа. Напротив, включение метки [ ³⁵ S] Met в полипептиды D1 и D2 было значительно снижено, особенно в белок D1. Когда время импульсного мечения было увеличено до 30 минут, количество радиоактивности, включенной в D1 у мутанта hcf243 , очевидно, увеличилось по сравнению с тем, что происходит после 15 минут мечения (рис.6С). После импульсного мечения в течение 30 мин следовала погоня с немеченым Met для отслеживания скорости оборота белков, кодируемых пластидой, в молодых проростках. Результаты показали, что скорость оборота белка D1 значительно сильнее, чем скорость оборота других субъединиц у мутанта hcf243 (рис. 6C).

Фигура 6.

In vivo [ ³⁵ S] Met-мечение тилакоидных белков из растений дикого типа (WT) и hcf243 растений. A и B, Импульсное мечение белков тилакоидной мембраны в 14-дневных молодых проростках (A) и 4-недельных растениях (B).После импульсного мечения молодых проростков арабидопсиса в присутствии циклогексимида в течение 20 мин выделяли тилакоидные мембраны, разделяли белки с помощью SDS-мочевины-PAGE и визуализировали авторадиографически. C, Импульсное и чейз-мечение белков тилакоидной мембраны. После 30 мин импульсного мечения у 14-дневных молодых проростков в присутствии циклогексимида с последующим 1 или 2 ч преследования с холодным Met, тилакоидные белки разделяли с помощью SDS-мочевины-PAGE и визуализировали авторадиографически. D, BN-PAGE анализ включения [ ³⁵ S] Met в белковые комплексы тилакоидной мембраны.За 15-минутным импульсом в молодых проростках арабидопсиса в присутствии циклогексимида следовала погоня за холодным немеченым Met в течение 30 и 60 минут. Мембраны тилакоидов были изолированы и солюбилизированы DM, а белковые комплексы были разделены с помощью BN-PAGE и визуализированы с помощью авторадиографии. Полосы, соответствующие различным комплексам сборки ФСII суперкомплексов ФСII (полоса I), мономерный ФСI, наложенный на димер ФСII (полоса II), мономерный ФСII (полоса III), мономер PSII без CP43 (полоса IV), реакционный центр (полоса V) , и свободные белки (полоса VI) указаны справа.

Для изучения сборки фотосинтетических белковых комплексов тилакоидные мембранные белки, меченные [ ³⁵ S] Met, разделяли с помощью гель-электрофореза BN. После 15-минутного импульса большая часть радиоактивной метки была обнаружена в белковых комплексах, как показано на рисунке 6D. По сравнению с растениями дикого типа, включение радиоактивности в мономерный PSI, наложенный на димер PSII (полоса II), мономерный PSII (полоса III) и мономер PSII без CP43 (полоса IV), резко снизился у мутанта hcf243 . .В течение периода погони эти белковые комплексы значительно увеличились на авторадиограмме, полученной после 60-минутной погони у растений дикого типа. Однако по мере увеличения времени погони накопление радиоактивности в этих комплексах практически не увеличивалось у мутанта hcf243 . Эти результаты показали, что сборка PSII частично неэффективна в мутанте hcf243 из-за отсутствия белка HCF243.

Белок HCF243 нацелен на хлоропласт и взаимодействует с белком D1 in vivo.

Анализ последовательностей показал, что N-концевая последовательность белка HCF243 богата положительными и гидроксилированными аминокислотными остатками, что характерно для транзитных пептидов хлоропласта.Дальнейший анализ последовательности предсказал, что HCF243 является локализованным в хлоропласте белком, с использованием сервера ChloroP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/; данные не показаны). Чтобы определить фактическое субклеточное расположение HCF243, конструкцию HCF243, помеченную желтым флуоресцентным белком (YFP), трансформировали в эпидермальных клеток листа Nicotiana benthamiana . Было продемонстрировано, что сигналы HCF243-YFP были совместно локализованы с сигналами аутофлуоресценции хлоропластов в той же клетке (фиг. 7A). Таким образом, наши результаты демонстрируют, что HCF243 является локализованным в хлоропласте белком.

Рисунок 7. Обнаружение

BiFC взаимодействий белков HCF243 и D1 и их субклеточной локализации. GFP-меченные конструкции HCF243, nYFP-меченные HCF243 и cYFP-меченные конструкции D1 временно экспрессировались в эпидермальных клетках листьев растений N. benthamiana , и их взаимодействие и субклеточное расположение исследовали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Зеленая флуоресценция указывает на GFP, красная флуоресценция показывает аутофлуоресценцию хлоропластов, а оранжево-желтая флуоресценция показывает изображения с объединенными двумя типами флуоресценции.А, эпидермальных клеток листа N. benthamiana , экспрессирующих конструкции HCF243, меченные YFP. В. Взаимодействие между HCF243, меченным nYFP, и D1, меченным cYFP, в хлоропласте эпидермальных клеток листа N. benthamiana . Конструкции C, nYFP и cYFP коэкспрессировали в эпидермальных клетках листа N. benthamiana в качестве отрицательного контроля, не показывая сигнала. D и E, конструкции HCF243 (D), меченные nYFP, и конструкции D1 (E), меченные cYFP, экспрессировали по отдельности в эпидермальных клетках листа N. benthamiana в качестве отрицательного контроля, не показывая сигнала.Штанги = 10 мкм.

Чтобы проверить, взаимодействует ли HCF243 с белком D1 в растительных клетках in vivo, был проведен анализ комплементации бимолекулярной флуоресценции (BiFC) с использованием эпидермальных клеток листьев N. benthamiana в качестве временной системы экспрессии. В этом подходе молекула YFP разделяется на нефлуоресцентные части с N-концом (nYFP) и C-концом (cYFP). Восстановление сигнала флуоресценции YFP наблюдается, когда nYFP и cYFP объединяются в виде слияния с взаимодействующими белками (Tzfira et al., 2004). Коэкспрессия как nYFP-меченного HCF243, так и cYFP-меченного D1 приводила к значительной флуоресценции в эпидермальных клетках листьев N. benthamiana (фиг. 7B). Этот результат предполагает, что белок HCF243 взаимодействует с белком D1. Более того, коэкспрессия nYFP-HCF243 с cYFP-D1 дополнительно подтвердила локализацию белка HCF243 в хлоропласте. Флуоресценция не была обнаружена в эпидермальных клетках листа N. benthamiana с трансформацией nYFP-HCF243, cYFP-D1 или обоих nYFP и cYFP (рис.7, В – Д). В совокупности эти результаты демонстрируют, что HCF243 является локализованным в хлоропласте белком и взаимодействует с белком D1.

Для дальнейшего исследования того, является ли HCF243 трансмембранным белком, были выделены мембранные фракции дикого типа, а затем белок был подвергнут иммуноблот-анализу. Белок HCF243 все еще удерживался в мембранах, когда препараты мембран обрабатывали ультразвуком в присутствии различных солей, как описано в разделе «Материалы и методы» (рис. 8A). Во время этих обработок в качестве контролей использовали PsbO (люминальный белок 33 кДа PSII) и CP47 (основной белок PSII).Приведенные выше результаты показали, что HCF243 является внутренним мембранным белком.

Рисунок 8.

Иммунолокализация и анализ HCF243. А. Иммунолокализация HCF243. Тилакоидные мембраны дикого типа (WT) обрабатывали ультразвуком в присутствии 250 мМ NaCl, 200 мМ Na ₂ CO _3, 1 м CaCl ₂ и 6 м мочевины в течение 30 мин при 4 ° C. В качестве маркеров использовали PsbO (люминальный белок 33 кДа PSII) и CP47 (основной белок PSII). Мембраны, которые не подвергались какой-либо солевой обработке, использовали в качестве контроля.В. Анализ взаимодействия белков HCF243 и D1 с понижением частоты. Около 10 мкг гибридного белка HCF243 His tag, связанного со смолой Ni-NTA, инкубировали со 100 мг тилакоидных мембран, солюбилизированных DM. Связанные белки элюировали, разделяли с помощью SDS-PAGE и подвергали иммуноблот-анализу с антителами D1 и CP47. Аналогичные результаты были получены в двух дополнительных независимых экспериментах.

Для получения дополнительных доказательств такого взаимодействия были проведены эксперименты с «pull-down» с рекомбинантным белком HCF243, слитым с N-концевыми метками His.Очищенные слитые белки His-HCF243 инкубировали с тилакоидными мембранами, солюбилизированными додецил-β-d-мальтопиранозидом (DM), а затем с белками, связанными со смолой из агарозы никель-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA), после промывания буфером, описанным в разделе « Материалы и методы », были разделены с помощью SDS-PAGE и исследованы методом иммуноблоттинга. Как показано на фиг. 8B, белок D1 был обнаружен с помощью антитела D1, когда в анализе использовались слитые белки His-HCF243, но не было обнаружено сигнала, когда использовались только солюбилизированная тилакоидная мембрана и смола.Однако коровый белок CP47 PSII не был обнаружен при использовании слитых белков His-HCF243. Эти результаты указывают на прямое взаимодействие между белками HCF243 и D1.

ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы был достигнут значительный прогресс в идентификации и определении ядерных генов, которые регулируют биогенез и сборку белков, кодируемых как хлоропластом, так и ядром, в ФСII Arabidopsis. Эти ядерные гены действуют как дополнительные вспомогательные и регуляторные факторы, помогающие многоступенчатому процессингу в биогенезе и сборке комплекса PSII (Goldschmidt-Clermont, 1998; Barkan and Goldschmidt-Clermont, 2000; Rochaix, 2001; Leister, 2003).Идентификация и молекулярная характеристика этих факторов важны для нашего понимания способов, которыми фотосинтетически активные белковые комплексы собираются и функционально поддерживаются. Здесь мы представляем доказательства того, что HCF243 , новый ген, кодируемый ядром, также имеет решающее значение для биогенеза и сборки Arabidopsis PSII, что знаменует собой важный шаг к дальнейшему пониманию этого процесса.

Анализ последовательности предсказывает, что HCF243 локализуется в хлоропласте, что затем подтверждается фактическим субклеточным расположением (рис.7А и 8А). Это положение также предполагает, что локализованный в хлоропласте белок HCF243 может иметь биологическую функцию, участвующую в биогенезе комплекса PSII. Это предположение фактически подтверждается мутацией Т-ДНК. Мутация гена HCF243 привела к серьезному нарушению размера листьев и роста растений (рис. 1А). Кроме того, эта мутация вызвала резкое снижение активности PSII, что указывает на дефицит функции PSII (рис. 2A). Тщательный анализ тилакоидных мембранных комплексов, выделенных из листьев мутанта hcf243 , указывает на резкое снижение содержания как комплекса ФСII, так и его ядерных субъединиц реакции (D1, D2, CP43 и CP47) по сравнению с растениями дикого типа ( Инжир.4). Интересно отметить, что у мутанта было обнаружено резкое увеличение накопления предшественника D1 (рис. 4C), что также наблюдалось в pam68 (Armbruster et al., 2010) и hcf136 (Meurer et al., 1998) растения. Напротив, между мутантными растениями и растениями дикого типа не наблюдалось значительных различий в содержании белков, кодируемых пластидом (PsaA, Cytf и Cytb6), или белков, кодируемых ядром (LHCII и PsbO) (рис. 4С). Взятые вместе, эти результаты показывают, что HCF243 должен участвовать в биогенезе комплекса PSII.Это согласуется с предыдущими наблюдениями, что LPA1 и LPA2 специфически локализуются в хлоропластах и ​​необходимы для биогенеза комплекса PSII (Peng et al., 2006; Ma et al., 2007).

Чтобы получить представление о молекулярной функции HCF243, было критически важно точно определить нарушение в накоплении ядерных субъединиц PSII в мутанте hcf243 . Есть несколько возможных объяснений пониженного содержания ядерных субъединиц ФСII. Обнаружено сходное количество и характер транскриптов гена коровой субъединицы PSII как в мутантных, так и в растениях дикого типа hcf243 , что указывает на то, что уменьшение коровых субъединиц PSII не связано с отсутствием транскриптов, кодирующих один или несколько из этих белков PSII.Дальнейшие полисомные анализы показали, что инициация трансляции мРНК PsbA , PsbB , PsbC и PsbD не была изменена в мутанте hcf243 (рис. 5B). Следовательно, сниженное накопление ядерных субъединиц PSII может быть результатом нарушения трансляции или, альтернативно, ускоренной деградации субъединиц PSII после того, как они были синтезированы.

Как показано на фиг. 6, скорость накопления белков D1 и D2 сильно снизилась у мутанта hcf243 , особенно при значительном снижении содержания белка D1.Однако скорость синтеза других белков, кодируемых пластидами, практически не изменилась (рис. 6, A и B). Возможное объяснение пониженного накопления белков D1 и D2 в мутанте hcf243 может заключаться в том, что скорость их разложения была выше, чем у растений дикого типа. Похожий феномен был обнаружен у цианобактерий, у которых инактивация генов PSII не оказывает серьезного воздействия на трансляцию их соответствующих белков, но вместо этого, по-видимому, ускоряет деградацию близких партнеров по сборке (Yu and Vermaas, 1990, 1993).Для отслеживания скорости деградации белков D1 и D2 у мутантов hcf243 был проведен эксперимент с немеченым Met после импульсного мечения в течение 30 мин (фиг. 6C). Результаты показали, что была обнаружена значительно повышенная скорость разложения белка D1 в мутанте hcf243 по сравнению с таковым у растений дикого типа. Интересно, что предыдущие исследования показали, что дефицит некоторых специальных белков приводит к усиленной деградации D1, предполагая, что эти белки могут быть необходимы для стабильности D1 (Choquet and Vallon, 2000; Choquet and Wollman, 2002).Сходные результаты наблюдались также у мутанта Arabidopsis lpa1 , у которого синтез D1, как показано, значительно снижен из-за накопления несобранного белка D1 в мембране (Peng et al., 2006). Более того, повышенная деградация белка D1 должна влиять на сборку PSII. Действительно, как показано на фиг. 6D, сборка PSII в мутанте hcf243 значительно замедлена. Взятые вместе, можно предположить, что быстрая деградация белка D1 может быть результатом нарушения стабильности белка в мутанте hcf243 , что дополнительно подтверждается локализацией HCF243 и его взаимодействием с белком D1 (рис.7 и 8). Наше биоинформатическое исследование известных гомологов HCF243 в растениях показало, что гомологичные гены были обнаружены только у покрытосеменных, с одной или двумя копиями, существующими у каждого вида, но таких гомологичных генов не было у низших растений или прокариот (дополнительный рис. S2). Наши результаты показывают, что HCF243 , который возник после происхождения высших растений, может действовать как важный кофактор для поддержания стабильности белка D1 и способствовать последующей сборке комплекса PSII.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительные материалы

Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana экотип Columbia) выращивали в условиях короткого дня (цикл 10 часов света / 14 часов темноты) с плотностью потока фотонов 120 мкмоль · м ⁻² с ⁻¹ в почве при постоянной температуре 20 ° C. Для синхронного прорастания семена высевали в темноте на 48 ч при 4 ° С. Мутант hcf243 был выделен как рецессивное растение с высокой флуоресценцией хлорофилла из коллекции линий Arabidopsis, подвергнутых мутагенезу pSKI015 T-ДНК, из Центра биологических ресурсов Arabidopsis (Weigel et al., 2000). Мутанты, проявляющие фенотип с высокой флуоресценцией хлорофилла, были первоначально отобраны в темноте под сильным длинноволновым УФ-светом, как описано в другом месте (Miles, 1994; Meurer et al., 1996). Измерение площади листьев проводили с помощью LI-3000 A (Li-Cor) по стандартным протоколам.

Измерения флуоресценции хлорофилла

Измерения флуоресценции выполняли, как описано Peng et al. (2006) с помощью портативного флуориметра (PAM-2000; Walz). Перед измерением листья были адаптированы к темноте в течение 30 мин.Минимальный выход флуоресценции ( F ₀ ) был измерен при измерении света (650 нм) с очень низкой интенсивностью (0,8 мкмоль м ^-2 с ^-1 ). Для оценки максимального выхода флуоресценции ( F _м ) применялся насыщающий импульс белого света (3000 мкмоль м ^-2 с ^-1 в течение 1 с). Максимальная фотохимическая эффективность ФСII определялась из отношения переменной ( F _v ) к максимальной ( F _m ) флуоресценции [ F _v / F _m = ( F _м – F ₀ ) / F _м ].Все указанные выше измерения проводились в темном помещении со стабильными условиями окружающей среды. Для регистрации изменений оптической плотности P700 флуориметр PAM был оборудован детекторным излучателем ED 800 T (Walz), и измерения были выполнены в соответствии с Meurer et al. (1996). Относительное количество фотоокисляемого P700 отражалось из-за изменений оптической плотности, вызванных насыщением дальнего красного света.

BN-PAGE, SDS-PAGE и иммуноблот-анализ

Тилакоидную мембрану получали в соответствии со стандартными методами (Zhang et al., 1999). BN-PAGE выполняли, как описано ранее (Schägger et al., 1994), с некоторыми модификациями (Cline and Mori, 2001; Li et al., 2003). Тилакоидную мембрану солюбилизировали 1% (мас. / Об.) Додецил-β-d-мальтозида в 20% глицерине и 25 мМ BisTris-HCl, pH 7,0, при 1,0 мг хлорофилла на мл ^-1 . После инкубации при 4 ° C в течение 5 минут нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 13000 g в течение 10 минут. Супернатант объединяли с одной десятой объема 5% Serva blue G в 100 мМ BisTris-HCl, pH 7.0,5 м 6-амино- n -капроновой кислоты и 30% (мас. / Об.) Глицерина и наносили на гели с градиентом акриламида толщиной 0,75 мм от 6 до 12% в установке для вертикального электрофореза Hoefer Mighty Small, подключенной к охлаждающий циркулятор. Для двумерного анализа вырезанные дорожки BN-PAGE замачивали в буфере для образцов SDS с 5% β-меркаптоэтанолом на 30 минут и наслаивали на 15% полиакриламидные гели SDS толщиной 1 мм, содержащие 6 мкм мочевины (Laemmli, 1970).

Тилакоидные белки солюбилизировали и разделяли с помощью SDS-PAGE (Laemmli, 1970) на 15% (мас. / Об.) Акриламидных гелях с 6 м мочевиной.После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны и зондировали специфическими антителами.

Анализ нуклеиновых кислот и полисом

Геномную ДНК экстрагировали из листьев Arabidopsis, как описано Liu et al. (1995). Суммарную РНК экстрагировали из 0,5 г листьев растений дикого типа и hcf243 мутантных растений с использованием набора для выделения РНК (U-ген) в соответствии с протоколом производителя. После отделения 15 мкг общей РНК на денатурирующем формальдегиде 1.5% агарозный гель, РНК переносили на нейлоновые мембраны Hybond-N ⁺ (Sambrook and Russell, 2001). Мембраны зондировали с помощью зондов кДНК, меченных ³² P, специфичных для HCF243 , PsbA , PsbB , PsbC и PsbD . После гибридизации с высокой строгостью и отмывки все блоты подвергали воздействию рентгеновской пленки в течение от 1 до 3 дней.

ОТ-ПЦР HCF243 и двух генов, расположенных вокруг сайта инсерции, выполняли с использованием следующих праймеров: At3g15095 , 5′-TTTGGTATTGTTCATGCTTCGC-3 ‘и 5′-AATTACCCAGGTAGAGTTCGAG-3’; At3g15090 , 5′-GACTGCTTGGCGTGCTTT-3 ‘и 5′-CCCGGAATCTGTTTCTTCTC-3’; At3g15110 , 5′-ACTCCGATAGAAGGTGGT-3 ‘и 5′-TGATGAGTCTCCAGGTTGT-3’.Чтобы гарантировать равные количества РНК в каждом образце, проводили RT-PCR анализ кДНК актина с использованием следующих праймеров: смыслового (5′-AACTGGGATGATATGGAGAA-3 ‘) и антисмыслового (5′-CCTCCAATCCAGACACTGTA-3’).

Полисомы были выделены из тканей листьев дикого типа и hcf243 мутантных растений в условиях, которые поддерживают целостность полисома согласно Баркану (1988). РНК выделяли, фракционировали и переносили на нейлоновые мембраны. Фильтры гибридизовали с теми же зондами кДНК, меченными ³² P, описанными выше.

Мечение белков хлоропластов in vivo

Мечение белков in vivo проводили, в основном, в соответствии с Meurer et al. (1998). Первичные листья 12-дневных и 4-недельных мутантных проростков и проростков дикого типа предварительно инкубировали в течение 30 мин в 50 мкл бидистиллированной воды, содержащей 100 мкг-мл циклогексимида ^-1 и меченных радиоактивным изотопом 1 мкКи мкл ^-1 [ ³⁵ S] Met (удельная активность> 1000 Ки, ммоль ^-1 ; Amersham Pharmacia Biotech) в присутствии 50 мкг / мл циклогексимида ^-1 , и радиоактивному Met позволяли включаться в течение различных периодов при 25 ° C при естественном освещении.После импульсной маркировки листьев следовала погоня в присутствии 10 мм немеченого Met. После мечения тилакоидные мембраны выделяли и подвергали анализу BN-PAGE и SDS-PAGE по методу, описанному Ma et al. (2007). Для авторадиографии гели окрашивали, сушили и экспонировали на рентгеновских пленках. Относительные количества [ ³⁵ S] Met в белках были определены количественно путем сканирования рентгеновских пленок и анализа полученных данных с использованием системы AlphaImager 2200.

Продукция антисыворотки

Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислоты с 221 по 408 белка HCF243 (положения нуклеотидов 661–1224 гена HCF243 ), была амплифицирована с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров 5′-GGATCCAGTAATTCGTGTGGTGCG-3 ‘и ′ -CTCGAGTCTTCCACAACTTTGAC-3 ′.Полученный фрагмент ДНК был расщеплен Bam HI и Xho I и слит в рамке считывания с N-концевой аффинной меткой His вектора pET28a. Конструкцию трансформировали в штамм BL21 Escherichia coli и собирали после нанесения 0,4 мМ изопропилтио-β-d-галактозида в течение 4 ч и ресуспендировали в 500 мМ NaCl и 20 мМ NaH ₂ PO ₄ , pH 8,0. После инкубации в течение 30 минут при 4 ° C в присутствии лизоцима в конечной концентрации 1 мг / мл ^-1 бактериальный лизат обрабатывали ультразвуком в течение примерно 30 минут (10-секундная обработка ультразвуком с интервалом 10 с) при 4 ° C.Сверхэкспрессированные белки в телец включения центрифугировали при 3000 g в течение 30 мин, и осадок солюбилизировали в 500 мМ NaCl, 8 м мочевины и 20 мМ NaH ₂ PO ₄ , pH 8,0. Слитый белок очищали на матрице смолы Ni-NTA, и поликлональные антитела вырабатывались у кролика с очищенным антигеном.

Клонирование

HCF243

Для клонирования гена, меченного Т-ДНК в мутанте hcf243 , последовательности левого края Т-ДНК выделяли с использованием стратегии термической асимметричной ПЦР с чересстрочной разверткой, по существу, согласно Liu et al.(1995). Амплифицированные продукты клонировали в вектор pMD18-T (Takara) в соответствии с инструкциями производителя и секвенировали с помощью универсальных праймеров M13. Вкратце, предварительную амплификацию выполняли с использованием праймера SK1 вместе с праймером AP1, а затем продукты амплификации разводили в 600 раз и аликвоты по 5 мкл использовали для второй стадии амплификации с использованием праймера SK2 вместе с праймером AP2. Специфические праймеры SK1 и SK2 были сконструированы в соответствии с последовательностями левого края Т-ДНК.Условия двухэтапной ПЦР были такими, как описано Liu et al. (1995). Продукты ПЦР клонировали в вектор pMD18-T (Takara) в соответствии с инструкциями производителя и размножали в штамме Top10 E.coli . Положительные клоны собирали и культивировали. Плазмидную ДНК экстрагировали с использованием набора Plasmid Moni Kit (U-ген) и секвенировали с использованием универсальных праймеров M13. Были использованы следующие праймеры: AP1 (5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ‘), AP2 (5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′), SK1 (5’-GACTCTAGCTAGAGTCAAGCAGATCGT-3 ‘) и SK2 (5′-GAGCATCGAC’ ).Полная длина этого гена была депонирована в GenBank под номером доступа HM748832.

Комплементация мутанта

hcf243

Для комплементации мутации hcf243 кДНК, содержащая кодирующую область, была амплифицирована с помощью ПЦР со следующими специфическими праймерами, которые включают сайты рестрикции Sal I и Xho I. их 5′-конец для облегчения клонирования: смысловой (5′-CTAGTCGACTCTCAATATCTCTCCAATGGCT-3 ‘) и антисмысловой (5′-GATCTCGAGTCCTTTATTCCCACTCACGTCT-3’).Продукт ПЦР субклонировали в вектор экспрессии растений pSN1301 под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты. Конструкцию pSN1301- HCF243 трансформировали в штамм C58 Agrobacterium tumefaciens и вводили в мутантные растения hcf243 методом окунания цветов (Clough and Bent, 1998). Трансгенные растения отбирали с 0,1% гигромицином. Успешная комплементация была подтверждена иммуноблот-анализом со специфическим антителом против белка HCF243.

Анализ BiFC и субклеточная локализация HCF243

Полноразмерные кодирующие последовательности HCF243 и D1 были амплифицированы с помощью ПЦР со специфическими праймерами ( HCF243 смысл [5′-TGGCGGAAACTGAGAGACC-3 ‘] и

09 антисмысловой HCF243. [5′-CTAGAACCCTACTCCGGCG-3 ′]; смысл D1 [5′-ATGACTGCAATTTTAGAGAGACGC-3 ′] и антисмысловой D1 [5′-TTATCCATTTGTAGATGGAGCCTC-3 ′]) и были слиты в рамке с YFP на N-конце или N-конце либо 5′-половина (nYFP), либо 3′-половина (cYFP) открытой рамки считывания YFP, разрезанная между кодонами 154 и 155 (Hu et al., 2002). HCF243 с меткой YFP, HCF243 с меткой nYFP и D1 с меткой cYFP были сконструированы с использованием системы рекомбинации Gateway. Все векторы были трансформированы в штамм GV3101 A. tumefaciens . Были приготовлены различные комбинации A. tumefaciens , содержащие каждую конструкцию, и смешаны до оптической плотности 0,5: 0,5 при 600 нм. Бактериальную инфильтрацию эпидермальных клеток листа Nicotiana benthamiana проводили, как описано Lavy et al. (2002). Флуоресценцию YFP и аутофлуоресценцию хлоропластов визуализировали с помощью спектрального конфокального сканирующего микроскопа Olympus Fluoview Fv1000 через 48 ч инкубации.

Pull-Down Анализы

Фрагменты, кодирующие полноразмерный HCF243, амплифицировали с помощью ПЦР со следующими праймерами: смысловым (5′-GCTAGCATGGCGGAAACTGAGAGACCCC-3 ‘) и антисмысловым (5′-GGATCCGAACCCTACTCCGGCGCCGCCG-3’). Продукты ПЦР клонировали в Nde I и Bam HI вектора pET28a и трансформировали в E. coli BL21. Экспрессию гибридных белков индуцировали 0,4 мМ изопропилтио-β-d-галактозидом в течение 6 часов. Сверхэкспрессированные рекомбинантные белки очищали на матрице из смолы Ni-NTA.Около 10 мкг рекомбинантного слитого белка, связанного со 100 мл 50% (об. / Об.) Суспензии гранул Ni-NTA в уравновешивающем буфере в течение 60 мин при 4 ° C. Тилакоидные мембраны дикого типа (100 мкг хлорофилла) солюбилизировали 1% (мас. / Об.) DM в 20% (мас. / Об.) Глицерине, 25 мМ BisTris-HCl, pH 7,0 и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида в течение 15 мин при При 4 ° C центрифугировали при 12000 g в течение 10 минут при 4 ° C, и супернатант инкубировали с His-HCF243, связанным со смолой Ni-NAT, в течение 4 часов при 4 ° C. После этого смолу пять раз промывали буфером, содержащим 50 мМ трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ NaCl и 1 мМ EDTA, связанные белки элюировали буфером для образцов SDS-PAGE и разделяли с помощью SDS-PAGE с последующим анализом иммуноблоттинга.

Исследования иммунолокализации

Субклеточную локализацию HCF243 определяли в основном согласно Lennartz et al. (2001). Тилакоидные мембраны дикого типа суспендировали до конечной концентрации 0,1 мг хлорофилла на мл ^-1 и инкубировали в течение 30 мин при 4 ° C в ледяном буфере, содержащем 10 мМ HEPES-KOH, pH 8.0, 10 мМ MgCl ₂ , 330 мМ сорбита и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида с добавлением 250 мМ NaCl, 200 мМ Na ₂ CO ₃ , 1 мМ CaCl ₂ или 6 м мочевины соответственно. Мембранные фракции без добавок использовали в качестве контроля. После обработки мембраны центрифугировали при 100000 g в течение 2 часов при 4 ° C, дважды промывали суспензионным буфером и затем использовали для иммуноблот-анализа.

Филогенетический анализ

HCF243

Последовательность белка Arabidopsis HCF243 (At3g15095) использовалась в качестве запроса для поиска гомологов в базах данных белков и геномов Национального центра биотехнологической информации с использованием BLASTP и TBLASTN.Все значимые совпадения с значением е менее ^-5 , коэффициентом охвата более 35% и коэффициентом совпадения более 35% рассматривались как потенциальные гомологи. Чтобы изучить эволюционную историю генов HCF243 , мы также провели поиск видов растений с полными последовательностями генома, включая Chlamydomonas reinhardtii , Selaginella moellendorffii , Physcomitrella patens , Populus trichocarpa um, Cupusis. , Arabidopsis lyrata , Sorghum bicolor и Oryza sativa .Все гомологичные гены и их предсказанные белковые последовательности использовали для дальнейших анализов. Мы повторно проверили аннотацию этих генов на основе исходного предиката и доступных данных транскрипции (но отсутствие информации EST для этого гена у нескольких видов, например, A. lyrata ). Множественные нуклеотидные и белковые последовательности выравнивали с помощью программы ClustalX 1.81 с последующей корректировкой вручную. Доменные структуры этих потенциальных белковых последовательностей были проанализированы путем поиска в Pfam (Finn et al., 2010) и SMART (Letunic et al., 2006) базы данных белковых доменов, с пороговыми значениями E, установленными на 0,1. Однако мы не идентифицировали какой-либо консервативный домен в этих белковых последовательностях, поэтому филогенетический анализ проводился напрямую с использованием полноразмерных белковых последовательностей. Деревья объединения соседей были построены с использованием MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007; Kumar et al., 2008), а надежность внутренних ветвей была оценена с помощью 1000 повторений начальной загрузки.

Данные последовательности, использованные для выравнивания из этой статьи, можно найти в библиотеках данных GenBank / EMBL под следующими номерами доступа: NP_188128, Arabidopsis At3g15095; XP_002882914, Arabidopsis lyrata e_gw1.3.6495.1; XP_002523264, Ricinus communis 29705 m000578; XP_002316801, Populus trichocarpa 2 POPTR_0011s09990.1; NP_001057589, Oryza sativa Os06t0352900-01; XP_002467967, Сорго двухцветное Sb01g037260.1; cassava19184.valid.m1, Manihot esculenta 1; cassava46811.m1, Manihot esculenta 2; POPTR_0001s38210.1, Populus trichocarpa 1; Glyma12g35610.1, Глицин макс 1; Glyma13g34820.1, Glycine max 2; Cucsa.032440.1, Cucumis sativus ; GRMZM2G358238_P01, Zea mays 1; GRMZM2G008490_P01, Zea mays 2; mgf022716m, Mimulus guttatus (с http://www.phytozome.net/). Регистрационный номер гена HCF243 : HM748832.

Дополнительные данные

Следующие материалы доступны в онлайн-версии этой статьи.

• Дополнительный рисунок S1. Выравнивание выведенных аминокислотных последовательностей гена HCF243 и продуктов его гомологов в P.trichocarpa , C. sativu s, M. esculenta , G. max , Z. mays , R. communis , A. lyrata , S. bicolor , O. sativa и Arabidopsis .

• Дополнительный рисунок S2. Филогенетическое дерево HCF243 и генные структуры всех гомологичных генов.

Благодарности

Мы признательны профессору Лисинь Чжан (Институт ботаники Китайской академии наук) и проф.Цзяньцюань Лю (Университет Ланьчжоу) за руководство этой работой.

Сноски

• Автор, ответственный за распространение материалов, составляющих выводы, представленные в этой статье, в соответствии с политикой, описанной в Инструкциях для авторов (www.plantphysiol.org): Фан Чен (fchen {at} genetics) .ac.cn).

• www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.111.183301

• №1 Работа поддержана Национальной программой фундаментальных исследований (грант №2009CB118503), Национальная программа Китая по исследованиям и развитию высоких технологий (гранты 2007AA021402 и 2009AA10Z101), Министерство науки и технологий Китая, Национальный фонд естественных наук Китая (грант № 31070217) и Программа 100. Выдающиеся молодые ученые Китайской академии наук (GZ).

• №2 Эти авторы внесли одинаковый вклад в статью.

• №3 Нынешний адрес: Центр исследования сложных углеводов, Университет Джорджии, 315 Riverbend Road, Афины, GA 30602–4712.

• ↵ [OA] Статьи в открытом доступе можно просматривать в Интернете без подписки.

• ↵ [W] Онлайн-версия этой статьи содержит данные только для Интернета.

• Получено 13 июля 2011 г.
• Принято 22 августа 2011 г.
• Опубликовано 23 августа 2011 г.

Сила кольца: чувствительный к pH гидрофобный эпоксидный мономер для превосходной стабильности мицелл

Несмотря на растущий интерес к амфифильным блок-сополимерам для их применения в мицеллах в качестве идеальных носителей для доставки лекарств, остаются некоторые проблемы, связанные с биосовместимостью, стабильностью, разлагаемостью и эффективностью загрузки мицелл.Здесь мы сообщаем о новом гидрофобном, чувствительном к pH эпоксидном мономере, тетрагидропиранилглицидиловом эфире (TGE). Анионная полимеризация с раскрытием кольца обеспечивает контролируемый синтез ряда его гомополимеров (ПТГЭ) и амфифильных полимеров, поли (этиленгликоль) — блок -поли (тетрагидропиранилглицидиловый эфир) (ПЭГ- b -ПТГЭ). Интересно, что эти блок-сополимеры с циклическими фрагментами TGE показали превосходную стабильность в биологических средах, высокую нагрузочную способность, регулируемое высвобождение и контролируемое разложение по сравнению с блок-сополимерами с его ациклическим аналогом, 1-этоксиэтилглицидиловым эфиром (EEGE), широко используемым в полиэфире, которые удовлетворяют всем необходимым принципам проектирования и решают проблемы систем доставки лекарств.Ожидается, что превосходная биосовместимость в сочетании с высокой стабильностью нового функционального эпоксидного мономера приведет к разработке универсальной платформы для интеллектуальных систем доставки лекарств.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент…

Что-то пошло не так. Попробуйте еще раз?

.