Российские ученые исправили ошибку в модели структуры важнейшего белка мышц — Наука
ТАСС, 12 февраля. Российские биологи обнаружили, что белок актин, один из важнейших компонентов мышц, по своей структуре похож не на двойную спираль, а на лестницу. Благодаря этому уточнению можно будет создать более эффективные лекарства от мышечных патологий, пишет пресс-служба Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.
«Исправление ошибок в модели позволит повысить эффективность разработки фармпрепаратов для лечения заболеваний, связанных с дефектами актиновых молекул. Речь идет прежде всего, об актиновой и немалиновой миопатиях – тяжелых формах генетических мышечных патологий, которые серьезно влияют на качество и продолжительность жизни», – говорится в сообщении.
Актин – один из самых распространенных компонентов клеток людей и других многоклеточных существ. Очень много этого белка находится в мышцах. Там он отвечает за активацию другого важного белка – миозина, – который непосредственно порождает мышечные сокращения.
Структуру актина ученые выяснили в 1960-х годах. Они предполагали, что по форме этот белок похож на двойную спираль. Однако в последние годы биологи начали сомневаться в этом. Дело в том, что результаты некоторых экспериментов с актином не соответствовали классической теории строения этого белка.
Российские ученые под руководством ведущего научного сотрудника ИТЭБ РАН Оксаны Галзитской проверили эти подозрения на практике. Они изучили трехмерную форму целых и частично разрушенных молекул актина с помощью трансмиссионного электронного микроскопа.
Обработав образцы белка протеазами – ферментами, которые расщепляют пептидные связи в молекулах белков, ученые следили, как появляющиеся в результате этого разрушения меняли форму молекул нитеобразной формы актина. Биологи пришли к выводу, что эти повреждения действительно не соответствовали классическим представлениям о строении актина.
В частности, оказалось, что на все участки молекулы ферменты действовали примерно одинаково. Однако если бы белок был закручен в двойную спираль, такого не могло происходить. Исследователи пришли к выводу, что на самом деле структура актина похожа на лестницу, которая состоит из наложенных друг на друга повторяющихся участков.
Ученые надеются, что это открытие поможет создать более эффективные лекарства от болезней мышц, которые связаны с нарушениями в работе актина, а также позволит разрешить противоречия, которые появились при изучении свойств этого белка из-за ошибочного определения его структуры.
Ткань прочнее кевлара создадут благодаря модифицированным бактериям
Команда исследователей из Вашингтонского университета в Сент-Луисе изобрела новый способ синтеза сложного белка внутри бактерий. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Communications.
Наши мышцы состоят из волокон. Основу волокон составляют белки. Самая длинная молекула у белка титина. Теперь учёные нашли способ заставить бактерии собирать титин из небольших фрагментов. Так как титин составляет основу скелетных мышц, из таких волокон затем можно сплести особо прочную ткань.
Ученые и инженеры разных стран давно пытаются создать искусственные мышцы из разных материалов. Но все они уступают натуральным мышцам по своим свойствам. Американские исследователи попробовали оттолкнуться в своей разработке мышечных волокон от естества. Вместо создания искусственных мышц они решили синтезировать натуральные.
Естественные мышцы состоят из трёх основных белков. Команда сосредоточила свои усилия на синтезе одного из них – титина, который обеспечивает мышцам эластичность. Сложность синтеза титина определяется тем фактом, что это крупнейший из известных белков. Его сложно собрать искусственно.
Чтобы обойти эту трудность, исследователи создали бактерии, которые могут собирать крупные белки из небольших фрагментов. Затем титин может быть преобразован в волокна шириной 10 микрометров с использованием технологии мокрого прядения.
Напомним, при мокром прядении длинные цепочки молекул полимеров превращают в элементарные волокна. Для этого, например, плавят твердый полимер до жидкого состояния и затем продавливают его сквозь сито. При этом образуются волокна диаметром с ячейки сита. Мокрым прядением целлюлозы получают вискозу.
Подобным образом учёные получили из молекул титина, собранных бактериями, жёсткие, прочные и гибкие волокна. Из таких волокон можно соткать материал для пуленепробиваемых жилетов, к примеру. И он будет прочнее кевлара, утверждают исследователи.
При этом поскольку он состоит из того же белка, что и натуральные мышечные волокна, новый материал должен быть биосовместимым, что делает его пригодным для наложения швов и других применений в организме.
«Производство [материала] может быть дешёвым и масштабируемым, – говорит Фучжун Чжан (Fuzhong Zhang), ведущий автор исследования. – Он может иметь множество применений, о которых люди раньше думали».
Учёные утверждают, что разработанная ими платформа из бактерий для синтеза сложных белков годится также для синтеза самых разных природных белков для различных применений.
Ранее мы рассказывали о том, как электрическое покрытие превращает обыкновенную ткань в мягкий экзоскелет и как мощные искусственные мышцы сделали из лески и швейных ниток. Ещё мы писали о создании искусственных мышц из вощёных углеродных нанотрубок, которые поразили учёных своей прочностью.
Больше интересных новостей науки вы найдёте в разделе «Наука» на медиаплатформе «Смотрим».
Ученые выяснили, как ремонтируются поврежденные мышцы
Восстановление поврежденной мышечной ткани происходит благодаря клеткам-сателлитам. А они не могут функционировать без специального белка, выяснили ученые.
Мышцы имеют замечательную способность к самовосстановлению. С помощью тренировок можно восстановить их после травмы, да и возрастная атрофия преодолевается при активном образе жизни. При растяжении мышцы болят, но обычно боль проходит через несколько дней.
Этой способностью мышцы обязаны клеткам-сателлитам — особым клеткам мышечной ткани, которые соседствуют с миоцитами, или мышечными волокнами. Сами же мышечные волокна — основные структурно-функциональные элементы мышцы — представляют собой длинные многоядерные клетки, обладающие свойством сокращения, так как в их состав входят сократительные белковые нити — миофибриллы.
Клетки-сателлиты — это, собственно, стволовые клетки мышечной ткани. При повреждениях мышечных волокон, которые возникают из-за травм или с возрастом, клетки-сателлиты интенсивно делятся.
Они ремонтируют повреждения, сливаясь вместе и образуя новые многоядерные мышечные волокна.
С возрастом количество клеток-сателлитов в мышечной ткани снижается, соответственно, снижается и способность мышц к восстановлению, а также сила мышц.
Ученые из Института изучения сердца и легких Общества Макса Планка (Германия) выяснили молекулярную механику мышечного самовосстановления при помощи клеток-сателлитов, которая до сих пор не была досконально известна. О результатах они написали в журнале Cell Stem Cell.
Их открытие, как считают ученые, поможет создать методику восстановления мышц, которую из лаборатории когда-нибудь можно будет перенести в клинику для лечения мышечной дистрофии. А может быть, и мышечной старости.
Исследователи выявили ключевой фактор — белок под названием Pax7, который играет основную роль в мышечной регенерации.
Собственно, этот белок в сателлитных клетках был известен давно, но специалисты считали, что основную роль белок играет сразу после рождения. Но оказалось, что он незаменим на всех этапах жизни организма.
Чтобы точно выяснить его роль, биологи создали генетически измененных мышей, у которых белок Pax7 в сателлитных клетках не работал. Это привело к радикальному сокращению самих сателлитных клеток в мышечной ткани. Затем ученые вызвали повреждения мышиных мышц путем инъекции токсина. У нормальных животных мышцы начинали интенсивно регенерировать, и повреждения заживали. Но у генетически измененных мышей без белка Pax7 мышечная регенерация стала почти невозможна. В результате биологи наблюдали в их мышцах большое количество мертвых и поврежденных мышечных волокон.
Ученые расценили это как доказательство ведущей роли белка Pax7 в мышечной регенерации.
Мышечную ткань мышей рассмотрели под электронным микроскопом. У мышей без белка Pax7 биологи обнаружили очень немногие сохранившиеся сателлитные клетки, которые по строению сильно отличались от нормальных стволовых клеток. В клетках отмечались повреждения органелл, и было нарушено состояние хроматина — ДНК в совокупности с белками, который в норме определенным образом структурирован.
Интересно, что сходные изменения появлялись в сателлитных клетках, которые культивировали долгое время в лаборатории в изолированном состоянии, без их «хозяев» — миоцитов. Клетки таким же образом деградировали, что и в организме генетически измененных мышей. А ученые обнаружили в этих деградировавших клетках признаки дезактивации белка Pax7, которая наблюдалась у мышей-мутантов. Дальше — больше: изолированные клетки-сателлиты через какое-то время переставали делиться, то есть стволовые клетки переставали быть стволовыми.
Если же, напротив, повысить активность белка Pax7 в сателлитных клетках, они начинают делиться более интенсивно. Все говорит о ключевой роли белка Pax7 в регенеративной функции сателлитных клеток. Остается придумать, как использовать его в потенциальной клеточной терапии мышечной ткани.
«Когда мышцы деградируют, например, при мышечной дистрофии, имплантация мышечных стволовых клеток будет стимулировать регенерацию, — объясняет Томас Браун, директор института.
— Понимание того, как работает Pax7, поможет модифицировать сателлитные клетки таким образом, чтобы сделать их как можно более активными.
Это может привести к революции в лечении мышечной дистрофии и, возможно, позволит сохранить силу мышц в старости».
А здоровые мышцы и физическая активность в пожилом возрасте — лучший способ отодвинуть возрастные болезни.
Сократительный белок мышц — Справочник химика 21
Миозин и актин являются, по всей вероятности, белками, обеспечивающими сократительную функцию мышц. Тропомиозин представляет собой индивидуальный белок с молекулярным весом 130 ООО или 65 ООО, а миозин — по-видимому, полимер тропомиозина. Актин образует с миозином соединение, играющее, вероятно, существенную роль в сокращении мышц. [c.445]
Рассмотрим некоторые основные данные о сократительном белке мышц. [c.193]
Фибриллярные белки являются структурным или сократительным материалом организма. Например, коллаген входит в состав сухожилий, хрящей, кожи и принимает участие в образовании скелета, а миозин является сократительным белком мышц. Эти белки не растворяются в воде. [c.238]
Каковы особенности строения сократительных белков мышц, белков соединительной ткани и переносчиков кислорода [c.263]
При экстрагировании измельченных мышц 0,6 М раствором КС1 и при дальнейшем диализе экстракта выпадает в осадок белковая фракция, получившая название миозин. Миозиновая фракция белков входит в состав фибрилл мышечных волокон, являющихся сократительной структурой мышц, поэтому миозин называют сократительным белком мышц (правильнее было бы его назвать фракцией сократительных белков мышц). После извлечения измельченных мышц 0,6 М раствором КС1 остается еще белковый осадок, состоящий из белков мышечной стромы. Данные о содержании различных белковых фракций в мышцах высших животных приводятся ниже [c.542]
По функциям ферменты, структурные белки, транспортные белки, защитные белки, сократительные белки мышц, гормоны (гормон роста, пролактин, паратгормон), токсины (ботулиновый, столбнячный, холерный), рецепторы (зрительный, ацетилхолиновый), запасные белки в семенах растений и др. [c.23]
Белки мышц. Мышцы позвоночных содержат 15—20% белков. Последние подразделяются на нерастворимые белки, выполняющие функцию опорной ткани, и растворимые белки, некоторые из которых выполняют сократительную, а другие — ферментативную функции. В результате исследований при помощи электронного микроскопа установлено, что мышечная фибрилла имеет форму трубки диаметром [c.444]
Гидролиз АТФ происходит с участием АТФ-азы. Рабочими веществами механохимических процессов служат сократительные белки. Открытие АТФ-азной активности одного из них — миозина мышцы, сделанное Энгельгардтом и Любимовой, является ключевым для всей биологической механохимии. [c.392]
Регуляция скорости синтеза белков. Такое действие оказывают стероидные и тиреоидные гормоны они проникают в клетку и взаимодействуют со специфическими рецепторами. Гормонрецепторный комплекс проникает в ядро, связывается с хроматином и увеличивает скорость синтеза белков на уровне генов (рис. 51). Активные гены усиливают синтез определенной РНК, которая выходит из ядра, поступает к рибосомам и запускает синтез новых белков, которые могут быть структурными или сократительными белками мышц и других тканей, а также ферментами или гормонами. В этом состоит их анаболическое действие. Однако скорость белкового синтеза в клетках — относительно медленный процесс, так как требует большого количества энергии и пластического материала. Поэтому такие гормоны не могут осуществлять быстрый контроль процессов метаболизма. Основная их функция сводится к регуляции процессов роста, развития и дифференцировки клеток организма. [c.138]
Прекрасной иллюстрацией значения белков является раскрытие механизма мышечного сокращения. Установлено, что в основе мышечного сокращения лежит изменение физического состояния особого сократительного белка мышц — актомиозина в результате взаимодействия его с аденозинтрифосфорной кислотой (стр. 448). Это взаимодействие мышечного белка с аденозинтрифосфатом, сопровождающееся сокращением миофибрилл, можно наблюдать in vitro, т. е. вне орга-иизма. Если, например, на мацерированные (вымоченные в воде) мышечные волй кна, лишенные возбудимости, подействовать раствором аденозинтри-( юсфата (при определенных концентрациях солей), то можно наблюдать резкое сокращение этих волокон, во многих отношениях подобное сокращению живой мышцы. Здесь имеется совершенно несомненное доказательство того, что для сокращения мышцы необходимо химическое взаимодействие мышечных белков с богатым энергией химическим веществом. [c.8]
Способность хлоропластов к конформационным изменениям в некоторых работах приписывалась выделенному из их ламеллярных систем специальному белку, аналогичному по свокы свойствам акто-миозину — сократительному белку мышц ( Pa ker, Mar hant Д964 [c.232]
В состав сократительного белка мышц миозина входит неосновная аминокислота М-метиллизин [c.228]
Механизм действия витамина Е двоякий. С одной стороны, это важнейший внутриклеточный антиоксидант, предохраняющий от окисления жиры и другие легкоокис-ляемые соединения, а с другой — переносчик электронов в окислительно-восстановн-тельных реакциях, связанных с запасанием освобождаемой при этом энергии. Он необходим для нормального обмена веществ в мышечной ткани. При недостатке этого витамина наступает атрофия мышечной ткани вследствие резкого снижения содержания сократительного белка мышц миозина и замены его коллагеном — инертным белком. Он имеет отношение к синтезу ацетилхолина, так как при его недостатке нарушаются процессы ацетилирования- Витамин Е связывает протромбин и замедляет свертывание крови. [c.164]
Нельзя не упомянуть в связи с вопросом об установлении белковой природы ферментов об открытии, имевшем принципиальное научное и познавательное значение-. Изучая сокращение и расслабление искусственно приготовленных миозиновых нитей, В.А.Энгельгардт и М.Н.Любимова в 1940г, (50) установили, что сократительные белки мышц обладают ферментативной активностью, расщепляя богатые энергией связи аденозинтрифосфата. [c.180]
Циклические нуклеотиды участвуют в регуляции процессов транспорта ионов через клеточные мембраны, распада углеводов и жиров, модификации сократительных белков мышц, что влияет на функцию скелетных мышц и других органов. Доказана регуляторная роль циклических нуклеотидов в процессах клеточной дифференцировки, секреции гормонов. Циклическим нуклеотидам принадлежит главная роль в гормональной регуляции внутриклеточных процессов в различных тканях как вторичных передатчиков. [c.215]
Миозин является одним из основных сократительных белков мышц, составляющий около 55 % общего количества мышечных белков. Из него состоят толстые нити (филаменты) миофибрилл. Молекулярная масса этого белка — около 470 ООО. В молекуле миозина различают длинную фибриллярную часть и глобулярные структуры (головки). Фибриллярная часть молекулы миозина имеет двуспиральную структуру (рис. 117). В составе молекулы выделяют шесть субъединиц две тяжелые полипептидные цепи (молекулярная масса 200 ООО) и четыре легкие цепи (молекулярная масса 1500—2700), расположенные в глобулярной части. Основной функцией фибриллярной части молекулы миозина является способность образовывать хорошо упорядоченные пучки миозиновых филаментов или толстые протофибриллы (см. рис. 117). На головках молекулы миозина расположены активный центр АТФ-азы и актинсвязывающий центр, поэтому они обеспечивают гидролиз АТФ и взаимодействие с актиновыми филаментами. [c.296]
Родственный класс составляют так называемые двигательные белки. Из них наиболее известны белки сократительного аппарата мышц—актин и миозин. Их разновидностью являются динеин ресничек и жгутиков простейших, спектрин мембран эритроцитов, нейростенин пресинаптпческих мембран и т. п. Сюда можно отнести и белки бактерий, ответственные за движение в градиенте концентраций различных веществ (хемотаксис), в частности мальтозу-связывающий белок Е.со(1, [c.22]
В проявлениях мышечной силы и мощности (в теории и практике спорта эти физические качества обычно объединяются в понятии скоростно-силовой подготовленности спортсмена) определяющее значение имеют структурная организация и ферментативные свойства сократительных белков мышц. Величина усилия, развиваемого мышцей в процессе сокраще-.ния, пропорциональна числу поперечных соединений (спаек) между актиновыми и миозиновыми нитями в миофибриллах. Потенциально возможное число этих соединений, а следовательно, и величина максимального проявления мышечной силы зависят от содержания актина и длины миозиновых нитей в пределах каждого саркомера, входящего в состав миофибрилл. [c.371]
Как уже указывалось (стр. 544), нити, полученные из актомиозина, помещенные в раствор аденозинтрифосфорной кислоты, с добавлением ионов магния и калия обладают способностью укорачиваться. При этом происходит расщепление аденозинтрифосфорной кислоты. Это явление, установленное впервые В. А. Энгельгардтом, а также и А. Сцент-Дьиордьи, указывает, что распад аденозинтрифосфорной кислоты каким-то образом связан с изменением физико-химического состояния сократительного белка мышц, т. е. что распад аденозинтрифосфорной кислоты является процессом, непосредственно связанным с работой мышц. Аденозинтрифосфорной кислоте, ее синтезу и распаду, принадлежит особенно важная, если не главная, роль в превращении химической энергии в механическую. Распад гликогена с образованием молочной кислоты, как и дефосфорилирование креатинфосфорной и аденозинтрифосфорной кислот не требуют участия кислорода, и это объясняет, почему изолированная из организма мышца способна работать в анаэробных условиях. В утомленной при работе в анаэробных условиях мышце накопляются молочная кислота и продукты распада креатинфосфорной и аденозинтрифосфорной кислот в ней исчерпываются запасы веществ, расщепление которых дает необходимую для работы энергию. При помещении утомленной мышцы в среду, содержащую кислород, она начинает его потреблять. Некоторая часть молочной кислоты, накопившейся в мышце при работе, подвергается окислению с образованием углекислого газа и воды. Освобождающаяся энергия используется для ресинтеза гликогена, креатинфосфорной и аденозинтрифосфорной кислот из продуктов их распада, и мышца снова приобретает способность к работе. [c.553]
Молекула миозина не только обеспечивает сокращение различных типов мышц, но способна принимать участие в ряде таких внутриклеточных процессов, как перемещение органелл, прикрепление нитей актина к мембранам, различные рецеппи )ные процессы, формирование и функционирование цитоскелета. Практически во всех случаях молекула миозина тем или иным способом взаимодействует с актином — вторым главным сократительным белком мышц. [c.190]
Было показано, что молекулы мышечного белка акто-миозина способны изменять свою длину непосредственно за счет химической энергии, выделяющейся при отщеплении остатка фосфорной кислоты от молекулы АТФ, т. е. этот процесс обусловливает сократительную деятельность мышц. Таким образом, система АТФ — белок играет роль аккумулятора химической энергии в организме. Накопленная химическая энергия по мере надобности превращается при помощи белка актомио-зина непосредственно в механическую энергию, без промежуточного перехода в тепловую энергию. Для этого [c.449]
Некоторые свойства белков можно объяснить только в свете их функции, т. е. их вклада в более сложную деятельность. Одной из немногих систем, для которых удалось установить корреляцию между функцией белков и функцией органа, является скелетная мышца. Клетка мышцы активируется нервными импульсами (мембранно-направленными сигналами). В молекулярном аспекте мышечное сокращение основано на циклическом образовании поперечных мостиков за счет периодических взаимодействий между миозином, актином и Mg-ATP. Ионы Са и кальцийсвязывающие белки являются посредниками между нервными импульсами и эффекторами. Медиация ионами Са » ограничивает скорость реакции на сигналы включение — выключение и предохраняет от сокращений без сигнала. Напротив, отдельные осцилляции маховых мышц крылатых насекомых контролируются не ионами или подобными низкомолекулярными соединениями, а самими сократительными белками. Эго делает возможными очень быстрые периодические сокращения, которые, будучи инициированы (ионами Са +), протекают сами по себе. В заключение отметим, что исследования мышцы показывают, что в функционировании белка отчетливо проявляется связь между деталями молекулярного строения и деятельностью всего организма. [c.292]
К группе миофибриллярных белков относятся миозин, актин и актомиозин—белки, растворимые в солевых средах с высокой ионной силой, и так называемые регуляторные белки тропомиозин, тропонин, а- и 3-актинин, образующие в мышце с актомиозином единый комплекс. Перечисленные миофибриллярные белки тесно связаны с сократительной функцией мышц. [c.648]
На с. 396 уже говорилось о жидкокристаллических свойствах сократительных белков. При укорочении мышцы меняется период решетки, построенной из протофибрилл. При вдвижении решетки тонких нитей в решетку толстых нитей тетрагональная симметрия заменяется гексагональной. Это можно трактовать как полиморфный переход в жидкокристаллической системе. Вопрос требует дальнейших исследований. [c.404]
Эти механохимические процессы сводятся к превращению химической энергии в механическую работу. Имеется далеко идущее сходство АТФ-азной активности митохондриальных мембран и актом иозиновой сократительной системы скелетных мышц. Сходны их механохимические свойства — сокращение под действием АТФ. Можно было думать, что в мембранах митохондрий присутствуют сократительные белки, подобные актомнозину. Эта гипотеза была подтверждена — сократительный белок удалось выделить из митохондрий. Показано, что сократительные белки участвуют в митохондриальной механохимии, но оказалось, что здесь играет существенную роль и липид мембран — фосфатидилинозитол. [c.431]
Все рассказанное в этой главе втносилось к глобулярным белкам со свойственным им многообразием структур и функций. Гораздо менее разнообразные фибриллярные белки характеризуются специфическими особенностями строения и выполняют специальные функции. Это — структурные и сократительные белки. Первые играют роль опорных и защитных компонент, входя в состав сухожилий, хрящей, костей, связок и т. д. (коллагены), а также эпидермиса, волос, шерсти, рогов и т. д. (кератины). Вторые входят в состав рабочих веществ механохими-ческих систем, в частности мышц (миозин). [c.254]
Легко различить два главных типа волокон. Красные мышечные волокна, как, иапример, в темном курином мясе, богаты белком, связывающим кислород,-миоглобином. Белые мышечные волокна, такие как в белом курином мя-се, содержат гораздо меньше миоглобииа. (Есть также промежуточные волок-на, но основное внимание мы уделим красным и белым.) Различное содержание миоглобииа-белка, родственного гемоглобину,-отражает различия в метаболизме клеток с неодинаковым потреблением кислорода дц красных волокон более карактерно окислительное фосфорилирование, для белых-анаэробный гликолиз. Различные типы метаболизма в свою очередь связаны с разными типами сократительной активности. Красные волокна в ответ на стимуляцию сокращаются медленно, они менее подвержены утомлению и более эффективны при необходимости длительных усилий. Белые волокна дают быстрый ответ, легче утомляются и более эффективны при быстрых повторяющихся движениях. Красные и белые волокна содержат разные формы сократительных белков (таких, как миозин), кодируемых различными генами. В то время как большинство мыщц содержит смесь волокон разного типа, некоторые мышцы оказываются в основном красными, т.е. медленными, а другие-в основном белыми, т.е. быстрыми. [c.174]
В сократительной системе мышцы толстые нити (состоящие из молекул миозина) и тонкие нити (состоящие из О-актина) уложены параллельными рядами. Как мы увидим ниже (гл. 14 и 25), сокращение скелетной мьшщы происходит благодаря скольжению тонких нитей вдоль толстых, причем это скольжение индуцируется в присутствии некоторых других мьппечных белков и ионов Са . Скольжение нитей, обусловливающее укорочение скелетной мьшщы в процессе сокращения, осуществляется только при наличии в системе АТР. [c.183]
В. А. Энгельгардт и М. Н. Любимова, производя свои исследования над сократительным веществом мышц — белком миозином, обладающим, как было показано теми же авторами (стр. 417), выраженными ферментативными (аденозинтрифосфатазными) свойствами, обнаружили, что особым образом приготовленные миозиновые нити при взаимодействии с аденозиптрифосфа-том в определенных условиях резко изменяют свои механические свойства (эластичность и растяжимость). Одновременно происходит расщепление аденозинтрифосфата с образованием АДФ и Н3РО4. Эти наблюдения сразу же привлекли всеобщее внимание, наметили возможность объяснения самого механизма превращения химической энергии в механическую работу и заложили фундамент для нового направления в биохимии — механохимии мышечного сокращения. [c.425]
Опыты с мышечными волокнами, отмытыми от большей части водорастворимых белков и всех экстрактивных веществ водой или 50% раствором глицерина, убедительно показали, что сокращение мышцы наступает в результате взаимодействия сократительного (контрактильного) белка мышцы с аденозинтрифосфатом. [c.430]
Врач назвала пять лучших продуктов для роста мышц
https://rsport.ria.ru/20210829/myshtsy-1747698895.html
Врач назвала пять лучших продуктов для роста мышц
Врач назвала пять лучших продуктов для роста мышц — РИА Новости Спорт, 03.09.2021
Врач назвала пять лучших продуктов для роста мышц
Эндокринолог-диетолог Татьяна Бочарова назвала пять продуктов, которые лучше всего способствуют росту мышечной массы. РИА Новости Спорт, 03.09.2021
2021-08-29T03:35
2021-08-29T03:35
2021-09-03T15:45
зож
питание
здоровье
здоровый образ жизни (зож)
/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content
/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content
https://cdnn21.img.ria.ru/images/97469/67/974696754_0:287:2760:1840_1920x0_80_0_0_09fb4e602ef79fccae671de76239f2b6.jpg
МОСКВА, 29 авг — РИА Новости. Эндокринолог-диетолог Татьяна Бочарова назвала пять продуктов, которые лучше всего способствуют росту мышечной массы.Первый продукт, по мнению Татьяны Бочаровой, — говядина: она содержит 22 грамма белка, а также креатин. Это аминокислота снабжает мышцы кислородом и повышает выносливость. Как самостоятельную добавку креатин используют в бодибилдинге.Второй — куриная грудка, в которой около 110 калорий на 100 граммов продукта и при этом содержание белка равно 23 граммам. Куриное мясо хорошо усваивается, содержит витамины группы B, кроме того, в отварном виде оно полезно даже при проблемах с пищеварением.Третий — яйца: в них 13 граммов белка, цинк, который помогает мышцам расти, и аминокислота лейцин: она снижает скорость распада белка.Четвертый — рыба (в среднем 18 граммов белка), например лосось, горбуша, скумбрия, а также креветки (19 граммов белка), которые хорошо усваиваются организмом. В рыбе содержится омега-3, полиненасыщенные жирные кислоты, которые в том числе способствуют восстановлению мышц после нагрузок.Пятый продукт — творог, в 100 граммах которого 16 граммов белка. 70 процентов белка — это казеин, который на долгое время насыщает организм.
https://rsport.ria.ru/20200723/1574754931.html
https://rsport.ria.ru/20210730/son-1743632999.html
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
2021
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
Новости
ru-RU
https://rsport.ria.ru/docs/about/copyright.html
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
https://cdnn21.img.ria.ru/images/97469/67/974696754_154:0:2607:1840_1920x0_80_0_0_ee67beeb3a39b7374d54859b4b4ba805.jpg
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
питание, здоровье, здоровый образ жизни (зож)
03:35 29.08.2021 (обновлено: 15:45 03.09.2021)
Врач назвала пять лучших продуктов для роста мышц
МОСКВА, 29 авг — РИА Новости. Эндокринолог-диетолог Татьяна Бочарова назвала пять продуктов, которые лучше всего способствуют росту мышечной массы.
«Если ваша цель — набор мышечной массы, то не следует усиленно налегать на один-два продукта: важно, чтобы в меню были разные продукты, с неодинаковым соотношением аминокислот. Тогда вы получите максимум питательных веществ», — сообщила врач РИА Новости.
Первый продукт, по мнению Татьяны Бочаровой, — говядина: она содержит 22 грамма белка, а также креатин. Это аминокислота снабжает мышцы кислородом и повышает выносливость. Как самостоятельную добавку креатин используют в бодибилдинге.
Второй — куриная грудка, в которой около 110 калорий на 100 граммов продукта и при этом содержание белка равно 23 граммам. Куриное мясо хорошо усваивается, содержит витамины группы B, кроме того, в отварном виде оно полезно даже при проблемах с пищеварением.
23 июля 2020, 07:00ЗОЖКак сжечь подкожный жир без потери мышц? Советы от фитнес-модели
Третий — яйца: в них 13 граммов белка, цинк, который помогает мышцам расти, и аминокислота лейцин: она снижает скорость распада белка.
Четвертый — рыба (в среднем 18 граммов белка), например лосось, горбуша, скумбрия, а также креветки (19 граммов белка), которые хорошо усваиваются организмом. В рыбе содержится омега-3, полиненасыщенные жирные кислоты, которые в том числе способствуют восстановлению мышц после нагрузок.
Пятый продукт — творог, в 100 граммах которого 16 граммов белка. 70 процентов белка — это казеин, который на долгое время насыщает организм.
Назван продукт, сжигающий жир во время сна
Белки с мутациями влияют на развитие тяжелых заболеваний человеческих мышц
В новой работе ученые из Института цитологии (ИНЦ) РАН, Санкт-Петербургского государственного университета и Оксфордского университета выявили некоторые особенности того, как функционирует тропомиозин с различными мутациями, которые характерны для ряда наследственных миопатий. Из-за того, что в актиновых нитях появляются мутантные формы тропомиозина, изменяется чувствительность саркомера к ионам кальция, вследствие чего нарушается регуляция мышечного сокращения. Чтобы получить информацию о том, как тропонин-тропомиозиновый комплекс нарушает регуляцию мышечного сокращения, ученые использовали специальные флуоресцентные зонды. Они специфически связывались с различными белками мышечного волокна. То, как они располагались в мышечном волокне, ученые отслеживали с помощью разработанного в Институте метода поляризационной микрофлуориметрии. В ходе исследования ученые показали, что изменение пространственного расположения зондов помогло получить информацию о том, как миозин и актин взаимодействуют между собой, и о том, как это взаимодействие нарушается под влиянием мутаций в тропомиозине.
«Результаты исследования позволят выявить взаимосвязь между типом миопатии и изменениями в функционировании актин-миозиновой системы при каждой из мутаций в тропомиозине. Полученная нами информация будет иметь существенное значение для понимания основ сокращения мышц в норме и при миопатиях, поможет в поиске мишеней для терапевтического воздействия на ранних стадиях проявления болезни. Впоследствии данные нашей работы могут быть использованы для тестирования лекарственных препаратов», — комментирует один из авторов исследования, профессор ИНЦ РАН Юрий Боровиков.
Сегодня остаются невыясненными молекулярные механизмы, лежащие в основе таких заболеваний мышечной ткани, как немалиновая миопатия, кэп-болезнь, дистальный артрогрипоз и врожденная диспропорция типов мышечных волокон. Ученые планируют установить, почему возникают эти тяжелые заболевания, и разработать эффективные методы их диагностики и лечения.
Понравился материал? Добавьте Indicator.Ru в «Мои источники» Яндекс.Новостей и читайте нас чаще.
Пресс-релизы о научных исследованиях, информацию о последних вышедших научных статьях и анонсы конференций, а также данные о выигранных грантах и премиях присылайте на адрес [email protected].
источник красивых мышц и стройной фигуры
Белки хороши тем, что их не запрещают есть во время диеты — в отличие от углеводов. А все почему? Потому что они являются строительными материалами для нашего организма и без их помощи и регулярного поступления он, как и дом, ослабеет, обветшает и в конечном итоге разрушится. Белки участвуют в синтезе сложных ферментов, которые просто необходимы для образования клеточных структур и тканей.
Кроме того, эти элементы пользуются большой популярностью у посетителей тренажерных залов — они регулярно пьют белковые коктейли, чтобы нарастить мышечную массу. Все дело в том, что основной структурной единицей белков являются аминокислоты, а мышечная ткань по большей части состоит из самого белка.
Еще эти элементы укрепляют наш иммунитет и выполняют транспортировку всех витаминов, минералов, а также лекарственных препаратов к тканям и органам, поэтому за избавление от головной боли следует благодарить не только «Цитрамон», но и нашу внутреннюю «службу доставки».
Белки — важная составляющая рациона: они не только помогают держать мышцы в тонусе, но и выступают катализаторами в пищеварительных процессах. Некоторые продукты просто необходимо употреблять вместе с белками, иначе организм не сможет получить из них энергию. Это касается комплексных углеводов, например, коричневого риса, овсянки, ячменя, гречневой крупы и другого.
Именно в отсутствии или недостаточном для здорового существования количестве столь важного белка обвиняются вегетарианские диеты, поскольку известно, что наибольшее число протеинов содержится в мясе. Однако это всего лишь стереотип — полезный и необходимый белок присутствует во множестве других продуктов.
Так, лидером по содержанию этого элемента является не говядина, а соя. Именно это травянистое растение включает в свой состав 35 граммов белка на 100 граммов своей массы. Следующие в списке богатых белком немясных продуктов — сыр, яйца, творог, брюссельская капуста, молоко, орехи.
Ростки сои
Для измерения качества белков диетологи придумали коэффициент их усвоения. Чтобы его вычислить, необходимо учитывать аминокислотный состав (химическую ценность) и полноту переваривания (биологическую ценность) этих элементов. Так, по данным ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения), самыми подходящими источниками белка для человеческого организма являются молоко, говядина, гороховая муха, овес, чечевица и арахис.
При выборе белковых продуктов для своей диеты обращайте внимание и на количество содержащихся в них жиров. Например, всем известно, что орехи — богатый источник белка. Однако их нельзя употреблять без меры из-за высокого количества в них жиров и калорий, которые запросто обесценят вашу диету. Орехи стоит есть лишь днем или утром, ограничиться горстью или добавить их в какое-нибудь блюдо.
Белковые продукты сойдут за отличный перекус. Белок, как правило, не вызывает резкого подъема уровня сахара в крови, как это делают углеводы, наоборот, он его стабилизирует. Добавляя эти элементы в каждый прием пищи, вы способствуете равномерному распределению калорий в течение всего дня, плюс ко всему протеины позволят оставаться вам сытыми намного дольше. Поэтому, например, свое утреннее меню не стоит ограничивать одной булочкой или яблоком. Хорошим завтраком можно назвать такой, в котором присутствует правильное сочетание продуктов — например, хлеб из твердого зерна, яичница, горсть ягод или фрукты.
Убедиться, что вы съели необходимое количество белка — очень просто. Диетологи давно вывели формулу: 1 грамм белка на 1 килограмм вашего веса. То есть если вы весите 50 кг, то ваша суточная норма потребления белковых продуктов — 50 г. За три приема пищи в день добиться этого достаточно просто, особенно, если хотя бы один продукт будет с повышенным содержанием протеина. Напомним, что это может быть говяжий стейк, куриная грудка, грудка индейки, рыба (особенно тунец), яйца, молочные продукты и сыр тофу.
Последнее, но не менее важное дополнение — белок помогает предотвратить различные заболевания. Например, ученые доказали, что белковая диета способствует уменьшению риска заболеваний инсультом. Однако здесь стоит учитывать, что ее основную часть должно составлять не красное мясо, а курица или рыба.
Кроме того, белок способствует здоровью костей — незаменимые аминокислоты помогают оставаться им сильными и крепкими даже в пожилом возрасте. К такому результату пришли японские ученые, которые обнаружили, что кости женщин, любивших употреблять белок в пищу, были заметно крепче остальных участниц эксперимента.
Muscle Protein — обзор
Мультигенные семейства кодируют мышечные белки
Насколько нам известно, существует множество изоформ всех миофибриллярных белков. Они кодируются семействами генов, вероятно, у всех видов млекопитающих. Экспрессия этих генов, как правило, зависит от ткани или типа волокна, и для многих существуют изоформы для плода, взрослого и (для некоторых) неонатального происхождения.
Геном человека содержит 20 или более генов актина и псевдогенов (или их большие сегменты), распределенных на нескольких хромосомах.По-видимому, гены актина часто дублировались в процессе эволюции. Как упоминалось ранее, шесть генов актина экспрессируются в значительном количестве у млекопитающих тканеспецифическим образом. Гены актина скелета и миокарда расположены на хромосомах 1 и 15 соответственно.
Ген мышечного MHC типа I расположен на хромосоме 14 как у человека, так и у мыши. Этот ген также кодирует сердечный β MHC, хотя это не идентичный белок. MHC скелетных мышц типа II находятся на 17 хромосоме у человека (11 у мышей).Существуют также кардиальные α MHC и эмбриональные и неонатальные кардиальные и скелетные MHC.
Точно так же существует множество генов регуляторных белков. В случае тропонина, например, есть два гена скелетных мышц для Tn I, один экспрессируется в быстрых, а другой — в медленных волокнах, а сердечный Tn I специфичен для миокарда. Сердце плода экспрессирует этот Tn I вместе с медленным Tn I скелета. Сердечный Tn I на 30-32 аминокислоты длиннее любого Tn I скелета и, таким образом, его легко отличить от них.У пациентов с инфарктом миокарда (ИМ) Tn I появляется в плазме примерно через 4 часа после ИМ и остается повышенным в течение примерно семи дней. Для Tn C также есть два скелетных гена и один кардиальный ген. Tn T также имеет две формы скелетных мышц: быструю и медленную. Существуют также две изоформы взрослого сердечного Tn T, называемые Tn T 1 и Tn T 2 , и две изоформы сердечного Tn T плода. Считается, что в каждом возрасте две формы являются результатом альтернативного сплайсинга РНК. Преобладающей изоформой для взрослых является Tn T 2 , и было обнаружено, что Tn T 2 в сыворотке повышается примерно через четыре часа после инфаркта миокарда и остается определяемым в течение примерно 14 дней.Хотя сообщалось, что и Tn T, и Tn I на 90% (или более) чувствительны и специфичны для ИМ, было обнаружено, что Tn I не подвергается онтогенному рекапитуляции при повреждении ткани, что дает ему преимущество перед CKMB (или Tn T ) при подозрении на ИМ. Либо Tn T, либо Tn I могут использоваться в клинической практике, и анализ тропонина стал частью стандарта лечения в случаях подозрения на ИМ. У людей с нестабильной стенокардией у людей с повышенным уровнем сердечных тропонинов (особенно Tn I и Tn T) гораздо больше шансов, чем у других, иметь сердечный приступ в ближайшие месяцы, поэтому анализ тропонина имеет прогностическую, а также диагностическую ценность.
Точно так же множественные гены, альтернативный сплайсинг РНК и посттрансляционные модификации приводят к множеству основных и регуляторных легких цепей, тропомиозинов, тайтинов и других миофибриллярных белков. Ферменты энергетического пути по-разному экспрессируются в различных типах скелетных волокон, в сердечных и гладких мышцах и на разных стадиях развития. Это также относится к регуляторным белкам Ca 2+ , таким как SR Ca 2+ -АТФаза, где один ген экспрессируется в волокнах FT, называемых SERCA1, а другой — в ST и сердечных волокнах, называемых SERCA2.
Нуклеотидные последовательности нескольких копий генов имеют тенденцию со временем расходиться. Однако первичная структура актина должна быть консервативной, как упоминалось ранее, из-за большого количества сайтов специфического связывания по отношению к количеству аминокислот. Последовательность актина слизистой плесени Physarum polycephalum отличается только на 8% от таковой актина скелетных мышц млекопитающих. Различные семейства миозинов сильно различаются, особенно в области хвоста и шеи, а некоторые имеют только одну тяжелую цепь.Количество легких цепей может варьироваться от одной до шести. Однако в миозине II гораздо меньше вариаций. Напр., Повторяющаяся структура хвостовых областей в мышечных МНС является высококонсервативной, и есть несколько сегментов сайтов связывания актина и АТФазы в головках, которые консервативны не только в подсемействе миозина II, но и во всех семействах миозина. Существует также поразительное структурное сходство между головками миозина и моторным кинезином микротрубочек, несмотря на общее отсутствие сходства последовательностей, и есть некоторые ключевые последовательности в областях связывания нуклеотидов, которые являются высококонсервативными. G-белки — это еще один класс белков, которые, как и головки миозина, связывают две другие структуры нуклеотид-зависимым образом, и G-белки также сильно напоминают по структуре миозиновые головки и обладают поразительной гомологией последовательностей в области сайта связывания нуклеотидов. . Таким образом, эти молекулярные моторы и G-белки имеют общие структурные особенности, и вполне вероятно, что понимание одного из них улучшит понимание других.
Мышечные белки
% PDF-1.4
%
1 0 объект
>
эндобдж
11 0 объект
/Заголовок
/Тема
/ Автор
/Режиссер
/ Ключевые слова
/ CreationDate (D: 20211011070445-00’00 ‘)
/ ElsevierWebPDFS Технические характеристики (6.5)
/ ModDate (D: 20181003121223 + 02’00 ‘)
/ doi (10.1016 / B978-0-12-814026-0.21602-8)
/ роботы (noindex)
>>
эндобдж
2 0 obj
>
эндобдж
3 0 obj
>
эндобдж
4 0 obj
>
эндобдж
5 0 obj
>
эндобдж
6 0 obj
>
эндобдж
7 0 объект
>
транслировать
application / pdfdoi: 10.1016 / B978-0-12-814026-0.21602-8
книгаЭнциклопедия пищевой химии © Elsevier Inc., 2018. Все права защищены 978-0-12-814026-01-1711710.1016 / B978-0-12-814026-0.21602-8 http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12 -814026-0.21602-86.510.1016 / B978-0-12-814026-0.21602-8noindexElsevier2018-04-24T15: 07: 52 + 05: 302018-10-03T12: 12: 23 + 02: 002018-10-03T12: 12 : 23 + 02: 00TrueAcrobat Distiller 8.1.0 (Windows) uuid: 70092de4-4bd6-415e-aba3-d1b86796dc7euuid: d08fe108-6638-4b00-afde-ca4b884ebf31
конечный поток
эндобдж
8 0 объект
>
эндобдж
9 0 объект
>
эндобдж
10 0 obj
>
эндобдж
12 0 объект
>
эндобдж
13 0 объект
>
эндобдж
14 0 объект
>
эндобдж
15 0 объект
>
эндобдж
16 0 объект
>
эндобдж
17 0 объект
>
эндобдж
18 0 объект
>
эндобдж
19 0 объект
>
эндобдж
20 0 объект
>
эндобдж
21 0 объект
>
эндобдж
22 0 объект
>
эндобдж
23 0 объект
>
эндобдж
24 0 объект
>
эндобдж
25 0 объект
>
эндобдж
26 0 объект
>
эндобдж
27 0 объект
>
эндобдж
28 0 объект
>
эндобдж
29 0 объект
>
/ ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageB / ImageI]
>>
эндобдж
30 0 объект
>
транслировать
x ڝ XɎ6 + |
ҷ / 㹤) ZX $ = `q + nɰTM; ~ ke [\ 0> $ X ^ nLvu9DL, ZZw6 = Y7 |.GjiG
> \ Mg {y / O4IQ (& Z.q & yf-bwp3 = `Ѣ # ӠMt» {sQy L ~ & @ lFp # p ͊pu’RA [7xS5 # gI # F [l; | 4 & ‘Ys8rEy + ɣdY
Белки в структурах — мышца
Ученые интересуются строением мышц по разным причинам. Например, диетологам необходимо знать детали структуры и химического состава мышц, чтобы они могли консультировать пищевые компании о том, как обращаться с мясом и обрабатывать мясные продукты. Врачи, физиотерапевты и ученые в области спорта заинтересованы в том, чтобы узнать больше о мышцах, чтобы они могли более эффективно лечить мышечные травмы и заболевания.
Мышечная ткань сокращается и расслабляется под действием электрических раздражителей, исходящих от мозга по нервам. Электрические стимулы высвобождают ионы кальция из компонента мышечной клетки. Высвобождение ионов кальция инициирует сокращение мышц. Сокращения вызывают движение тела. Вовлеченные силы могут быть огромными; все усилия, которые прилагает штангист, происходит за счет сокращения мышц. Откуда берется необходимая энергия?
Особые небольшие молекулы ( АТФ, , аденозинтрифосфат), вырабатываемые во время дыхания, обеспечивают запас энергии, который используют мышцы.Когда эти маленькие молекулы распадаются, они передают энергию мышцам. Как мышцы могут превратить эту химическую энергию в кинетическую энергию?
Это белки в мышцах, которые реагируют на нервные импульсы, изменяя упаковку своих молекул. Однако, чтобы увидеть, как это работает, нам нужно взглянуть на то, как молекулы собираются вместе, и на их структуру.
Сотни мышечных волокон длиной до нескольких сантиметров каждое объединяются в одну мышцу.Каждое волокно состоит из множества мелких миофибрилл (рис. 5). Миофибриллы имеют характерный узор из поперечных линий, называемых полосами , которые образованы расположением белковых молекул.
Молекулы белка образуют нитей . Есть два типа нити накала; толстый и тонкий. Толстые нити содержат миозина , тонкие нити содержат актина , тропонина и тропомиозина . Ученые считают, что мышцы сокращаются за счет скольжения двух типов нитей друг над другом, так что они больше перекрываются (рис. 5).
Границы | Структура гигантских мышечных белков
Титин, обскурин и небулин — все это гигантские специфичные для мышц белки, которые играют ключевую роль в организации, силе и развитии саркомера. Размер (все> 500 кДа) и очевидная гибкость этих молекул препятствовали традиционному определению структуры. Однако благодаря интеграции и творческому использованию нескольких инструментов структурного выяснения, включая кристаллографию, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и электронную микроскопию (EM), согласованные усилия по полному описанию структуры и динамики этих систем в стадии реализации.Здесь мы рассмотрим современное понимание структуры гигантского мышечного белка. Титин и обскурин в основном состоят из связанных, но различных модульных доменов, тогда как небулин имеет более повторяющуюся и простую повторяющуюся структуру.
Домены Ig и FnIII
И тайтин, и обскурин состоят преимущественно из Ig (иммуноглобулин) или FnIII (фибронектин типа III) -подобных доменов. Титин может иметь около 300 доменов, а обскурин может содержать почти 70, в зависимости от изоформы [обзор в Kontrogianni-Konstantopoulos et al.(2009)]. Каждый из этих доменов имеет длину около 100 остатков и складывается независимо (Pfuhl and Pastore, 1995; Pfuhl et al., 1995; Improta et al., 1996). Оба типа доменов состоят из двух β-листов, упакованных лицом к лицу, чтобы сформировать β-сэндвич, удерживаемый вместе консервативным гидрофобным ядром (Campbell and Spitzfaden, 1994; Harpaz and Chothia, 1994). FnIII-подобная складка состоит из антипараллельных β-цепей ABE, образующих первый лист, и DCFG во втором листе (рис. 1B). Складки Ig аналогичны, за исключением того, что цепь D расположена в первом β-листе (рис. 1A), а дополнительная фланкирующая β-цепь на втором листе также может быть включена в складку Ig.Следовательно, нити ABED образуют первый лист, а нити (Cʹ) CFG (Aʹ) создают второй. Большинство складок Ig как тайтина, так и обскурина принадлежат к промежуточному типу I-набора суперсемейства Ig [названному так из-за их общих или промежуточных характеристик между C (константным) и V (вариабельным) доменами в антителах] (Harpaz and Chothia , 1994; Pfuhl, Pastore, 1995). Ig-подобные складки гигантских мышечных белков могут отклоняться от прототипической складки Ig за счет включения неканонической структуры цепей A, Aʹ и Cʹ, а также наличия меньшего количества взаимодействий между петлями Aʹ-B и E-F (Tskhovrebova and Trinick, 2004).
Рисунок 1. Рисунок (слева) и схема (справа) типичного (A) иммуноглобулиноподобного домена (M7 тайтина; pdb 3PUC) и (B) домена фибронектина типа III (домен тайтина A77; pdb 3LPW ). Синий — это N-конец, а красный — C-конец.
И в тайтине, и в обскурине домены Ig обладают ~ 40% консервативностью последовательности (Witt et al., 1998; Fraternali and Pastore, 1999; Young et al., 2001). Большинство высококонсервативных остатков расположены в ядре β-сэндвича.Это приводит к RMSD попарного остова <1,5 Å между доменами Ig. Напротив, экспонированные растворителем остатки существенно различаются между доменами и являются основой специфичности связывания мишеней доменов тайтина и обскурина (Mueller et al., 2007; Kontrogianni-Konstantopoulos et al., 2009; Pernigo et al., 2010). ). Недавние работы показали, что ориентация между тандемными доменами также может быть важна для нормальной функции белков (Pinotsis et al., 2006; Zou et al., 2006).
Определение структуры Ig и FnIII
Индивидуальные домены FnIII и Ig складываются независимо, могут быть легко очищены и стабильны в высоких концентрациях при комнатной температуре в течение месяцев.Структуры с высоким разрешением для доменов Ig и FnIII тайтина и обскурина показывают, что как кристаллография, так и методы ЯМР дают надежно точные структуры (см. Таблицу 1). В дополнение к этим методам эксперименты с SAXS используются для создания большинства структур с низким разрешением в литературе, хотя иногда также используется крио-ЭМ [например: (Von Castelmur et al., 2008; Jeffries et al., 2011; Al-Khayat et al., 2013) для крио-ЭМ и (Marino et al., 2005; Vazina et al., 2006; Von Castelmur et al., 2008; Bucher et al., 2010; Цховребова и др., 2010) для МУРР]. Для рентгеновской кристаллографии домены тайтина и обскурина чаще всего кристаллизуются в различных концентрациях сульфата аммония. Разрешение для одиночных доменов Ig варьируется от 0,96 до 2,10 Å, а разрешение нескольких тандемных доменов составляет от 1,40 до 3,30 Å. Структуры ЯМР проводят при температуре от 25 до 37 ° C, при значениях pH 4,8–7,5 в средней соли (обычно 100 мМ NaCl, 20 мМ Tris- d11 ) и при концентрациях белка от 5 до 11 мг / мл с использованием традиционных гетероядерных многомерных измерений. Методы ЯМР.Эксперименты SAXS, часто проводимые на конструкциях с тандемным доменом, обычно проводят при значениях pH 7,5, 15–20 ° C с использованием широкого диапазона солей (50 мМ – 1 М NaCl). Для этих испытаний используются концентрации белка от 1 до 25 мг / мл. Все эксперименты SAXS проводятся при нескольких концентрациях, при этом не сообщается о систематических ошибках, связанных с агрегацией белков.
Таблица 1. Доменные структуры тайтина, обскурина и небулина .
Стабильность и динамика Ig и FnIII
Из-за его центральной роли в стабильности мышц и передаче сигналов о растяжении, механическая и химическая стабильность тайтина была тщательно изучена.Индивидуально выраженные домены тайтина термически разворачиваются между 35 и 70 ° C, хотя домены из области I-полосы тайтина (см. Рисунок 2 для справки) обычно более термически и химически стабильны, чем домены из A-полосы (Politou et al., 1995). Условия, которые имитируют среду молекулярного скопления, обычно повышают стабильность (Bolis et al., 2004). Исследования динамики ЯМР репрезентативных доменов Ig показывают, что практически весь домен Ig, за вычетом N- и C-концов и некоторых остатков в петлях, имеет параметры порядка больше 0.8, указывая на то, что отдельные домены чрезвычайно стабильны (Pfuhl et al., 1997; Nicastro et al., 2004).
Рис. 2. Схема расположения небулина (зеленый), обскурина (синий) и тайтина (красный) в саркомере . Небулин ориентирован своим C-концом в Z-диске, Obscurin ориентирован своим N-концом на M-линии, а его C-конец связан с саркоплазматическим ретикулумом, а тайтин ориентирован своим N-концом на Z-диске. и его C-конец на M-линии.
Во многих статьях описывается механическое разворачивание доменов тайтина [среди прочего: (Rief et al., 1998, 2000; Ли и Фернандес, 2003 г .; Гарсия и др., 2009; Stacklies et al., 2009; Ягава и др., 2010)]. FnIII-подобные структуры разворачиваются при меньших силах, чем домены Ig (100-200 пН против 150-300 пН) (Rief et al., 1998). Поскольку домены FnIII обнаруживаются только в A-полосе, где тайтин экстенсивно взаимодействует с толстым филаментом, эти домены, вероятно, не вносят значительного вклада в механическую стабильность тайтина in vivo (Wang et al., 1992). В I-полосе те Ig домены, которые наиболее легко разворачиваются (150 пН), расположены рядом с Z-диском, в то время как домены с промежуточной механической стабильностью (~ 200 пН) находятся в центре I-полосы и те, которые способны разворачиваться. выдерживают самые сильные силы (250–300 пН) вблизи перехода A / I (Rief et al., 1998; Ли и др., 2002; Watanabe et al., 2002; Ли и Фернандес, 2003). Хотя вероятность разворачивания домена в неповрежденном саркомере мала, такое событие может произойти, если мышца сильно растянута, и разворачивание будет распространяться от Z-диска через I-полосу к A / I-соединению. Домены Ig могут повторно складываться в течение нескольких секунд после того, как натяжение полипептида уменьшилось и молекула белка полностью расслабилась (Kellermayer et al., 1997; Linke et al., 1998; Rief et al., 1998). Одна из современных моделей поведения тайтина в ответ на растяжение состоит в том, что феномен механического разворачивания / рефолдинга защищает белок от необратимого повреждения из-за сильного перенапряжения мышц [Более подробный обзор по этой теме см. В (Цховребова и Триник, 2004)] .Из 37 Ig-подобных доменов гигантских мышечных белков, которые были расшифрованы (см. Таблицу 1), только один (тайтин I1) содержит дисульфидную связь (Mayans et al., 2001). Эта связь находится между остатками в цепях C и E, вместо более типичного соединения цепей B и F. Присутствие дисульфидных связей в доменах титина Ig, особенно в I-полосе, может придавать дополнительную стабильность механическому растяжению и участвовать в окислительном стрессе клеточной реакции, вызванном травмой мышц или усталостью (Mayans et al., 2001).
Архитектура Титина в Саркомере
Титин — самый крупный из известных полипептидов, его размер составляет 1 мкм в половине саркомера (см. Рисунок 2). Его N-конец заякорен в Z-диске и широко взаимодействует с др. Белками Z-диска (Gautel et al., 1999). В соседней области I-полосы тайтин состоит в основном из доменов Ig, предположительно неструктурированной области N2A и N2B и области PEVK. Область группы тайтина I участвует в меньшем количестве белок-белковых взаимодействий, чем остальная часть молекулы, и вносит свой вклад в большинство эластичных свойств тайтина.Область А-полосы тайтина состоит в основном из FnIII-подобных доменов и доменов Ig и имеет обширные взаимодействия с миозином, миозин-связывающим белком C (MyBP-C) и другими белками, связанными с толстыми филаментами [обзор в Kontrogianni-Konstantopoulos et al. . (2009)]. C-конец тайтина, обсуждаемый в следующем абзаце, встроен в M-линию и содержит домен киназы и домены Ig, которые разделены неструктурированными M-вставками.
Прямая механочувствительность обеспечивается за счет единственной ферментативно активной области тайтина, домена киназы М-линии.Недавние статьи показали, что эта область активируется посредством некоторой степени механического разворачивания (при силе> 30 пН), что, в свою очередь, дает сигнал миоцитам распознавать и приспосабливаться к изменяющимся силам сокращения мышц (Linke, 2008; Puchner et al., 2008; Linke, Kruger, 2010; Gautel, 2011a). Утрата этой механической сенсорной способности приводит к деформированию саркомеров и, в более глобальном масштабе, к сердечной атрофии и смерти мышей (Peng et al., 2005; Weinert et al., 2006). Другие части тайтина, хотя они, вероятно, также важны для механочувствительности, не обладают внутренней ферментативной активностью, и, следовательно, активация растяжения сигнала должна происходить косвенно через взаимодействия белок-белок.
Структура Титина на Z-диске
В Z-диск саркомера встроено 10 Ig доменов тайтина. Для общей схемы всей молекулы тайтина по отношению к саркомеру см. (Kontrogianni-Konstantopoulos et al., 2009). Структуры высокого разрешения существуют для двух областей Z-диска тайтина; крайний N-конец (Z1Z2, обозначающий 1-й и 2-й домены в Z-диске саркомера; этот вид номенклатуры является наиболее распространенным способом маркировки различных доменов тайтина) и небольшой пептид между 3-м и 4-м доменами Ig .Этот пептид является частью второй Z-вставки (первая находится между Z2 и Z3). При связывании с щелью в EF-руке α-актинина ( K D от 100 нМ до 4 мкМ) часть этой Z-вставки образует α-спираль (Joseph et al., 2001).
Тандемные домены Z1 и Z2 кристаллизовались в двух разных ориентациях в одном кристалле (Marino et al., 2006). В обеих этих конформациях отдельные домены Ig почти идентичны по структуре и температурному фактору; однако относительная ориентация Z1 и Z2 значительно изменяется от общей формы «V» до полностью вытянутой.Данные SAXS и ЯМР показывают, что структура раствора Z1Z2 относительно расширена, но не до такой степени, как показывают рентгеновские данные (Marino et al., 2005, 2006). Данные ЯМР HSQC показывают, что остатки в шарнирной области между Z1 и Z2 имеют одинаково сильные сигналы по сравнению с другими остатками в белке, и эти линкерные остатки показывают только один пик на остаток. Такие данные согласуются с областью линкера, которая не очень динамична. В сочетании с данными рентгеновского излучения становится очевидным, что, хотя молекула Z1Z2 преимущественно находится в фиксированной, в основном протяженной ориентации, возможны конформации других доменов, но они не являются «предпочтительными» без какого-либо химического, биохимического или механического сигнала (Марино и другие., 2006; Пиноцис и др., 2006; Zou et al., 2006; Ли и др., 2007). Этот умеренно жесткий линкер был неожиданным, поскольку обычно тайтин представлялся как серия бусинок (домены Ig и FnIII) на нити (линкеры между доменами). Основанная на Z1Z2 и других структурах (обсуждаемых ниже), такая модель явно чрезмерно упрощена (Marino et al., 2005, 2006). Несколько исследований теперь показывают, что ориентация доменов Ig относительно их соседей не является стохастической, а вместо этого обычно фиксирована и диктуется химическим составом как линкерной области, так и междоменных петель, которые составляют интерфейс домен / домен.(Марино и др., 2005; Мюллер и др., 2007; Бухер и др., 2010).
Одна телеологическая возможность, почему эта Z-область тайтина будет предпочтительно поддерживать фиксированную, расширенную ориентацию домен-домен, состоит в том, чтобы способствовать связыванию лиганда и специфичности. Эта гипотеза предлагается путем сравнения структур несвязанного-Z1Z2 со структурой Z1Z2, связанного с его молекулярной мишенью телетонином. (Mues et al., 1998; Zou et al., 2006). Этот комплекс Z1Z2-telethonin помогает ориентировать тайтин в саркомере и отвечает за выравнивание тайтина в прямой ориентации голова к голове на Z-линии.При сравнении структурных данных несвязанной и связанной версий Z1Z2 очевидно, что несвязанный Z1Z2 принимает расширенную конформацию, которая близка к его конформации, связанной с лигандом. Таким образом, присутствие жесткого удлиненного линкера может либо помочь в ориентации Z1Z2 для участия в продуктивном связывании лиганда, либо помочь сделать связывание лиганда более энергетически выгодным.
Функциональные разветвления взаимодействий тайтина с Z-диском являются предметом споров. Согласно одной теории, высокое сродство тайтина к его мишени Z-диска делает эту область плохим механосенсором; потребовалось бы слишком много силы, чтобы напрямую разорвать это межбелковое взаимодействие (Gautel, 2011b).С другой стороны, взаимодействие тайтин-телетонин механически сильно только в одном направлении (Bertz et al., 2009). Морфология Z-диска меняется с «маленького квадрата» на «плетеную корзину» при активации мышц, и это изменение макромолекулярной структуры должно приводить к другим механическим силам, таким как напряжение, напряжение сдвига и крутящий момент, действующие на белки в Z-диске. (Перц-Эдвардс и Риди, 2011). Таким образом, хотя сам тайтин обычно рассматривается как датчик длины, который реагирует на растяжение, Z-дисковая часть тайтина и, в частности, комплекс Z1Z2-телетонин, могут реагировать на эти другие механические стимулы, индуцированные Z-диском, и, соответственно, действовать. в качестве датчика натяжения (Knoll et al., 2002; Zou et al., 2006; Bertz et al., 2009). Это предположение подтверждается недавним открытием, что телетонин не играет роли в механической стабильности саркомерного Z-диска и, вероятно, участвует в передаче механосигналов (Markert et al., 2010; Knoll et al., 2011). Одна интригующая возможность состоит в том, что CSRP3 (MLP) и titin оба взаимодействуют с telethonin подобным головоломке способом, чтобы сформировать мультимодальный механосенсор (Lee et al., 2006). Благодаря своей длине и модульной архитектуре, тайтин, вероятно, может опосредовать передачу сигналов от нескольких разных типов источников параллельно.Таким образом, нижележащие сигналы, опосредованные тайтином, которые возникают из-за различных видов механических сигналов (например, растяжение в полосе А и напряжение на Z-диске) не исключают друг друга и фактически могут передавать как различающуюся, так и / или перекрывающуюся информацию. .
Структура Титина в I-диапазоне
Полоса тайтина I состоит в основном из доменов Ig (всего примерно 105 в этой области), но также содержит область PEVK и области N2A и N2B. Из них были решены структуры многих областей Ig, как и области PEVK.В нескольких статьях показано, что различные тандемные домены Ig в полосе I не перемещаются свободно относительно друг друга, а, как и в структурах Z-диска, вместо этого относительно фиксированы в вытянутой ориентации (Improta et al., 1998; Marino et al. , 2005). Эта физическая особенность создается стерическими препятствиями короткого линкера между доменами (2–3 остатка), а также взаимодействиями домен-домен на интерфейсах Ig / Ig (Improta et al., 1998). Основываясь на этих данных, Von Castelmur et al. опубликовали тщательное исследование, показывающее, что более длинная нить Ig (шесть связанных доменов Ig) также образует удлиненную структуру со случайными точками шарнира между специфическими доменами Ig (рис. 3A) (Von Castelmur et al., 2008). На основе этих данных авторы представляют модель, в которой модули тайтина поли-Ig не действуют как цепочка или нить бус, а ведут себя больше как «столярная линейка» с дискретными энтропийными точками по длине филамента. Эта же модель может быть более широко применима к др. Многодоменным модульным белкам, таким как MyBP-C (Jeffries et al., 2011). В отличие от доменов Z1Z2, эта расширенная ориентация I-полосы не участвует в связывании какого-либо известного лиганда. Выпрямление точек шарнира при низких усилиях (~ 5 пН), наряду с расширением области PEVK (обсуждается ниже) при несколько более высоких усилиях, в значительной степени отвечает за эластичность тайтина при физиологически значимых силах растяжения (Lee et al., 2007). Существует некоторая дискуссия о том, может ли эта модель в достаточной мере объяснить все упругие свойства тайтина (Politou et al., 1995), но до сих пор не существовало альтернативной теории, которая учитывала бы как структурные данные, так и упругие свойства I-полосы. представлен.
Рисунок 3. Надстройка тайтина. (A) I65-I70, как определено с помощью SAXS и рентгеновской кристаллографии. Эта структура показывает как «жесткий» удлиненный сегмент, так и точку шарнира. Воспроизведено с разрешения Von Castelmur et al.(2008). (B) SAXS-модель 11-доменного супер-повтора тайтина в A-полосе. Здесь хорошо видна спиральная закрутка молекулы тайтина. Воспроизведено с разрешения Цховребовой и др. (2010). (C) Показывает тот же самый супер-повтор тайтина, выделенный желтым цветом, нанесенный на полную толстую нить, как это может выглядеть in vivo . Воспроизведено с разрешения Al-Khayat et al. (2013).
ПЭВК
PEVK-область тайтина, расположенная в I-полосе, представляет собой повторяющуюся последовательность из 28 остатков, состоящую в основном из P, E, V или K и имеющую длину от менее 200 остатков в кардиомиоцитах человека до 2174 остатков в камбаловидной мышце человека. мышца.Множественные белки взаимодействуют с этой гибкой областью тайтина, предполагая, что домен PEVK является основным звеном между биохимическими сигнальными путями и физическим растяжением саркомера. Среди других взаимодействующих партнеров PEVK может связываться с PKG, связанной с расслаблением мышц, S100A1, связанным с высвобождением кальция, и доменом небулина Sh4 (Politou et al., 1998; Yamasaki et al., 2001; Kruger and Linke, 2009). Сначала была выдвинута гипотеза, что область PEVK тайтина была однородно неупорядоченной, и ее цель заключалась исключительно в создании упругого сопротивления, необходимого для удлинения тайтина внутри саркомера.Эта модель предполагает чисто энтропийный пружинный механизм для учета сопротивления растяжению (Bang et al., 2001). Здесь полипептид начинает релаксировать в случайной ориентации (состояние с высокой энтропией). Поскольку полипептидная цепь растягивается, допускается меньшее количество конформаций. Это снижает энтропию и приводит к более высокому состоянию полной энергии и увеличению сопротивления (Nagy et al., 2005). Эта модель может объяснить мягкую эластичность тайтина при малых усилиях; однако Ма и др. . опубликовали серию статей, показывающих, что область PEVK имеет частично структурированные элементы, вкрапленные среди неупорядоченных областей (Рисунок 4).
Рисунок 4. Структура ПЭВК. (A) Ансамбль ЯМР области из 12 остатков PEVK, показывающий как спираль полипролина типа II, так и фланкирующие неструктурированные области. (B) модель области PEVK, объединяющая три короткие структуры ЯМР вместе. Остатки окрашены в соответствии с их химическими свойствами (красный — отрицательный заряд, синий — положительный заряд, зеленый — пролин, черный — гидрофобный). Воспроизведено с разрешения Ma et al. (2001).
В состоянии покоя каждый повтор PEVK содержит короткие (6–10 остатков) последовательности умеренно жесткой спирали полипролина типа II, фланкированные случайными спиралями (Ma et al., 2001). Cu 2+ связывается со специфическими участками повтора PEVK и изменяет структуру от полипролиновой спирали до β-поворота (Ma and Wang, 2003a). Кроме того, изменения окружающей среды, такие как диэлектрическая проницаемость или температура, переводят структуру PEVK из полипролиновой спирали в β-виток или в случайную катушку (Ma et al., 2001; Ma and Wang, 2003a, b). Сходным образом связывание с белками может значительно влиять на структуру PEVK и, следовательно, на эластичность (Ma and Wang, 2002; Ma et al., 2006). Ни одно из этих изменений в структуре PEVK не является кооперативным ни в пределах повтора PEVK, ни между повторами PEVK.Таким образом, в этой пересмотренной модели каждый повтор PEVK вносит вклад в мягкую эластичность тайтина при слабых силах (5-50 пН) посредством постепенного превращения по длине сегмента PEVK от спирали или β-витка в удлиненный пептид. По сути, область PEVK функционирует как модифицированная энтропийная пружина, содержащая участки квазистабильных структур, которые настраиваются в зависимости от изменений внутриклеточных условий.
N2A и N2B
Большинство изоформ тайтина содержат область N2A и / или N2B, которая расположена на N-конце области PEVK.Хотя последовательность и партнеры по связыванию могут различаться между изоформами, эти области имеют общую организацию из 3-4 доменов Ig, вкрапленных среди предположительно неупорядоченных последовательностей. Как обсуждалось ранее, наблюдаются большие конформационные изменения макромолекул в области I-полосы тайтина при растяжении и релаксации. Область N2A / N2B / PEVK, содержащая множество частично неструктурированных и гибких последовательностей, особенно чувствительна к этим изменениям. Поэтому неудивительно, что эта область участвует во множестве несаркомерных сигнальных путей, на которые влияет передача сигналов растяжения.Напр., FHL-1 обеспечивает регулируемое Erk-2 фосфорилирование интер-Ig области тайтина (Raskin et al., 2012). Взаимодействие FHL-1 / тайтин связывает внеклеточные сигналы с транскрипцией посредством ответа растяжения (Sheikh et al., 2008). Другие партнеры по связыванию тайтина с N2A и N2B взаимодействуют с доменами Ig вместо неструктурированных участков; например, P94 / кальпаин 3 связывается с доменами I82 и I83 Ig, опосредуя саркомерное ремоделирование (Sorimachi et al., 1995; Beckmann and Spencer, 2008). Более полный список связывающих партнеров можно найти в Kontrogianni-Konstantopoulos et al.(2009).
Структура Титина в А-диапазоне
Сегменты I-полосы и A-полосы тайтина в основном состоят из модульных доменов Ig или из доменов FnIII и Ig, соответственно. Несмотря на это очевидное сходство в структурной организации, в настоящее время имеются хорошие экспериментальные доказательства того, что эти две области тайтина ведут себя по-разному в растворе. Тандемные домены из A-диапазона имеют более обширные и более структурированные интерфейсы домен / домен, чем те из I-диапазона (Mueller et al., 2007; Bucher et al., 2010). Как и в I-полосе, границы раздела домен / домен внутри области титина A-полосы, по-видимому, диктуют общую конформацию раствора (Bucher et al., 2010). На интерфейсе A-полоса / M-линия линкер домена становится значительно более структурированным и принимает конформацию β-листа (Mueller et al., 2007; Steward et al., 2012).
А-полоса тайтина содержит несколько суперповторов из 7 или 11 доменов FnIII и Ig. Структурные исследования 11-доменного супер-повтора с низким и высоким разрешением предполагают, что этот сегмент тайтина принимает расширенную спиральную ориентацию и, вероятно, может образовывать гомодимер (Рисунок 3B) (Mueller et al., 2007; Bucher et al., 2010; Цховребова и др., 2010). Эти данные хорошо согласуются с нынешним пониманием того, как организована толстая филамент, и фактически этот спиральный гомодимер тайтина легко включается в детальную модель полного толстого филамента (Figure 3C) (Al-Khayat et al., 2013). Таким образом, вероятно, что суперповторы тайтина с А-полосой существуют примерно в такой же конформации в партнерстве со своими естественными партнерами по связыванию, как и сами по себе в растворе.
Структура Титина в линии М
M-линия саркомера содержит домен титинкиназы вместе с 10 доменами Ig тайтина, которые разделены неструктурированными M-вставками различной длины.Были решены отдельные структуры высокого разрешения киназного домена Ser / Thr, M1, M4, M5, M7 и M10 (Таблица 1). M10 также был решен в присутствии партнера по связыванию, домена Ig1 обскурин-подобного белка (OL1) (Pernigo et al., 2010; Sauer et al., 2010). Фактически нет никакой разницы в одном домене M10 или связанном с мишенью (RMSD 0,66 Å), даже на границе раздела лиганда. Взаимодействие M10-OL1 происходит на одной из длинных осей молекулы M10. Взаимодействие осуществляется за счет гидрофобных взаимодействий (TΔS связывания = 12.0 ккал / моль; ΔH = 3.87 ккал / моль), и поверхность раздела стабилизируется за счет множественных водородных связей основной цепи между B-цепью тайтина и G-цепью OL1 (Pernigo et al., 2010). Также обнаружены некоторые особенности этого события связывания, в том числе наличие межсубъединичных Н-связей между β-цепями, стабилизация связывания через гидрофобные части и домен Ig, который демонстрирует только минимальную структурную перестройку и перестройку боковой цепи при связывании. в единственной другой структуре тайтина, связанной с его мишенью, с высоким разрешением — структуре Z1Z2 – телетонин (Marino et al., 2006; Zou et al., 2006; Перниго и др., 2010; Sauer et al., 2010).
Ser / Thr киназный домен тайтина относится к семейству киназ легкой цепи миозина. Хотя эта область все еще классифицируется как псевдокиназа, появляются новые доказательства того, что она участвует в передаче механохимических сигналов. Эта область состоит из регуляторного домена, содержащего предполагаемый сайт фосфорилирования и область связывания кальмодулина, и каталитического домена, который связывает как АТФ, так и субстрат (Mayans et al., 1998; Grater et al., 2005). Предполагается, что активация киназы требует воздействия на домен механической силы. Этот механический штамм физически открывает активный сайт АТФ, что затем позволяет домену тайтинкиназы фосфорилировать себя и, возможно, также нижестоящих эффекторов (Lange et al., 2005; Puchner et al., 2008). Этот механизм пока поддерживается только данными in vitro . Тем не менее, хотя это еще не доказано с помощью моделей нокаута или нокаута, это один из наиболее четко сформулированных примеров того, как механические стимулы могут быть преобразованы в химические сигналы с использованием одного белка.Мутации киназного домена вызывают наследственную миопатию с ранней дыхательной недостаточностью (HMERF) (Lange et al., 2005). Недавние данные о мутациях вне киназного домена также могут вызывать это заболевание. Эти находки подтверждают, что молекулярный механизм активации растяжения киназ более сложен, чем предполагалось вначале, и может включать множественные др. Сайты внутри тайтина (Ohlsson et al., 2012; Pfeffer et al., 2012). Более подробный обзор киназного домена можно найти в Kontrogianni-Konstantopoulos et al.(2009); Gautel (2011a); Temmerman et al. (2013).
Обскурин
Обскурин может связываться как с тайтином, так и с малым анкирином, и, таким образом, является единственным белком, который связывает саркомерный цитоскелет с окружающей системой мембран саркоплазматического ретикулума (рис. 2). Как и тайтин, обскурин состоит из серии модульных доменов Ig и FnIII. Крайний С-конец изоформы А обскурина немодульный и участвует в связывании малого анкирина (Young et al., 2001; Kontrogianni-Konstantopoulos et al., 2003; Контржианни-Константопулос и Блох, 2005; Borzok et al., 2007). Обскурин локализуется как в Z-диске, так и в M-линии при миофиброгенезе, и прежде всего в M-линии в миоцитах взрослых (Bang et al., 2001; Young et al., 2001; Kontrogianni-Konstantopoulos et al., 2003) . Однако этот паттерн не является общепринятым, отчасти потому, что антитела против разных эпитопов обскурина дают противоречивую информацию относительно локализации (Kontrogianni-Konstantopoulos and Bloch, 2005; Kontrogianni-Konstantopoulos et al., 2009). Эти противоречивые находки поднимают вопросы о важности и частоте вариантов сплайсинга (Bowman et al., 2007; Kontrogianni-Konstantopoulos et al., 2009). Когда антитела против N- и C-конца используются одновременно, обскурин окрашивается в ретикулярный паттерн, что предполагает, что он располагается на поверхности миофибриллы, а не пропитывается ею (Kontrogianni-Konstantopoulos et al., 2003).
Домены Ig обскурина
Одиннадцать доменов Ig обскурина А были определены индивидуально, в основном с помощью ЯМР-анализа (таблица 1).Кроме того, были решены шесть доменов Ig, которые принадлежат варианту сплайсинга. Все эти домены очень похожи, со средним парным среднеквадратичным отклонением 1,4 Å. В то время как линкерная последовательность между I-полосными доменами тайтиновых доменов обычно находится между 2-5 остатками, обскурин не имеет очевидной линкерной последовательности (Kontrogianni-Konstantopoulos et al., 2009). По крайней мере, одному партнеру по связыванию обскурина, домену ZIg9 / 10 тайтина, необходимы тандемные домены Ig обскурина для взаимодействия (Young et al., 2001). Таким образом, вероятно, что, подобно тайтину, относительная ориентация между доменами обскурина может быть важной для связывания мишени.
Обскурин создает единственную известную связь между саркомплазматической сетью и сократительным аппаратом. Это уникальное расположение указывает на роль обскурина как в мембранной, так и в цитоскелетной организации; obscurin нокаут и нокдаун эксперименты показывают нарушение регуляции как сарколеммы, так и латеральной саркомерной организации (Raeker et al., 2006; Raeker and Russell, 2011; Randazzo et al., 2013). (Предположительно) полугибкие тандемные домены Ig, которые включают большую часть обскурина, также представляют очевидный механизм защиты миофибриллы от повторяющихся сокращений и растяжений.В одной из таких моделей обскурин может преобразовывать силу сокращения мышц на окружающую мембрану и цитоскелетную систему, одновременно подавляя эту потенциально деструктивную механическую силу посредством модуляции архитектуры Ig-Ig.
Другие домены Obscurin
Обскурин содержит несколько не-Ig или FnIII-подобных доменов около С-конца молекулы, и из них домен гомологии плэкстрина (PH) и домен Sh4 обскурина имеют связанные с ними структуры высокого разрешения (Blomberg et al., 2000). Домен Sh4 типичен по структуре и в настоящее время не имеет известных партнеров по связыванию. По соседству с этим доменом находится модуль RhoGEF и домен PH (Blomberg et al., 2000). Эти тандемные домены могут связываться с Ran-связывающим белком 9 и RhoA и участвуют в передаче сигналов GTPase, ремоделировании актина и актин-мембранных связях, а также в модуляции синтеза белка (Bowman et al., 2008; Ford-Speelman et al., 2009) . RhoA может быть активирован посредством нескольких предшествующих событий, включая изменения концентрации ионов и другие сигналы.Таким образом, активация RhoA обскурином является первым звеном между внутриклеточной саркомерной функцией и другими внеклеточными факторами, все из которых, по-видимому, могут иметь общие, по крайней мере, некоторые из тех же путей клеточного ответа (Ford-Speelman et al., 2009) [обзор в Miyamoto et al. (2010)].
Расположенный рядом с доменами RhoGEF и PH, домен IQ предполагает связь между передачей сигналов обскурина и кальмодулина. На С-конце молекулы некоторые изоформы обскурина имеют два киназных домена, для которых в настоящее время нет структур.В г. elegans , эти домены могут связываться как с LIM-9, так и с SCPL-1. Это альтернативная связь между мембранной сетью и сократительным аппаратом (Qadota et al., 2008; Xiong et al., 2009; Warner et al., 2013). Полная функция доменов обскуринкиназы все еще неясна, хотя на основании сходства последовательностей домен 1 может быть похож на MLCK, а домен 2, вероятно, является псевдокиназой. Программы предсказания структуры предполагают, что эти домены могут быть более похожи на домены тайтин / твичин киназы и, таким образом, могут иметь механочувствительную роль.Присутствие доменов Sh4, PH, RhoGEF и киназы показывает, что обскурин является фокусом саркомерной передачи сигналов; однако точные цели и, следовательно, точная природа этих сигналов еще предстоит описать. Для получения дополнительной информации о функции и роли обскурина в миоцитах см. (Kontrogianni-Konstantopoulos et al., 2009; Gautel, 2011b).
Небулин
Небулин (500-800 кДа) почти полностью состоит из простого повтора из ~ 35 остатков, который тесно связан с тонким филаментом через центральную консенсусную последовательность SDxxYK (Jin and Wang, 1991a, b).Почти 20 лет назад исследования CD и ЯМР показали, что весь повтор небулина принимает α-спиральную конформацию (Рисунок 5) (Pfuhl et al., 1994). Такая структура позволяет каждому повтору небулина вытягиваться на ~ 5.5 нм, что также является длиной мономера актина внутри тонкого филамента (Labeit and Kolmerer, 1995; Suzuki et al., 2000). С каждым полимером актина связаны две молекулы небулина, по одной для каждой стороны нити. Число субъединиц актина в тонком филаменте и количество повторов небулина (в каждом случае не менее 150 на тонкую нить) в сочетании с высоким сродством (диапазон нМ) между небулином и актином указывают на авидность между небулином и актином, что маловероятно. чтобы когда-либо диссоциировать in vivo (Jin and Wang, 1991b; Labeit et al., 1991; Pfuhl et al., 1996; Wang et al., 1996). Дальнейший анализ последовательности показывает, что повторы небулина можно сгруппировать в 22 участка по семь повторов, причем каждый «супер-повтор» предсказывается как длина одной молекулы тропомиозина, связанной с семью мономерами F-актина, ~ 38,5 нм (Korn, 1982; Kruger et al., 1991; Wang et al., 1996). Это совпадение длин плюс тот факт, что небулин также связывается с тропомиозином и другими ассоциированными с актином белками, поддерживает идею о том, что небулин полностью интегрирован в структуру тонкой нити (Jin and Wang, 1991a, b; Root and Wang, 1994 ; Ван и др., 1996). Такая ассоциация, вероятно, является критической для двух функций небулина: стабилизации полимеров актина и определения длины тонких филаментов (Kruger et al., 1991; Labeit et al., 1991; Bang et al., 2006; Witt et al., 2006). Из-за его тесной связи с F-актином и отсутствия ферментативной активности небулин является единственным гигантским мышечным белком, который напрямую не участвует в эластичности мышц.
Фигура 5. Структура раствора ЯМР одного репрезентативного полного повтора небулина (37 остатков) .RMSD этой структуры составляет 0,9 Å. Воспроизведено с разрешения Pfuhl et al. (1994).
Небулин ориентирован в саркомере так, что N-конец находится в I-полосе, тесно связанной с тонкой нитью. C-конец встроен в Z-диск. Эта конфигурация и регулирует структуру Z-диска, и прикрепляет небулин к окружающему цитоскелету (Millevoi et al., 1998). С-концевые ~ 18 повторов небулина по крайней мере частично встроены в Z-диск и не являются частью мотива супер-повторов.В этой области последовательность SDxxYK не так консервативна, как в остальной части молекулы, и, следовательно, эта область не связывается с актином. Гораздо более короткая изоформа, nebulette, присутствует в кардиальных клетках на Z-диске (Millevoi et al., 1998). Белок nebulette 100 кДа подобен небулину на С-конце, включая присутствие домена Sh4 (Eulitz et al., 2013). Однако у nebulette всего 23 копии характерного небулинового повтора, и предполагается, что он простирается только на 150 нм от края Z-диска (Millevoi et al., 1998; Литтлфилд и Фаулер, 2008 г.). Подобно небулину, nebulette, вероятно, действует путем стабилизации тонкой нити и играет роль в организации Z-диска (Littlefield and Fowler, 2008; Pappas et al., 2011).
Прогнозы структурной гомологии предполагают, что эти повторы небулина являются спиральными, и эти повторы могут связываться с другими структурными белками Z-диска, такими как α-актинин, CapZ, арчвиллин и десмин (Nave et al., 1990; Bang et al., 2002 ; Witt et al., 2006; Lee et al., 2008). С-конец этих повторов представляет собой богатый серином домен, который является потенциальным сайтом фосфорилирования небулина, за которым следует Lasp-подобный домен Sh4, который связывает богатые пролином последовательности в CapZ, миопалладине и области PEVK в тайтине (Politou et al. ., 1998, 2002; Банг и др., 2001; Паппас и др., 2008). В целом структурные мотивы небулина описывают хорошо закрепленную, длинную молекулу, которая эволюционировала, чтобы стабилизировать и организовать большое количество структурных особенностей тонкой нити.
Выводы
В изучении гигантских структур мышечных белков произошло два крупных прорыва. Во-первых, осознание того, что отдельные домены можно изучать вне контекста всей молекулы. Это позволило изучить множественные рентгеновские лучи и структуры раствора различных гигантских сегментов мышечного белка.Затем была возможность комбинировать структуры высокого разрешения с другими экспериментами со структурой / динамикой. Из этих анализов мы теперь имеем более тонкое представление о том, как положение одного домена относительно его соседа определяет общую форму белка, гибкость и связывание с мишенью. Текущие вопросы касаются взаимосвязи структура / функция / динамика гигантских мышечных белков. Например, какие факторы вызывают связывание целевого белка с одним доменом, но не с соседним доменом? Что диктует свойства «шарнирных участков» тайтина и где эти шарниры расположены? Обскурин тоже ведет себя как плотник? Как обскурин влияет на движение и растяжение мышц? Кроме того, многие ферментативные функции тайтина и обскурина только сейчас начинают обнаруживаться.Выяснение полного молекулярного механизма домена тайтинкиназы имеет ключевое значение для понимания того, как тайтин интегрируется с остальной частью клеточного аппарата. Аналогичным образом, определение партнеров связывания домена Sh4 обскурина, полное понимание нижестоящих эффекторов домена RhoGEF / PH и дальнейшее изучение потенциальных механочувствительных ролей доменов обскурин киназы — все это области, представляющие интерес для понимания ферментативных ролей гигантских мышечных белков. Наконец, роль небулина в организации Z-диска и механочувствительности изучается только сейчас.Ответы на эти нерешенные вопросы потребуют сочетания структурных и функциональных исследований. Процесс более полного понимания таких отношений, несомненно, приведет к более полному представлению о том, как эти молекулярные гиганты переплетаются с остальной частью саркомерного механизма.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Кристофера Берндсена и Трейси Колдуэлл за полезные обсуждения и помощь в редактировании этой рукописи.
Список литературы
Аль-Хаят, Х.А., Кенслер, Р.В., Сквайр, Дж. М., Марстон, С. Б., и Моррис, Э. П. (2013). Атомная модель миозиновой нити сердечной мышцы человека. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 110, 318–323. DOI: 10.1073 / pnas.1212708110
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Аткинсон, А., Jospeh, C., Kelly, G., Muskett, F., Frienkel, T., Nietlispach, D., et al. (2001). Ca 2+ -независимое связывание домена EF-hand с новым мотивом в комплексе α-актинин-тайтин. Nat. Struct. Биол . 8, 853–857. DOI: 10.1083 / nsb1001-853
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Bang, M. L., Centner, T., Fornoff, F., Geach, A. J., Gotthardt, M., McNabb, M., et al. (2001). Полная последовательность гена тайтина, экспрессия необычной изоформы тайтина весом приблизительно 700 кДа и ее взаимодействие с обскурином идентифицируют новую систему связывания Z-линии с I-полосой. Circ. Res . 89, 1065–1072. DOI: 10.1161 / чч3301.100981
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Банг М. Л., Грегорио К. и Лабейт С. (2002). Молекулярное рассечение взаимодействия десмина с С-концевой областью небулина. J. Struct. Биол . 137, 119–127. DOI: 10.1006 / jsbi.2002.4457
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Банг, М. Л., Ли, Х., Литтлфилд, Р., Бремнер, С., Тор А., Ноултон К. У. и др. (2006). Мыши с дефицитом небулина демонстрируют более короткую длину тонких волокон и сниженную сократительную функцию в скелетных мышцах. J. Cell Biol . 173, 905–916. DOI: 10.1083 / jcb.200603119
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Бекманн, Дж. С. и Спенсер, М. (2008). Calpain 3, «привратник» правильной сборки, оборота и обслуживания саркомеров. Neuromuscul. Дисорд . 18, 913–921. DOI: 10.1016 / j.нмд.2008.08.005
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Бертц М., Вильманнс М. и Риф М. (2009). Комплекс тайтин-телетонин представляет собой направленную сверхстабильную молекулярную связь в Z-диске мышцы. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 106, 13307–133310. DOI: 10.1073 / pnas.0
2106
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Бломберг, Н., Баральди, Э., Саттлер, М., Сарасте, М., и Нильгес, М. (2000). Структура домена PH из C.elegans мышечный белок UNC-89 предполагает новую функцию. Строение 8, 1079–1087. DOI: 10.1016 / S0969-2126 (00) 00509-8
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Болис Д., Политоу А. С., Келли Г., Пасторе А. и Темусси П. А. (2004). Стабильность белка в наноклетках: новый подход к влиянию на стабильность белка путем ограничения молекул. J. Mol. Биол . 336, 203–212. DOI: 10.1016 / j.jmb.2003.11.056
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Борзок, м.А., Катино, Д. Х., Николсон, Дж. Д., Контроджианни-Константопулос, А., и Блох, Р. Дж. (2007). Картирование сайта связывания на малом анкирине 1 для обскурина. J. Biol. Chem . 282, 32384–32396. DOI: 10.1074 / jbc.M704089200
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Боуман, А. Л., Катино, Д. Х., Стронг, Дж. К., Рэндалл, В. Р., Контроджианни-Константопулос, А., и Блох, Р. Дж. (2008). Домен фактора обмена нуклеотидов rho-guanine obscurin регулирует сборку тайтина на Z-диске посредством взаимодействий с Ran связывающим белком 9. Mol. Биол. Cell 19, 3782–3792. DOI: 10.1091 / mbc.E08-03-0237
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Bowman, A. L., Kontrogianni-Konstantopoulos, A., Hirsch, S. S., Geisler, S. B., Gonzalez-Serratos, H., Russell, M. W., et al. (2007). Различные изоформы обскурина локализуются в разных сайтах саркомеров. FEBS Lett . 581, 1549–1554. DOI: 10.1016 / j.febslet.2007.03.011
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Бухер, Р.М., Свергун, Д. И., Мюле-Голл, К., и Майя, О. (2010). Структура FnIII Tandem A77-A78 указывает на периодически консервативную архитектуру в миозин-связывающей области тайтина. J. Mol. Биол . 401, 843–853. DOI: 10.1016 / j.jmb.2010.06.011
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Eulitz, S., Sauer, F., Pelissier, M.C., Boisguerin, P., Molt, S., Schuld, J., et al. (2013). Идентификация белков Xin-повторов в качестве новых лигандов доменов Sh4 небулина и небулета и анализ их взаимодействия во время образования и ремоделирования миофибрилл. Mol. Биол. Ячейка 24, 3215–3226. DOI: 10.1091 / mbc.E13-04-0202
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Форд-Спилман, Д. Л., Рош, Дж. А., Боуман, А. Л., и Блох, Р. Дж. (2009). Домен фактора обмена нуклеотидов ро-гуанина обскурина активирует передачу сигналов rhoA в скелетных мышцах. Mol. Биол. Ячейка 20, 3905–3917. DOI: 10.1091 / mbc.E08-10-1029
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Гарсия, Т.И., Оберхаузер А. Ф. и Браун В. (2009). Механическая стабильность и дифференциально сохраняемые физико-химические свойства Ig-доменов тайтина. Белки 75, 706–718. DOI: 10.1002 / prot.22281
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Голл М., Пасторе А. и Нильгес М. (1998). Трехмерная структура модуля типа I из тайтина: прототип внутриклеточных доменов фибронектина типа III. Строение 6, 1291–1302.DOI: 10.1016 / S0969-2126 (98) 00129-4
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Тертер, Ф., Шен, Дж., Цзян, Х., Гаутель, М., и Грубмюллер, Х. (2005). Механически индуцированная активация тайтинкиназы изучалась с помощью моделирования молекулярной динамики силового зонда. Biophys. J . 88, 790–804. DOI: 10.1529 / biophysj.104.052423
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Harpaz, Y., and Chothia, C. (1994). Многие из доменов суперсемейства иммуноглобулинов в молекулах клеточной адгезии и поверхностных рецепторах принадлежат к новому структурному набору, который близок к набору, содержащему вариабельные домены. J. Mol. Биол . 238, 528–539. DOI: 10.1006 / jmbi.1994.1312
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Improta, S., Krueger, J. K., Gautel, M., Atkinson, R.A., Lefevre, J. F., Moulton, S., et al. (1998). Сборка иммуноглобулиноподобных модулей в тайтине: последствия для эластичности мышц. J. Mol. Биол . 284, 761–777. DOI: 10.1006 / jmbi.1998.2028
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Improta, S., Политу, А.С., и Пасторе, А. (1996). Иммуноглобулиноподобные модули из группы тайтин I: растяжимые компоненты эластичности мышц. Структура 4, 323–337. DOI: 10.1016 / S0969-2126 (96) 00036-6
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Джеффрис, К. М., Лу, Ю., Хинсон, Р. М., Тейлор, Дж. Э., Баллестерос, М., Кван, А. Х. и др. (2011). Человеческий кардиальный миозин-связывающий белок C: структурная гибкость в рамках расширенной модульной архитектуры. Дж.Мол. Биол . 414, 735–748. DOI: 10.1016 / j.jmb.2011.10.029
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Цзинь, Дж. П. и Ван, К. (1991a). Клонирование, экспрессия и взаимодействие белков человеческих небулиновых фрагментов, состоящих из различного числа модулей последовательности. J. Biol. Chem . 266, 21215–21223.
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст
Цзинь, Дж. П. и Ван, К. (1991b). Небулин как гигантский актин-связывающий матричный белок в саркомере скелетных мышц.Взаимодействие актина и клонированных фрагментов небулина человека. FEBS Lett . 281, 93–96. DOI: 10.1016 / 0014-5793 (91) 80366-B
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Джозеф, К., Стир, Г., О’Брайен, Р., Политоу, А. С., Аткинсон, Р. А., Бьянко, А., и др. (2001). Структурная характеристика взаимодействий между Z-повторами тайтина и С-концевым доменом альфа-актинина. Биохимия 40, 4957–4965. DOI: 10.1021 / bi002739r
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Келлермайер, М.С., Смит, С. Б., Гранзье, Х. Л. и Бустаманте, К. (1997). Сворачивание-разворачивание переходов в одиночных молекулах тайтина, характеризуемых с помощью лазерного пинцета. Наука 276, 1112–1116. DOI: 10.1126 / science.276.5315.1112
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Нолл Р., Хошидзима М., Хоффман Х. М., Персона В., Лоренцен-Шмидт И., Банг М. Л. и др. (2002). Механизм сердечного механического датчика растяжения включает комплекс Z-диска, который является дефектным в подгруппе дилатационной кардиомиопатии человека. Cell 111, 943–955. DOI: 10.1016 / S0092-8674 (02) 01226-6
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Knoll, R., Linke, W. A., Zou, P., Miocic, S., Kostin, S., Buyandelger, B., et al. (2011). Дефицит телетонина связан с дезадаптацией сердца млекопитающих к биомеханическому стрессу. Circ. Res . 109, 758–769. DOI: 10.1161 / CIRCRESAHA.111.245787
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Контроджианни-Констанопулос, А., Аккерман, М. А., Боуман, А. Л., Яп, С. В., и Блох, Р. Дж. (2009). Мышечные гиганты: молекулярные каркасы в саркомерогенезе. Physiol. Ред. . 89, 1217–1267. DOI: 10.1152 / Physrev.00017.2009
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Контржианни-Константопулос, А., Джонс, Э. М., Ван Россум, Д. Б., и Блох, Р. Дж. (2003). Обскурин является лигандом малого анкирина 1 в скелетных мышцах. Mol. Биол. Cell 14, 1138–1148. DOI: 10,1091 / mbc.E02-07-0411
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Корн, Э. Д. (1982). Полимеризация актина и ее регуляция белками немышечных клеток. Physiol. Ред. . 62, 672–737.
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст
Крюгер, М., Райт, Дж. И Ван, К. (1991). Небулин как регулятор длины тонких волокон скелетных мышц позвоночных: соотношение длины тонких волокон, размера небулина и профиля эпитопа. Дж.Клеточная Биол . 115, 97–107. DOI: 10.1083 / jcb.115.1.97
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лабейт С., Гибсон Т., Лейки А., Леонард К., Зевиани М., Найт П. и др. (1991). Доказательства того, что небулин является белком-правителем в тонких мышечных волокнах. FEBS Lett . 282, 313–316. DOI: 10.1016 / 0014-5793 (91) 80503-U
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лабейт С. и Колмерер Б. (1995). Полная первичная структура человеческого небулина и ее соотношение со структурой мышц. J. Mol. Биол . 248, 308–315. DOI: 10.1016 / S0022-2836 (95) 80052-2
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Lange, S., Xiang, F., Yakovenko, A., Vihola, A., Hackman, P., Rostkova, E., et al. (2005). Киназный домен тайтина контролирует экспрессию мышечных генов и обмен белков. Наука 308, 1599–1603. DOI: 10.1126 / science.1110463
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ли, Э. Х., Гао, М., Пиноцис, Н., Вильманнс, М., и Шультен, К. (2006). Механическая прочность комплекса тайтин Z1Z2-телетонин. Структура 14, 497–509. DOI: 10.1016 / j.str.2005.12.005
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ли, Э. Х., Синь, Дж., Майя, О. и Шультен, К. (2007). Эластичность вторичной и третичной структуры тайтина Z1Z2 и модель цепи тайтина. Biophys. J . 93, 1719–1735. DOI: 10.1529 / biophysj.107.105528
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ли, М.А., Джу, Ю. М., Ли, Ю. М., Ким, Х. С., Ким, Дж. Х., Чой, Дж. К. и др. (2008). Арчвиллин закрепляется на Z-линии скелетных мышц через С-конец небулина. Biochem. Биофиз. Res. Коммуна . 374, 320–324. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2008.07.036
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ли, Х., Фернандес, Дж. М. (2003). Механическая конструкция первого проксимального домена Ig сердечного тайтина человека, выявленного с помощью спектроскопии одиночных сил. Дж.Мол. Биол . 334, 75–86. DOI: 10.1016 / j.jmb.2003.09.036
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ли, Х., Линке, В. А., Оберхаузер, А. Ф., Каррион-Васкес, М., Керквлиет, Дж. Г., Лу, Х. и др. (2002). Обратная инженерия гигантского мышечного белка тайтина. Nature 418, 998–1002. DOI: 10.1038 / nature00938
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Линке, В. А. (2008). Чувство и растяжимость: роль тайтина и связанных с ним белков в чувствительности миокарда к стрессу и механической дисфункции. Cardiovasc. Res . 77, 637–648. DOI: 10.1016 / j.cardiores.2007.03.029
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Линке, В. А., Штокмайер, М. Р., Ивемейер, М., Хоссер, Х. и Мундель, П. (1998). Характеристика области Ig домена I-диапазона тайтина как энтропийной пружины. J. Cell Sci . 111 (pt 11), 1567–1574.
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст
Литтлфилд, Р. С., Фаулер, В. М. (2008). Регулирование длины тонких волокон в саркомерах поперечнополосатых мышц: динамика заостренных концов выходит за рамки небулиновой линейки. Семин. Cell Dev. Биол . 19, 511–519. DOI: 10.1016 / j.semcdb.2008.08.009
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ма, К., Форбс, Дж. Г., Гутьеррес-Крус, Г., и Ван, К. (2006). Титин как гигантский каркас для интеграции стрессовых и опосредованных доменом 3 гомологии Src сигнальных путей: кластеризация новых перекрывающихся лигандных мотивов в эластичном сегменте PEVK. J. Biol. Chem . 281, 27539–27556. DOI: 10.1074 / jbc.M604525200
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
млн лет, К., и Ван, К. (2002). Взаимодействие домена Sh4 небулина с тайтином PEVK и миопалладином: влияние на сигнальную и сборочную роль тайтина и небулина. FEBS Lett . 532, 273–278. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (02) 03655-4
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ма, К., и Ван, К. (2003a). Связывание ионов меди (II) со спиралями полипролина II модулей PEVK гигантского эластичного белка тайтина, что выявлено с помощью ESI-MS, CD и ЯМР. Биополимеры 70, 297–309.DOI: 10.1002 / bip.10477
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ма, К., и Ван, К. (2003b). Податливая конформация эластичного сегмента ПЭВК тайтина: некооперативное взаимопревращение спирали полипролина II, бета-витка и неупорядоченных структур. Biochem. J . 374, 687–695. DOI: 10.1042 / BJ20030702
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Марино М., Свергун Д. И., Креплак Л., Конарев П. В., Мако Б., Labeit, D., et al. (2005). Тандемы поли-Ig из тайтина I-полосы разделяют расположение расширенных доменов независимо от отличительных особенностей их модульных составляющих. J. Muscle Res. Сотовый Motil . 26, 355–365. DOI: 10.1007 / s10974-005-9017-6
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Марино, М., Зоу, П., Свергун, Д., Гарсия, П., Эдлич, К., Саймон, Б. и др. (2006). Дублет Ig Z1Z2: модельная система для гибридного анализа конформационной динамики тандемов Ig из тайтина. Структура 14, 1437–1447. DOI: 10.1016 / j.str.2006.07.009
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Маркер, К. Д., Мини, М. П., Фолькер, К. А., Грейндж, Р. В., Далли, Х. У., Канн, Дж. К. и др. (2010). Функциональный мышечный анализ мышей с нокаутом Tcap. Hum. Мол. Генет . 19, 2268–2283. DOI: 10.1093 / hmg / ddq105
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Майя, О., Ван Дер Вен, П. Ф., Wilm, M., Mues, A., Young, P., Furst, D.O., et al. (1998). Структурная основа активации домена тайтинкиназы во время миофибриллогенеза. Природа 395, 863–869. DOI: 10.1038 / 27603
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Майя, О., Вургес, Дж., Канела, С., Гаутель, М., и Вильманнс, М. (2001). Структурные доказательства возможной роли образования обратимого дисульфидного мостика в эластичности мышечного белка тайтина. Строение 9, 331–340.DOI: 10.1016 / S0969-2126 (01) 00591-3
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Миллевой С., Тромбитас К., Колмерер Б., Костин С., Шапер Дж., Пелин К. и др. (1998). Характеристика туманности и небулина и новые концепции их роли для Z-дисков позвоночных. J. Mol. Биол . 282, 111–123. DOI: 10.1006 / jmbi.1998.1999
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Миямото, С., Дель Ре, Д. П., Сян, С. Ю., Чжао, X., Флорхольмен, Г., и Браун, Дж. Х. (2010). Пересмотренный и исправленный: всегда ли RhoA злодей в сердечной патофизиологии? J. Cardiovasc.Transl. Res . 3, 330–343. DOI: 10.1007 / s12265-010-9192-8
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Mrosek, M., Labeit, D., Witt, S., Heerklots, H., Von Castelmur, E., Labeit, S., et al. (2007). Молекулярные детерминанты рекрутирования убиквитин-лигазы MuRF-1 на тайтин M-линии. FASEB J . 7, 1383–1392. DOI: 10.1096 / fj.06-7644com
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Муес, А., Ван дер Вен, П. Ф., Янг, П., Ферст, Д. О., и Готель, М. (1998). Два иммуноглобулиноподобных домена Z-дисковой части тайтина взаимодействуют конформационно-зависимым образом с телетонином. FEBS Lett . 428, 111–114. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (98) 00501-8
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Мюллер, С., Ланге, С., Гаутель, М., и Вильманнс, М. (2007). Жесткая конформация тандемного повтора иммуноглобулинового домена в А-полосе эластичного мышечного белка тайтина. J. Mol. Биол . 371, 469–480. DOI: 10.1016 / j.jmb.2007.05.055
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Надь А., Грама Л., Хубер Т., Бьянко П., Тромбитас К., Гранзье Х. Л. и др. (2005). Иерархическая растяжимость в области PEVK скелетно-мышечного тайтина. Biophys. J .89, 329–336. DOI: 10.1529 / biophysj.104.057737
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Нейв Р., Ферст Д. О. и Вебер К. (1990). Взаимодействие альфа-актинина и небулина in vitro. Подтверждение существования системы четвертых нитей в скелетных мышцах. FEBS Lett . 269, 163–166. DOI: 10.1016 / 0014-5793 (90) 81144-D
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Никастро, Г., Марджокко, П., Кардинали, Б., Stagnaro, P., Cauglia, F., Cuniberti, C., et al. (2004). Роль неструктурированных расширений во вращательных диффузионных свойствах глобулярного белка: пример модуля тайтин i27. Biophys. J . 87, 1227–1240. DOI: 10.1529 / biophysj.104.040931
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ohlsson, M., Hedberg, C., Bradvik, B., Lindberg, C., Tajsharghi, H., Danielsson, O., et al. (2012). Наследственная миопатия с ранней дыхательной недостаточностью, связанной с мутацией тайтина А-диапазона. Мозг 135, 1682–1694. DOI: 10.1093 / brain / aws103
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Паппас К. Т., Бхаттачарья Н., Купер Дж. А. и Грегорио К. К. (2008). Небулин взаимодействует с CapZ и регулирует архитектуру тонких волокон Z-диска. Mol. Биол. Cell 19, 1837–1847. DOI: 10.1091 / mbc.E07-07-0690
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пэн, Дж., Раддац, К., Лабейт, С., Гранзье, Х., Готтхардт, М. (2005). Атрофия мышц у мышей с дефицитом тайтина M-линии. J. Muscle Res. Сотовый Motil . 26, 381–388. DOI: 10.1007 / s10974-005-9020-y
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Перниго С., Фукудзава А., Берц М., Холт М., Риф М., Штайнер Р. А. и др. (2010). Структурное понимание сборки и механики M-полосы из комплекса тайтин-обскурин-подобный-1. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 107, 2908–2913.DOI: 10.1073 / pnas.06107
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Перц-Эдвардс, Р. Дж., И Риди, М. К. (2011). Электронная микроскопия и дифракция рентгеновских лучей свидетельствуют о двух структурных состояниях Z-полосы. Biophys. J . 101, 709–717. DOI: 10.1016 / j.bpj.2011.06.024
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пфеффер Г., Эллиотт Х. Р., Гриффин Х., Баррези Р., Миллер Дж., Марш Дж. И др. (2012). Мутация титина отличается от наследственной миопатии с ранней дыхательной недостаточностью. Мозг 135, 1695–1713. DOI: 10.1093 / brain / aws102
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пфуль, М., Гаутель, М., Политу, А.С., Джозеф, К., и Пастор, А. (1995). Определение вторичной структуры с помощью ЯМР-спектроскопии иммуноглобулин-подобного домена гигантского мышечного белка тайтина. J. Biomol. ЯМР 6, 48–58. DOI: 10.1007 / BF00417491
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пфуль, М., Импрота, С., Политоу, А.С., и Пасторе, А. (1997). Когда модуль также является доменом: роль N-конца в стабильности и динамике иммуноглобулиновых доменов из тайтина. J. Mol. Биол . 265, 242–256. DOI: 10.1006 / jmbi.1996.0725
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пфул М. и Пасторе А. (1995). Третичная структура иммуноглобулиноподобного домена из гигантского мышечного белка тайтина: новый член набора I. Структура 3, 391–401.DOI: 10.1016 / S0969-2126 (01) 00170-8
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пфуль М., Виндер С. Дж., Кастильоне Морелли М. А., Лабейт С. и Пасторе А. (1996). Корреляция между конформационными и связывающими свойствами повторов небулина. J. Mol. Биол . 257, 367–384. DOI: 10.1006 / jmbi.1996.0169
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пиноцис, Н., Петухов, М., Ланге, С., Свергун, Д., Цзоу, П., Gautel, M., et al. (2006). Доказательства димерной сборки двух комплексов тайтин / телетонин, индуцированной С-концом телетонина. J. Struct. Биол . 155, 239–250. DOI: 10.1016 / j.jsb.2006.03.028
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Политу А.С., Миллевой С., Гаутель М., Колмерер Б. и Пасторе А. (1998). Sh4 в мышцах: растворная структура домена Sh4 из небулина. J. Mol. Биол . 276, 189–202. DOI: 10.1006 / jmbi.1997.1521
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Политу А.С., Спадаччини Р., Джозеф К., Браннетти Б., Геррини Р., Хелмер-Читтерих М. и др. (2002). Домен Sh4 небулина избирательно связывается с пептидами типа II: теоретическое предсказание и экспериментальная проверка. J. Mol. Биол . 316, 305–315. DOI: 10.1006 / jmbi.2001.5312
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Политоу, А.С., Томас, Д.Дж. И Пасторе А. (1995). Сворачивание и стабильность тайтин-подобных иммуноглобулиноподобных модулей с последствиями для механизма эластичности. Biophys. J . 69, 2601–2610. DOI: 10.1016 / S0006-3495 (95) 80131-1
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пухнер, Э. М., Александрович, А., Хо, А. Л., Хенсен, У., Шафер, Л. В., Брандмайер, Б. и др. (2008). Механоферментные препараты тайтинкиназы. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 105, 13385–13390.DOI: 10.1073 / pnas.0805034105
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Кадота, Х., МакГаха, Л. А., Мерсер, К. Б., Старк, Т. Дж., Феррара, Т. М., и Бениан, Г. М. (2008). Новая протеинфосфатаза является партнером связывания для доменов протеинкиназы UNC-89 (Obscurin) у Caenorhabditis elegans. Mol. Биол. Ячейка 19, 2424–2432. DOI: 10.1091 / mbc.E08-01-0053
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Раекер, М.О., Рассел М. В. (2011). Истощение обскурина нарушает организацию скелетных мышц у развивающихся эмбрионов рыбок данио. J. Biomed. Биотехнология . 2011: 479135. DOI: 10.1155 / 2011/479135
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Raeker, M.O., Su, F., Geisler, S. B., Borisov, A. B., Kontrogianni-Konstantopoulos, A., Lyons, S.E., et al. (2006). Обскурин необходим для бокового выравнивания поперечно-полосатых миофибрилл у рыбок данио. Dev. Dyn .235, 2018–2029. DOI: 10.1002 / dvdy.20812
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Рандаццо, Д., Джакомелло, Э., Лоренцини, С., Росси, Д., Пьерантоцци, Э., Блаау, Б. и др. (2013). Обскурин необходим для локализации анкиринB-зависимого дистрофина и целостности сарколеммы. J. Cell Biol . 200, 523–536. DOI: 10.1083 / jcb.201205118
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Раскин А., Ланге С., Банарес К., Lyon, R.C., Zieseniss, A., Lee, L.K. и др. (2012). Новый механизм, включающий четыре с половиной домена LIM-белка-1 и регулируемую внеклеточными сигналами киназу-2, регулирует фосфорилирование и механику тайтина. J. Biol. Chem . 287, 29273–29284. DOI: 10.1074 / jbc.M112.372839
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Риф М., Гаутель М. и Гауб Х. Э. (2000). Силы разворачивания доменов тайтина и фибронектина измеряются непосредственно с помощью АСМ. Adv.Exp. Med. Биол . 481, 129–136. обсуждение: 137–141. DOI: 10.1007 / 978-1-4615-4267-4_8
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Риф М., Гаутель М., Шеммель А. и Гауб Х. Э. (1998). Механическая стабильность доменов иммуноглобулина и фибронектина III в мышечном белке тайтине, измеренная с помощью атомно-силовой микроскопии. Biophys. J . 75, 3008–3014. DOI: 10.1016 / S0006-3495 (98) 77741-0
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Зауэр, Ф., Вахокоски, Дж., Сонг, Ю. Х., и Уилманнс, М. (2010). Молекулярная основа сборки «голова к хвосту» гигантских мышечных белков обскурин-подобного 1 и тайтина. EMBO Rep . 11, 534–540. DOI: 10.1038 / embor.2010.65
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Шейх Ф., Раскин А., Чу П. Х., Ланге С., Доменигетти А. А., Чжэн М. и др. (2008). Комплекс, содержащий FHL1, в саркомере кардиомиоцитов опосредует гипертрофические реакции на биомеханический стресс у мышей. J. Clin. Инвестируйте . 118, 3870–3880. DOI: 10.1172 / JCI34472
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Соримачи, Х., Кинбара, К., Кимура, С., Такахаши, М., Ишиура, С., Сасагава, Н., и др. (1995). Мышечно-специфический кальпаин, p94, ответственный за мышечную дистрофию пояса конечностей типа 2A, связан с коннектином через IS2, p94-специфическую последовательность. J. Biol. Chem . 270, 31158–31162. DOI: 10.1074 / jbc.270.52.31158
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Stacklies, W., Вега, М. К., Вильманнс, М., и Тертер, Ф. (2009). Механическая сеть в иммуноглобулине тайтина из анализа распределения сил. PLoS Comput. Биол . 5: e1000306. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1000306
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Стюард А., Чен К., Чепмен Р. И., Борджиа М. Б., Роджерс Дж. М., Войтала А. и др. (2012). Два тандемных белка иммуноглобулина со связывающей бета-цепью обнаруживают неожиданные различия в кооперативности и путях сворачивания. J. Mol. Биол . 416, 137–147. DOI: 10.1016 / j.jmb.2011.12.012
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Судзуки Т., Ядзима Х., Маруяма К. и Кимура С. (2000). 3′-концевая кДНК-последовательность в 7,5 т.п.н. небулина скелетных мышц курицы выявляет его связывающие актин области. Zoolog. Sci . 17, 1095–1099. DOI: 10.2108 / zsj.17.1095
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Теммерман, К., Саймон, Б., и Уилманнс, М. (2013). Структурное и функциональное разнообразие активности и регуляции DAPK-родственных протеинкиназ. FEBS J . 21, 5533–5550. DOI: 10.1111 / febs.12384
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Цховребова Л., Уокер М. Л., Гроссманн Дж. Г., Хан Г. Н., Барон А. и Триник Дж. (2010). Форма и гибкость супер-повтора из 11 доменов тайтина. J. Mol. Биол . 397, 1092–1105. DOI: 10.1016 / j.jmb.2010.01.073
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Вазина А. А., Ланина Н. Ф., Алексеев Д. Г., Брас В., Долбня И. П. (2006). Структурные принципы мультидоменной организации гигантской полипептидной цепи мышечного белка тайтина: исследования SAXS / WAXS при растяжении ориентированных волокон тайтина. J. Struct. Биол . 155, 251–262. DOI: 10.1016 / j.jsb.2006.03.025
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Фон Кастельмур, Э., Марино М., Свергун Д. И., Креплак Л., Укурум-Фотиадис З., Конарев П. В. и др. (2008). Регулярный паттерн супермотивов Ig определяет сегментарную гибкость как эластичный механизм цепи тайтина. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 105, 1186–1191. DOI: 10.1073 / pnas.0707163105
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Wang, K., Knipfer, M., Huang, Q.Q., Van Heerden, A., Hsu, L.C., Gutierrez, G., et al. (1996). Последовательность небулина скелетных мышц человека кодирует схему архитектуры тонких волокон.Мотивы последовательностей и профили аффинности тандемных повторов и терминального Sh4. J. Biol. Chem . 271, 4304–4314. DOI: 10.1074 / jbc.271.8.4304
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ван С. М., Дженг С. Дж. И Сун М. С. (1992). Исследования взаимодействия тайтина и миозина. Histol. Гистопатол . 7, 333–337.
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст
Warner, A., Xiong, G., Qadota, H., Rogalski, T., Vogl, A.W., Moerman, D.G. и др. (2013). CPNA-1, белок копинового домена, расположен в сайтах адгезии интегрина и необходим для стабильности миофиламентов у Caenorhabditis elegans. Mol. Биол. Ячейка 24, 601–616. DOI: 10.1091 / mbc.E12-06-0478
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ватанабе, К., Мюле-Голл, К., Келлермайер, М.С., Лабейт, С., и Гранзье, Х. (2002). Различная молекулярная механика проявляется конститутивно и дифференциально экспрессируемыми тандемными сегментами Ig тайтина. J. Struct. Биол . 137, 248–258. DOI: 10.1006 / jsbi.2002.4458
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Вайнерт, С., Бергманн, Н., Луо, X., Эрдманн, Б., и Готтхардт, М. (2006). Тайтин с дефицитом M-линии вызывает сердечную летальность из-за нарушения созревания саркомера. J. Cell Biol . 173, 559–570. DOI: 10.1083 / jcb.200601014
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Витт, К. К., Буркарт, К., Labeit, D., McNabb, M., Wu, Y., Granzier, H., et al. (2006). Небулин регулирует длину тонких волокон, сократительную способность и структуру Z-диска in vivo. EMBO J . 25, 3843–3855. DOI: 10.1038 / sj.emboj.7601242
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Witt, C.C., Olivieri, N., Centner, T., Kolmerer, B., Millevoi, S., Morell, J., et al. (1998). Исследование первичной структуры и межвидовой консервации эластических элементов тайтина I-диапазона позвоночных. J. Struct. Биол . 122, 206–215. DOI: 10.1006 / jsbi.1998.3993
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Сюн, Г., Кадота, Х., Мерсер, К. Б., МакГаха, Л. А., Оберхаузер, А. Ф., и Бениан, Г. М. (2009). Комплекс LIM-9 (FHL) / SCPL-1 (SCP) взаимодействует с С-концевыми участками протеинкиназы UNC-89 (обскурин) в мышцах Caenorhabditis elegans. J. Mol. Биол . 386, 976–988. DOI: 10.1016 / j.jmb.2009.01.016
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ягава, К., Ямано, К., Огуро, Т., Маэда, М., Сато, Т., Момосе, Т. и др. (2010). Структурная основа для стабильности белков, зависимых от пути разворачивания: векторное разворачивание по сравнению с глобальным разворачиванием. Protein Sci . 19, 693–702. DOI: 10.1002 / pro.346
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ямасаки Р., Берри М., Ву Ю., Тромбитас К., Макнабб М., Келлермайер М. С. и др. (2001). Взаимодействие титина с актином в миокарде мышей: модуляция пассивного напряжения и его регуляция кальцием / S100A1. Biophys. J . 81, 2297–2313. DOI: 10.1016 / S0006-3495 (01) 75876-6
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Янг П., Элер Э. и Готель М. (2001). Обскурин, гигантский саркомерный белок фактора обмена нуклеотидов ро-гуанина, участвующий в сборке саркомера. J. Cell Biol . 154, 123–136. DOI: 10.1083 / jcb.200102110
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Цзоу П., Пиноцис Н., Ланге С., Сонг, Ю.Х., Попов, А., Мавридис, И. и др. (2006). Палиндромная сборка гигантского мышечного белка тайтина в Z-диске саркомера. Nature 439, 229–233. DOI: 10.1038 / nature04343
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Фантастические мышечные белки и где их найти — ScienceDaily
Исследователи из Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка Ассоциации Гельмгольца (MDC) разработали модель мыши, которая позволяет им заглянуть внутрь работающей мышцы и идентифицировать белки, которые позволяют саркомер сокращается, расслабляется, сообщает о своих энергетических потребностях и адаптируется к упражнениям.В частности, они смогли составить карту белков в определенных субрегионах саркомера, начиная с «Z-диска», границы между соседними саркомерами. Это само по себе было значительным шагом вперед в изучении поперечно-полосатой мышцы.
В процессе они сделали неожиданное открытие: миозин, один из трех основных белков, составляющих поперечно-полосатые мышечные волокна, по-видимому, проникает в Z-диск. Модели того, как миозин, актин и эластичный каркасный белок titin работают вместе, в значительной степени игнорируют возможность того, что миозиновые филаменты проникают в структуру Z-диска.Только недавно немецкие ученые предположили, что это так, но до сих пор не было экспериментальных данных, подтверждающих эту модель.
«Это будет неожиданностью даже для исследователей миозина», — говорит профессор Майкл Готтхардт, возглавляющий лабораторию нейромышечной и сердечно-клеточной биологии MDC и руководивший исследованием. «Это касается самых основ того, как мышцы генерируют силу».
Кто там?
Команда Готтхардта, в которую входят первые авторы доктора Франциска Рудольф и докторКлаудия Финк с помощью коллег из MDC и Геттингенского университета никогда не пыталась подтвердить эту теорию. Их основная цель состояла в том, чтобы идентифицировать белки в Z-диске и рядом с ним. Для этого они разработали модель мыши с искусственным ферментом под названием BioID, вставленным в гигантский белок тайтин. Затем Titin-BioID пометил белки рядом с Z-диском.
Саркомеры — это крошечные молекулярные машины, наполненные плотно взаимодействующими белками. До сих пор было невозможно разделить белки, специфичные для разных субрегионов, особенно в живых, функционирующих мышцах.«Titin-BioID исследует определенные области структуры саркомера in vivo», — говорит доктор Филипп Мертинс, возглавляющий лабораторию протеомики MDC. «Это было невозможно раньше».
Команда впервые применила BioID у живых животных в физиологических условиях и определила 450 белков, связанных с саркомером, примерно половина из которых уже была известна. Они обнаружили разительные различия между сердцем и скелетными мышцами, взрослыми и неонатальными мышами, которые связаны со структурой саркомера, передачей сигналов и метаболизмом.Эти различия отражают потребность тканей взрослого человека в оптимизации производительности и выработки энергии по сравнению с ростом и ремоделированием ткани новорожденного.
«Мы хотели знать, кто там, кто игроки», — говорит Готтхардт. «Большинство было ожидаемым, подтверждая наш подход».
Сюрприз
Белок, который они не ожидали увидеть в Z-диске, был миозином, который интегрирован в противоположном участке саркомера. Когда мышца начинает двигаться, миозин движется вдоль актина, сближая соседние Z-диски.Это скольжение актиновых и миозиновых нитей создает силу, которая позволяет нашему сердцу перекачивать кровь или нашим скелетным мышцам, чтобы поддерживать осанку или поднимать объект.
Эта так называемая «скользящая филаментная модель» саркомера описывает производство силы и помогает объяснить, как соотносятся сила и длина саркомера. Однако современные модели не могут предсказать поведение полностью сжатых саркомеров. Эти модели предположили, что миозин не проникает в Z-диск при движении вдоль актина. Были некоторые намеки на то, что, возможно, так и будет.«Но мы не знали, было ли то, что мы видели в образцах окрашенных тканей, артефактом или реальной жизнью», — говорит Готтхардт. «С помощью BioID мы можем сидеть за Z-диском и смотреть, как проходит миозин».
Готтхардт соглашается с предложенной теорией, согласно которой миозин, попадающий в Z-диск, может ограничивать или ослаблять сокращение. Это может помочь решить текущую проблему, с которой ученые рассчитали, сколько силы может создать мышечное волокно по отношению к его длине, и приведет к усовершенствованной модели саркомера и, возможно, послужит для защиты мышц от чрезмерного сокращения.
Почему это важно
Понимание того, как мышечные волокна расширяются и сокращаются на молекулярном уровне в нормальных условиях, важно, чтобы исследователи могли затем определить, что происходит не так, когда мышцы повреждены, больны или атрофируются с возрастом. Определение того, какие белки вызывают проблемы, потенциально может помочь в определении новых целей лечения пациентов с сердечными заболеваниями или заболеваниями скелетных мышц.
Готтхардт и его команда планируют в следующий раз использовать BioID для изучения животных с различными патологиями, например, чтобы увидеть, какие белки участвуют в атрофии мышц.«Возможно, белок, которого обычно нет, попадает в саркомер, и это часть патологии», — говорит Готтхардт. «Мы можем найти это с помощью BioID».
Молекулярный параллелизм в быстро сокращающихся мышечных белках у эхолокационных млекопитающих
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для систематического поиска параллельной молекулярной эволюции мы применили вычислительный метод, который идентифицирует параллельные аминокислотные замены, происходящие в парах независимых клонов (рис. S1A). Во-первых, мы вычислили множественное выравнивание белков с помощью филогенетического метода розыгрыша ( 12 ).Во-вторых, мы сделали вывод о наиболее вероятной последовательности предкового белка в каждом внутреннем узле филогенетического дерева, используя как метод максимального правдоподобия, так и байесовский подход. В-третьих, рассматривая каждое положение белка и все возможные пары ветвей, мы извлекли те пары, в которых произошли одна или несколько параллельных аминокислотных замен (рис. 1A и рис. S1, B-E). Результатом является список пар родословных, которые разделяют по крайней мере одну параллельную замену.
Рис. 1 Экран параллельной молекулярной эволюции у млекопитающих.
( A ) Иллюстрация параллельных аминокислотных замен, определяемых как одна и та же аминокислотная замена из идентичного предкового состояния. Предполагаемые предковые аминокислоты выделены серым шрифтом. Красные ветви имеют параллельную замену от E (Glu) на K (Lys) в этом положении выравнивания. ( B ) Функциональное обогащение 409 (416) белков, где с максимальной вероятностью (байесовская) наследственная реконструкция предполагает параллельные замены между микробой (маленькая коричневая летучая мышь) и дельфином-афалиной с использованием GeneTrail2 (https: // genetrail2.bioinf.uni-sb.de/). Онтологические термины, относящиеся к компонентам мышечных волокон, выделены красным шрифтом. Для клеточного компонента показаны только 10 лучших обогащений (65 значительных обогащений). Связанные с мышцами и другие термины обогащения, не связанные с мышцами, для биологического процесса ГО и молекулярной функции показаны в таблице S2. ( C ) Гистограммы, показывающие количество радикальных параллельных аминокислотных замен в консервативных положениях быстро сокращающихся по сравнению с медленно сокращающимися сигнальными и саркомерными белками Ca 2+ для всех 1296 независимых пар ветвей.Реконструкция предковой последовательности с максимальной вероятностью (слева) и байесовский подход (справа) последовательно показывают, что микробат и дельфин имеют семь параллельных замен исключительно в белках быстро сокращающихся волокон (вставка) и что ни одна другая пара ветвлений не имеет избытка семи или более замен в наборе быстро сокращающихся волокон. Для систематической реализации этого подхода важно иметь высококачественные наборы однозначных ортологичных генов, которые также исключают любые похожие паралоги. Поэтому мы использовали Ensembl Compara ( 13 ), который предоставил данные ортологов для 30 различных плацентарных млекопитающих, включая 10 приматов, бурозубку, 5 гляров, 11 лауразиатерий и 3 афротериев (рис.S2). Всего после удаления плохо выровненных областей и ложных последовательностей было получено 14 406 наборов ортологов. Мы обнаружили, что подавляющее большинство (~ 90%) обнаруженных параллельных замен происходит в позициях выравнивания, которые плохо консервативны в эволюции или являются консервативными заменами (аналогичные физико-химические свойства аминокислот) (таблица S1). В отличие от консервативных замен, радикальные замены, которые изменяют физико-химические свойства аминокислот, такие как заряд, полярность или ароматичность, происходят с более низкой скоростью эволюции, потому что эти замены с большей вероятностью влияют на функцию белка и, таким образом, подвергаются более сильному очищающему отбору.Стремясь обнаружить параллельные замены, которые могут повлиять на функцию, мы решили сосредоточиться на белках, по крайней мере, с одной параллельной заменой, которая происходит в консервативном положении выравнивания и приводит к радикальной замене аминокислоты (рис. S1, B на E). набор данных содержал двух эхолоцирующих млекопитающих, микробат Myotis lucifugus (маленькая коричневая летучая мышь) и афалин ( Tursiops truncatus ), мы проверили, обнаружил ли наш экран известные параллельные замены.С этой целью мы экстрагировали все белки, содержащие радикальные параллельные замены в консервативных положениях между микробой и дельфином. С максимальной вероятностью и байесовской наследственной реконструкцией это дало наборы из 409 и 416 белков соответственно. Для 392 белков (> 94% от 409/416) оба подхода последовательно выявляли параллельные замены. Эти 392 белка включали связанные со слухом белки Prestin, Dfnb59 и Slitrk6 (рис. S3A), которые были идентифицированы в предыдущих исследованиях генов-кандидатов ( 4 , 8 — 10 ).Наш скрининг также обнаружил ранее неизвестные параллельные замены в трех дополнительных белках, связанных со слухом: стереоцилине (Strc), текторине α (Tecta) и кальций-связывающем белке 2 (Cabp2) (рис. S3B). Функция Strc заключается в соединении стереоцилий друг с другом, а также с текториальной мембраной ( 14 ), которая содержит Tecta в качестве основного компонента ( 15 ). Cabp2 играет роль в регуляции активности потенциал-управляемых кальциевых каналов, которые открываются в ответ на отклонение стереоцилий ( 16 ).Таким образом, наш скрининг обнаружил дополнительные белки, связанные со слухом, которые могут способствовать конвергентным адаптациям для высокочастотного слуха у эхолокационных млекопитающих. Чтобы изучить функции остальных белков, не связанных со слухом, с параллельными заменами между микробами и афалинами, мы провели поиск для функционального обогащения этими наборами белков 409/416. Неожиданно мы обнаружили, что белки с параллельными заменами между микробами и дельфинами, наряду с другими терминами онтологии генов (GO), обогащены терминами, относящимися к компонентам сократительного аппарата мышечных волокон и передачи сигналов кальция (рис.1B и таблица S2). Мы исследовали белки в различных условиях GO для передачи сигналов мышц и кальция и обнаружили, что, хотя большинство из них также выполняют функциональные роли вне мышечных волокон или являются частью сердечных мышц, следующие четыре белка играют определенную роль в волокнах скелетных мышц ( 17 , 18 ): кальсеквестрин 1 (Casq1), аденозинтрифосфатаза (АТФаза), саркоплазматический / эндоплазматический ретикулум, транспортирующий кальций 1 (Atp2a1, синоним Serca1), тяжелая цепь 2 миозина (Myh3) и легкая цепь миозина (1) (Myl1) Рис.2 и 3). Casq1 адсорбирует большие количества ионов Ca 2+ и служит в качестве запасного белка для ионов Ca 2+ в саркоплазматическом ретикулуме (SR) ( 19 — 21 ). Atp2a1 закачивает Ca 2+ в SR для достижения мышечной релаксации ( 22 ). И Myh3, и Myl1 являются компонентами генерирующего силу молекулярного моторного комплекса ( 17 , 23 ). В этих четырех белках мы наблюдали в общей сложности семь радикальных параллельных замен в консервативных положениях между микробами и дельфинами.
Рис. 2 Параллельная молекулярная эволюция белков быстро сокращающихся мышечных волокон у эхолокационных млекопитающих.
Помимо видов, включенных в полногеномный скрининг (отмечены звездочкой), выравнивания содержат 46 дополнительных млекопитающих, что показывает, что параллельные аминокислотные замены также происходят у других эхолокационных млекопитающих, которые издают звуки с высокой частотой повторения (большая коричневая летучая мышь , другие Myotis видов, косатки и байджи), но не только в них. Последовательности дополнительных млекопитающих были извлечены из недавнего выравнивания множественных геномов ( 46 ).Серый прямоугольник, отсутствует последовательность.
Рис. 3 Упрощенная диаграмма, показывающая цикл сокращения-релаксации скелетных мышц и трехмерные структуры белков с параллельными заменами.
Ca 2+ , связанный с Casq1, высвобождается из SR через рецепторы рианодина в саркоплазму, чтобы инициировать цикл поперечного мостика, во время которого комплексы миозина генерируют механическую работу. Для релаксации Ca 2+ активно перекачивается обратно в SR с помощью Atp2a1, где большинство ионов Ca 2+ снова связываются с полимеризованным Casq1.Трехмерные белковые структуры Casq1 (банк данных белков: 3TRP; остатки, которые связывают Ca 2+ с высоким сродством, показаны голубым), Atp2a1 (4NAB) и Myh3 (2MYS; Q863E находится в области связывания легкой цепи миозина, но не являются частью этой структуры). Параллельные замены отмечены красным. Помечены остатки, участвующие в димеризации Casq1 и связывании Ca 2+ ( 21 ) и остаток Atp2a1 K400, который связывает ингибитор фосфоламбан ( 47 ). Указан ретрансляционный домен Myh3, который определяет скорость скольжения актина ( 39 ) путем передачи конформационных изменений между конвертерным доменом, сайтом связывания нуклеотидов и сайтом связывания актина ( 38 , 48 ).K49Q не является частью какой-либо доступной структуры Myl1. Известно, что все четыре белка (Casq1, Atp2a1, Myh3 и Myl1) преимущественно экспрессируются в быстро сокращающихся волокнах скелетных мышц, тогда как соответствующие паралоги этих белков обычно экспрессируются на более высоких уровнях в медленно сокращающиеся или сердечные мышечные волокна. Таким образом, мы исследовали, являются ли эти параллельные замены специфичными для белков быстро сокращающихся мышц или же у микробов и дельфинов также обнаруживаются параллельные замены в сигнальных белках Ca 2+ или в саркомерных белках, которые преимущественно экспрессируются в волокнах медленно сокращающихся мышц.С этой целью мы использовали доступные данные по экспрессии генов мыши ( 17 , 18 ) и получили 20 белков (Atp2a1, Calm3, Casq1, Mybph, Myh2, Myh23, Myh3, Myh8, Myl1, Myl7, Myom2, Myoz1, Pak1. , Pdlim3, Ppp3ca, Pvalb, Tmod1, Tnnc2, Tnnt3 и Vcl) с более высокими уровнями экспрессии в быстро сокращающихся мышечных волокнах и 23 белка (Acta1, Actn2, Atp2a2, Casq2, Cryab, Hspb1, Itgb1bp2, Itpr1, Murc, Myh4, Myh6, Myh7, Myl2, Myl3, Myot, Myoz2, Smpx, Smtnl1, Tnnc1, Tnni1, Tnnt1, Tnnt2 и Tpm2) с более высокими уровнями экспрессии в медленно сокращающихся мышечных волокнах.В отличие от белков быстро сокращающихся мышц, которые включали вышеупомянутые 4 белка, мы не обнаружили ни одной параллельной замены между микробами и дельфинами ни в одном из этих 23 белков медленно сокращающихся волокон (рис. 1C). Затем мы использовали наш скрининг, который обнаружил параллельные замены между любой парой клонов, чтобы проверить, есть ли у других млекопитающих также семь или более параллельных замен в 20 белках быстро сокращающихся волокон. Среди всех остальных 1295 пар независимых ветвей мы наблюдали максимум четыре параллельных замены (таблица S3), показывая, что семь параллельных замен между микробат и дельфином являются отклоняющимся наблюдением (рис.1С). Более того, в то время как микробат и дельфин не имеют параллельных замен в 23 медленно сокращающихся белках, другие пары клонов имеют до 12 таких замен в этом наборе. Это показывает, что количество параллельных замен, которые происходят специфически в белках быстросокращающихся волокон у эхолокаторов, является самым высоким по сравнению с другими парами клонов. Затем мы определили, может ли преобразование генов с GC-смещением (процесс, который смещает G / C по аллелям A / T во время репарации рекомбинации) может быть потенциальным объяснением наблюдаемого избытка параллельной замены между дельфинами и микробами в белках быстро сокращающихся волокон. .Мы обнаружили, что только одна из семи замен (K49Q в Myl1) потенциально может быть объяснена GC-смещенной конверсией гена (таблица S4). Таким образом, мы наблюдали, что (i) эхолокационный микробат и дельфин имеют больше параллельных замен в белках быстро сокращающихся волокон, чем все другие клоны, (ii) оба вида не имеют параллельных замен в белках медленно сокращающихся волокон и (iii) GC Смещенная конверсия генов не является основным фактором, объясняющим наличие этих параллельных замен в белках быстро сокращающихся волокон.Хотя параллельные замены часто происходят случайно ( 24 , 25 ), эти наблюдения предполагают, что семь параллельных замен в быстро сокращающихся мышечных белках эхолокаторов в целом могли возникнуть не только случайно. , чрезвычайно быстрые эхолокационные звонки во время терминального гудения приводятся в действие уникальными, производящими звук «сверхбыстрыми» мышцами, которые состоят из специализированных быстро сокращающихся волокон, скорость сокращения которых аналогична скорости звонка во время терминального гудения (~ 200 раз в секунду ) ( 26 , 27 ).Так же, как летучие мыши, зубастые киты, такие как афалин, морская свинья и ложный косатка, используют терминальное жужжание в последние моменты перед захватом добычи и могут динамически управлять частотой кликов эхолокации в зависимости от расстояния до своей добычи ( 7 , 28 ). Это сходство поведения предполагает, что у этих зубатых китов также могут существовать сверхбыстрые мышцы, производящие звук. Таким образом, мы предположили, что эти белки могут участвовать в функциональных изменениях, которые превращают быстрые мышечные волокна в сверхбыстрые волокна и, таким образом, потенциально способствуют конвергентному вокализационному аспекту эхолокации.Поскольку наши ортологичные наборы генов включали только 30 плацентарных млекопитающих, включая 2 эхолокатора, мы вручную проанализировали 46 дополнительных млекопитающих, чтобы определить, происходят ли параллельные замены в этих белках также у родственных эхолокационных летучих мышей и зубатых китов. Мы обнаружили, что большинство параллельных аминокислотных изменений также наблюдается у других эхолокационных млекопитающих (большая коричневая летучая мышь, дополнительные виды Myotis , косатки и байджи), хотя и не только у них (рис. 2). Дальнейшее ручное исследование шести вышеупомянутых белков, связанных со слухом (Prestin, Dfnb59, Slitrk6, Strc, Tecta и Cabp2), также показывает, что ни одна из параллельных замен не происходит конкретно у этих эхолокационных млекопитающих, за исключением Strc h420Q, который мы сканируем. непокрытый (рис.S3). Примечательно, что замены N7T и P26L, которые, как было экспериментально показано, влияют на функцию Prestin, также встречаются у неэхолокационных землероек и кошатников / малых полосатиков, соответственно (рис. S3A). Этот паттерн предполагает, что наблюдение производной замены у фоновых видов не обязательно исключает функциональное влияние на белок и что чистые паттерны конвергенции редко существуют, когда глубина таксономической выборки увеличивается ( 29 ). Кроме того, в различных примерах, таких как Prestin, RNAse1 и Na + / K + -ATPase, наблюдается функциональная конвергенция наряду с наличием множества сайтов, отображающих параллельные замены ( 11 , 30 , 31 ).Затем мы исследовали, экспрессируются ли четыре белка быстросокращающихся волокон (Casq1, Atp2a1, Myh3 и Myl1) в специфических, производящих звук сверхбыстрых мышцах. Хотя наши попытки извлечь РНК из носовых мышц морской свиньи (близкого родственника дельфина) не увенчались успехом из-за плохой сохранности РНК в имеющихся образцах, нам удалось извлечь высококачественную РНК из передней перстневидно-щитовидной мышцы гортани ( n = 3) летучей мыши-эхолокации Pteronotus parnellii .Используя секвенирование РНК (RNA-seq), мы обнаружили, что все четыре белка экспрессируются в этой сверхбыстрой мышце, производящей звук (рис. 4) ( 26 ). Более того, используя грудную мышцу в качестве контроля ( n = 3), мы обнаружили, что передняя перстневидная мышца имеет существенно более высокий коэффициент экспрессии четырех белков по сравнению с их паралогами медленных волокон (рис. 4). Далее мы сравнили экспрессию трех быстро сокращающихся тяжелых цепей миозина волокон ( Myh2 / 2 / 4 ), кодируемые белки которых различаются по скорости укорочения волокон, которая уменьшается в следующем порядке: Myh5> Myh2> Myh3 ( 23 ).Мы обнаружили, что Myh5 составляет 90% экспрессии тяжелой цепи миозина в передней перстневидно-щитовидной мышце, что соответствует потребности в быстром сокращении. Напротив, Myh5 имеет самую низкую экспрессию в грудной мышце, где порядок экспрессии Myh5 > Myh3 > Myh2 , наблюдаемый в передней перстневидно-щитовидной мышце, обратный. Myh3 является второй по распространенности тяжелой цепью миозина (9%) в передней перстневидной мышце, несмотря на то, что белок Myh3 имеет более низкую скорость укорочения, чем Myh2.Таким образом, сверхбыстрая передняя перстневидная мышца содержит более высокую долю компонентов быстро сокращающихся волокон и экспрессирует все четыре белка с параллельными заменами.
Рис. 4 Сравнение экспрессии генов четырех белков быстро сокращающихся мышечных волокон по сравнению с их паралогами медленных сокращений.
Уровень экспрессии генов кальсеквестрина ( A ), Ca 2+ АТФазы ( B ), тяжелой цепи миозина ( C ) и легкой цепи миозина ( D ) в сравнении быстро сокращающихся генов (красный шрифт ) и медленно сокращающиеся (черный шрифт) компоненты мышечных волокон в трех биологических повторностях P.parnellii передняя перстневидная мышца (желтая) и грудная мышца (синяя). Горизонтальная линия — это медиана. Гены с параллельными заменами отмечены звездочкой. Коэффициенты экспрессии и значения P двустороннего теста t показаны внизу и в таблице S6. n.s., не имеет значения.
Если белки, демонстрирующие параллельные замены, вносят свой вклад в функцию сверхбыстрых волокон, то можно ожидать, что функция белков слилась между микробами и дельфинами таким образом, который помогает достичь чрезвычайно быстрой кинетики сверхбыстрых мышц.Ограничивающим скорость этапом является мышечная релаксация, которая включает транспорт Ca 2+ из саркоплазмы в SR ( 27 , 32 ), где он адсорбируется на Casq1. Адсорбция Ca 2+ зависит от способности Casq1 образовывать димеры и тетрамеры зависимым от Ca 2+ образом, в результате чего полимеры адсорбируют большие количества Ca 2+ на отрицательно заряженной поверхности и между ними. интерфейсы ( 20 , 33 ). Поскольку сверхбыстрые циклы сокращения / релаксации слишком короткие, чтобы перекачивать весь высвободившийся Ca 2+ обратно в SR, концентрация Ca 2+ в SR уменьшается, несмотря на то, что в саркоплазму выделяется меньше Ca 2+ . последующие циклы ( 34 ).Следовательно, зависимая от Ca 2+ полимеризация Casq1 у микробов и дельфинов могла измениться, чтобы работать при более низких концентрациях в SR многократно стимулированных сверхбыстрых мышц. Чтобы изучить, могут ли параллельные замены в Casq1 потенциально влиять на Ca 2+ -зависимой полимеризации, мы исследовали их положение в трехмерной (3D) структуре (рис. 3). Мы обнаружили, что замена E35Q расположена на N-конце, который участвует в обмене плеч для стабилизации образования димера ( 33 , 35 ).Замена L163F изменяет гидрофобность границы раздела димеров, вероятно влияя на гидрофобные взаимодействия, индуцированные кальцием. Третья замена (A115T) расположена рядом с одним из высокоаффинных связывающих остатков Ca 2+ (D114, рис. 3), который взаимодействует с тетрамерным партнером. Это говорит о том, что все три радикальных замены могут влиять на Ca 2+ -зависимую полимеризацию, которая является критической для функции хранения высокой емкости Ca 2+ Casq1.Чтобы экспериментально исследовать, эволюционировала ли полимеризация Casq1 у микробов и дельфинов, чтобы работать при более низких концентрациях Ca 2+ , мы сначала провели анализы мутности, чтобы сравнить зависимую от концентрации полимеризацию Casq1 Ca 2+ между эхолокацией (дельфины и микробиоты) и не- эхолокационные млекопитающие (мышь, мегабат , Pteropus vampyrus , лошадь и свинья) (рис. 5А). Как для Casq1 микробиолета, так и для дельфина, мутность раствора начала значительно увеличиваться при концентрации Ca 2+ между 1.5 и 2,0 мМ, соответственно, и плато составляет ~ 3 мМ Ca 2+ . Это отличается от Casq1 из неэхолоцирующих видов, где для значительного увеличения мутности требуются существенно более высокие концентрации Ca 2+ . Во-вторых, для прямого мониторинга зависимой от Ca 2+ димеризации при низких концентрациях Ca 2+ мы использовали эксперимент по многоугольному светорассеянию, который подтвердил, что Casq1 у микробов и дельфинов димеризуется при более низких концентрациях Ca 2+ по сравнению с Casq1 мыши. (Инжир.5Б). Таким образом, эти результаты демонстрируют, что Casq1 микрокрылых летучих мышей и дельфинов способны образовывать полимеры при более низких концентрациях Ca 2+ , чем Casq1 у неэхолоцирующих млекопитающих, что может способствовать адсорбции Ca 2+ при уменьшении концентраций в SR во время сверхбыстрого сокращения. циклы релаксации.
Рис. 5 Casq1 у микробов и дельфинов функционально сходятся в способности образовывать полимеры, связывающие Ca 2+ , при более низких концентрациях Ca 2+ .
( A ) Ca 2+ -зависимая мутность показывает, что Casq1 микробов и дельфинов олигомеризуется при более низких концентрациях Ca 2+ .Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех измерений. ( B ) Эксперименты по многоугловому рассеянию света показывают, что Casq1 у микробов и дельфинов димеризуется при более низких концентрациях Ca 2+ по сравнению с Casq1 мыши. В то время как Casq1 всех трех видов является мономерным при концентрации Ca 2+ 0 мМ, как у микробов, так и у дельфинов Casq1 димеризуется при концентрации 1 мМ, в отличие от мышиного Casq1, который остается мономерным. Обсуждение. П.parnellii , который обеспечивает жужжание терминала у летучих мышей. Сверхбыстрые мышцы состоят из специализированных волокон, способных сокращаться и расслабляться на порядок выше, чем у самых быстрых локомоторных мышц ( 32 ). Чтобы достичь этой чрезвычайно высокой скорости, сверхбыстрые мышцы развили ряд ключевых адаптаций, которые значительно ускоряют расслабление мышц, что является ограничивающим их шагом. Эти адаптации включают в себя (i) быстрые переходные процессы Ca 2+ и (ii) более высокую скорость укорочения волокна из-за миозиновых двигателей с высокой скоростью отслоения поперечного мостика ( 32 , 36 , 37 ), что предполагает эволюцию возиться с различными компонентами сигнального и молекулярного моторного механизма Ca 2+ .Таким образом, белки, обнаруженные нашим геномным скринингом, могут быть потенциально вовлечены в эволюцию сверхбыстрых мышц, внося свой вклад как в быстрые переходные процессы Ca 2+ , так и в высокие скорости укорочения. Быстрые переходные процессы Ca 2+ требуют быстрого снижения Ca 2 + концентрация в саркоплазме, которая достигается за счет большого количества Atp2a1 и парвальбумина (Pvalb), белка, который временно связывает Ca 2+ в саркоплазме до тех пор, пока он не будет перекачиваться обратно в SR с помощью Atp2a1 ( 32 ).Как и ожидалось, мы наблюдали высокий уровень экспрессии Atp2a1 и Pvalb в передней перстневидно-щитовидной мышце летучей мыши (фиг. 4 и таблица S5). Кроме того, наши эксперименты показывают, что и микробат, и дельфин Casq1 способны образовывать полимеры при более низких концентрациях Ca 2+ , чем мышиный Casq1. Эта функциональная конвергенция предполагает, что микробат и дельфин Casq1 могут адсорбировать Ca 2+ в условиях более низких концентраций Ca 2+ в SR. Эти условия, вероятно, присутствуют в сверхбыстрых мышцах, где циклы сокращения / расслабления слишком короткие, чтобы полностью восстановить базальную концентрацию Ca 2+ в SR.Следовательно, способность Casq1 адсорбировать Ca 2+ при более низких концентрациях может увеличивать емкость накопления SR во время сверхбыстрых циклов сокращения / расслабления и, таким образом, способствовать быстрым переходным процессам кальция, необходимым для сверхбыстрой физиологии мышц. высокая скорость укорачивания волокон за счет миозиновых моторов с высокой скоростью отслоения поперечных мостиков также является отличительной чертой сверхбыстрых мышц ( 32 , 37 ). Скорость укорочения волокна определяется доменом реле миозина ( 38 , 39 ).Среди параллельных замен в Myh3 замена T512E расположена в релейном домене (Fig. 3) и появляется как многообещающий кандидат для увеличения скорости скольжения актина по двум причинам. Во-первых, мы обнаружили, что изоформа миозина, присутствующая в мышцах непрямого полета Drosophila , обнаруживает замену, аналогичную T512E (Fig. 6). Эти мышцы асинхронного полета способны сокращаться ~ 200 раз в секунду; однако каждое сокращение контролируется механизмом, активируемым растяжением, а не циклом высвобождения / секвестрации Ca 2+ .Изоформа миозина, которая экспрессируется исключительно в летательных мышцах, имеет чрезвычайно быструю скорость отслоения поперечных мостиков ( 37 ) и, как показано на рис. 6, демонстрирует отрицательно заряженный остаток (Asp) в положении, соответствующем Myh3 512. В В отличие от полярного Thr (T), отрицательно заряженный остаток [Glu (E) в Myh3 или Asp в Drosophila Myh] позволяет образовывать солевой мостик с положительно заряженным Arg в конвертерном домене, и это взаимодействие конкретно происходит во время конформации после силового гребка, предшествующей отслойке поперечного моста ( 38 ).Во-вторых, миозин Myh5 млекопитающих, который обеспечивает самую высокую скорость укорачивания мышечных волокон ( 23 ), также обнаруживает отрицательно заряженный остаток (E) в позиции 512 (рис. S4). Следовательно, наличие отрицательно заряженного остатка в самых быстрых миозинах как у Drosophila , так и у млекопитающих подтверждает гипотезу о том, что T512E участвует в увеличении скорости скольжения актина у микробов и дельфинов Myh3.
Рис. 6 Как микробат / дельфин Myh3, так и самый быстрый миозин Drosophila обнаруживают отрицательно заряженный остаток в положении 512.
Показаны аминокислотная последовательность экзона 15 Myh3 млекопитающего и гомологичные альтернативные экзоны 9a / 9b / 9c Drosophila Myh. В отличие от млекопитающих, Drosophila имеет только один ген Myh, но разные мышцы продуцируют функционально разные изоформы посредством альтернативного сплайсинга. Мышца непрямого полета Drosophila экспрессирует изоформу Myh с чрезвычайно высокой скоростью отделения поперечного мостика, которая включает исключительно экзон 9a (синий шрифт). В отличие от экзонов 9b (A, Ala) и 9c (T, Thr), экзон 9a демонстрирует отрицательно заряженный остаток (D, Asp, красная стрелка), который напоминает параллельную замену T512E (Thr to Glu, черная стрелка) в микробат / дельфин Myh3 (синий шрифт).Отрицательно заряженный остаток (Asp или Glu) в этом положении, вероятно, модулирует скорость скольжения актина, динамически образуя солевой мостик с положительно заряженным Arg 759 в конвертерном домене во время конформации пост-силового удара, который предшествует отслоению поперечного мостика ( 39 ). Обратите внимание, что миозин Myh5 млекопитающих, который обеспечивает наивысшую скорость укорачивания мышечных волокон, также имеет отрицательно заряженный остаток (Glu) в положении 512 (рис. S4). Кроме того, мы наблюдали, что аминокислоты, производные от дополнительных параллельных замен в Myh3, также являются найденные в соответствующих позициях Myh5 (рис.S4). Таким образом, похоже, что Myh3 у микрокрылых летучих мышей и дельфинов приблизился к большему сходству с Myh5. Если эта конвергенция последовательностей связана с функциональной конвергенцией, то более высокая экспрессия Myh3 по сравнению с Myh2 в звукоизлучающей мышце P. parnellii приведет к образованию почти исключительно мышечных волокон (99%, рис. ) миозиновых двигателей с очень высокой скоростью скольжения актина. Более высокий уровень экспрессии Myh3 по сравнению с Myh2 в перстневидной мышце в сочетании с более высокой устойчивостью к утомлению Myh3 по сравнению с Myh2 и особенно Myh5 (из-за физиологического компромисса между скоростью миозина и сопротивлением усталости) потенциально может объяснить почему параллельные изменения произошли в Myh3 вместо Myh2.Таким образом, учитывая, что более высокое сопротивление усталости характеризует волокна мышц гортани ( 17 ), остается проверить, увеличивают ли параллельные изменения в Myh3 скорость при сохранении аспекта сопротивления усталости этого миозинового двигателя.
Примечательно, что мы обнаружили, что у зубатых китов есть большая делеция размером ~ 50 т.п.н., которая покрывает ген Myh5 . Эта делеция имеет одинаковые точки останова у зубатых и усатых китов, что убедительно свидетельствует о том, что эта делеция уже произошла у предка китообразных (рис.S5). Мы смогли подтвердить делецию Myh5 путем анализа считывания секвенирования этих видов (рис. S6). Это наблюдение повышает вероятность того, что конвергенция последовательностей в дельфине Myh3 компенсирует наследственную потерю Myh5 , гена, кодирующего самую быструю тяжелую цепь мышечного миозина.
Таким образом, наше исследование подчеркивает полезность сравнительных геномных подходов для создания новых гипотез о геномной основе, лежащей в основе сложных фенотипов, в данном случае геномных изменений, которые способствуют сверхбыстрой физиологии мышц, которая остается в значительной степени неизвестной.Параллельные аминокислотные изменения между эхолоцирующими млекопитающими в нескольких белках, которые экспрессируются в быстро сокращающихся волокнах гортани летучей мыши, могут вносить вклад в функциональные изменения, необходимые для создания исключительной скорости. Хотя полная морфология производства звука у зубатых китов еще не полностью изучена, молекулярные параллелизмы намекают на аналогичную роль этих белков в мышцах или тканях, которые контролируют производство звука у этих водных млекопитающих. Тем не менее, необходимы дополнительные эксперименты, как in vitro, так и in vivo, чтобы полностью определить, могут ли параллельные аминокислоты влиять на функциональные изменения и, следовательно, как эти изменения могут играть роль в построении сверхбыстрых мышц.
Методы экстракции мышечных белков из мяса и рыбы с использованием денатурирующих и неденатурирующих растворов
Целью настоящего исследования было испытание двух методов экстракции, включая растворы с различной ионной силой, для экстракции и разделения миофибриллярных белков из мяса и рыбы. мышцы разных видов. Образцы мяса из longissimus thoracis, мышцы говядины и баранины, большой грудной мышцы, мышцы курицы и спинной белой мышцы рыбы, взятой из подошвы ( Solea solea ), европейского хека ( Merluccius merluccius ) и морского окуня ( Dicentrarchus labrax ).Метод экстракции с использованием неденатурирующего раствора привел к значительной экстракции высокомолекулярных белков, таких как тяжелая цепь миозина, α, -актинин и десмин; Напротив, денатурирующий метод обеспечил хорошую экстрагируемость белков из белков и фрагментов с низким молекулярным весом, таких как актин, тропонин-Т, тропомиозин и белки легкой цепи 1 и 2 миозина для большинства образцов мяса и рыбы. Неденатурирующий метод экстракции показал несколько преимуществ, что привело к экономии времени и труда, а также к минимизации использования токсичных и загрязняющих веществ.
1. Введение
Мышечные белки сгруппированы в три категории в зависимости от расположения в скелетных мышцах и растворимости: саркоплазматические, стромальные и миофибриллярные белки. Миофибриллярные белки являются основным компонентом скелетных мышц, на их долю приходится около 50% всех белков и в основном они состоят из миозина и актина, участвующих в сокращении мышц. Из-за своей структуры и локализации [1] миофибриллярные белки требуют денатурирующих условий, например, раствора с высокой ионной силой для солюбилизации и экстракции [2].Саркоплазматические белки, локализованные в саркоплазме мышечных волокон, считаются растворимыми в воде или растворах с низкой ионной силой, тогда как стромальные белки, такие как коллаген и эластин, как сообщается, остаются нерастворимыми в растворах с высоким содержанием соли [3] .
Методы протеомики широко применялись для разделения, характеристики и идентификации белков в пищевых продуктах животного происхождения [4, 5]. Подготовка проб и экстракция — важнейшие этапы электрофоретического анализа для получения надежных результатов [6].Выбор метода экстракции мышечных белков важен для получения образцов с высокой концентрацией белка, не содержащих соли и других мешающих факторов, таких как липиды, которые могут помешать электрофоретическому анализу. Наиболее часто используемые процедуры экстракции миофибриллярных белков включают денатурирующие растворы, содержащие мочевину, тиомочевину, восстановители (DTT, бета-меркаптоэтанол), детергенты (SDS, додецилсульфат натрия) и соли [7, 8]. Однако следует учитывать, что использование этих реагентов считается токсичным и сильно загрязняющим и требует надлежащих процедур утилизации.Chen et al. [9] сообщили об использовании воды или сред с низкой ионной силой для экстракции и солюбилизации миофибриллярных белков из скелетных мышц. Насколько нам известно, исследований по сравнению экстракционной способности денатурирующих и неденатурирующих растворов не проводилось. В свете этого соображения цель настоящего исследования состояла в том, чтобы провести сравнение двух методов экстракции и разделения миофибриллярных белков, включая растворы с различной ионной силой в мышцах мяса и рыбы.
2. Материалы и методы
2.1. Химические вещества и реагенты
Все реагенты, использованные в эксперименте, были аналитической чистоты. Хлорид калия, динатрийфосфат, монокалиевый фосфат, мочевина, тиомочевина, дитиотреитол, холамидопропилдиметилгидроксипропансульфонат (CHAPS), IGEPAL® CA-630 NP 40, глицерин и трис были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). . Акриламид, бис-акриламид, персульфат аммония (APS), N, N, N, N-тетраметилэтилендиамин (TEMED), додецилсульфат натрия (SDS), трис (гидроксиметил) -аминометан, глицин, бромфеноловый синий, β -меркаптоэтанол, и кумасси бриллиантовый синий G-250 были приобретены в Bio-Rad Laboratories (Геркулес, Калифорния).
Фосфатный буфер (pH 7, 0,003 М), фосфатный буфер KCl (pH 7,5) и трис-HCl (pH 8, 20 мМ) были свежеприготовлены. Сверхчистую воду получали в лаборатории с использованием системы очистки воды Barnstead ™ Pacific TII (ThermoFisher Scientific, США).
2.2. Сбор и подготовка образцов
Образцы мяса longissimus thoracis мышцы говядины и баранины; большая грудная мышца мышца курицы; и белые мышцы спины рыбы из камбалы ( Solea solea ), европейского хека ( Merluccius merluccius ) и морского окуня ( Dicentrarchus labrax ) были куплены на местном рынке и немедленно переданы в холодильную лабораторию.Для каждого вида в эксперимент было включено пятнадцать животных. Жировая и соединительная ткани были удалены из образцов мяса, а кости, чешуя и жир — из образцов рыбы. Все свежие образцы были мелко измельчены перед экстракцией белка.
2.3. Способы экстракции белка
Блок-схема экстракции фракций мышечного белка из различных проанализированных видов показана на рисунке 1. Мясные и рыбные белки фракционировали на основе различной растворимости.Образцы гомогенизировали 0,03 М фосфатным буфером (pH 7), содержащим коктейль ингибиторов протеаз (P2714, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), на льду в течение 2 минут с использованием основного раствора Ultra-Turrax T18 (IKA, Уилмингтон, Германия). Гомогенат центрифугировали при 8000 × (Eppendorf 5810R, Eppendorf AG, Гамбург, Германия) в течение 20 мин при 4 ° C. После центрифугирования супернатант (саркоплазматические белки) отбрасывали, и экстракцию миофибриллярных белков проводили следующим образом.
Были проведены два различных метода экстракции миофибриллярных белков с использованием денатурирующих и неденатурирующих растворов.Экстракция миофибриллярных белков неденатурирующим раствором основана на методе, описанном Hashimoto et al. [10] со следующими изменениями: выделенный осадок ресуспендировали в 10 объемах фосфатного буфера KCl pH 7,5 (0,45 M KCl, 15,6 мМ Na 2 HPO 4 , 3,5 мМ KH 2 PO 4 ) и встряхивали в течение 2 мин. Стадия встряхивания была введена для оптимизации гомогенизации гранул и предотвращения образования мягкого комплекса.Смесь дважды центрифугировали при 5000 × (Eppendorf 5810R, Eppendorf AG, Германия) в течение 15 мин при 4 ° C. После центрифугирования супернатант, содержащий миофибриллярные белки, собирали, разделяли на аликвоты и замораживали при -80 ° C.
Для сравнения, миофибриллярные белки экстрагировали с использованием денатурирующего раствора согласно Marino et al. [11]. Вкратце, осадок ресуспендировали в растворе (8,3 M мочевина, 2 M тиомочевина, 64 мМ дитиотреитол (DTT), CHAPS 2% (3 — ((3-холамидопропил) диметиламмонио) -1-пропансульфонат), IGEPAL 2%, глицерин 10% и 20 мМ трис-HCl, pH 8) и инкубировали в течение ночи при 4 ° C в орбитальном шейкере.Затем образцы центрифугировали при 15000 × (Eppendorf 5810R, Eppendorf AG, Германия) в течение 20 минут при 10 ° C. После центрифугирования супернатант, содержащий миофибриллярные белки, собирали, разделяли на аликвоты и замораживали при -80 ° C до дальнейшего анализа белков, чтобы избежать активации протеазы кальпаина.
Для каждого вида все миофибриллярные экстракты, полученные разными методами, были количественно определены с помощью анализа белка Брэдфорда (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Поглощение измеряли при 580 нм с помощью спектрофотометрического анализа (Power Wave XS, Biotek, UK) со стандартной кривой бычьего сывороточного альбумина (BSA; чистота> 98%, Sigma-Aldrich).
2.4. Анализ SDS-PAGE
Пятнадцать миофибриллярных экстрактов каждого вида, полученных денатурирующим или неденатурирующим методом, объединяли и разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле в градиенте геля 8-18% [11]. В гели загружали 50 мкл г белков и прогоняли с помощью гелевого устройства с вертикальной пластиной Protean II xi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Кумасси бриллиантовый синий G-250 использовался для визуализации интересующих полос. Гели обесцвечивали в водном растворе уксусной кислоты и метанола (10% об. / Об. И 7% об. / Об. Соответственно) и получали с помощью системы ChemiDoc EQ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).Относительное количество каждой полосы определяли как процент от интенсивности сигнала определенной полосы на дорожке с помощью программного обеспечения Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Определение молекулярной массы белка проводили путем сравнения с точностью плюс стандарт белка в широком диапазоне (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
2,5. Статистический анализ
Концентрацию белка и электрофоретические данные анализировали с использованием процедуры GLM статистического программного обеспечения SAS [12].Проверенным эффектом были методы экстракции миофибриллярной фракции мышечных белков из говядины, баранины, курицы, камбалы, хека и морского окуня. Когда были обнаружены значимые различия (at), для определения значимых различий между средними значениями использовали критерий Стьюдента t- .
3. Результаты и обсуждение
3.1. Экстрагируемость белка
Растворимость является показателем экстрагируемости белка; действительно, солюбилизированный белок можно легко экстрагировать в раствор из мышечных волокон или миофибрилл [9].Количество миофибриллярных белков, экстрагированных с использованием денатурирующих и неденатурирующих растворов из говядины, баранины, курицы, камбалы, европейского хека и морского окуня, показано на рисунке 2. Не было обнаружено различий в экстрагируемости белков говядины, европейского хека и морского окуня, когда различные методы экстракции были протестированы, что свидетельствует о том, что неденатурирующий метод экстракции привел к успешной экстракции белка как денатурирующий метод экстракции. Физическая сила, приложенная при повторном центрифугировании, повреждает структуры миофибриллярных белков, частично позволяя миофибриллярным белкам растворяться в воде.
Напротив, экстракционная способность денатурирующего раствора оказалась более эффективной у ягненка, курицы и подошвы с количеством миофибриллярных белков, экстрагированных примерно на 30% у ягненка и примерно на 10% у курицы и подошвы выше. чем неденатурирующий раствор. Известно, что экстракция белка из скелетных мышц — сложное явление, на которое влияют параметры экстракции, структура ткани и посмертные изменения , которые происходят во время трансформации мышцы [13].Большая экстрагируемость миофибриллярных белков денатурирующим раствором в образцах ягненка, курицы и подошв может быть обусловлена типом и структурой мышц [14], предполагая, что сила солюбилизации может быть видоспецифичной.
3.2. Миофибриллярная фракция
Денситометрический профиль и SDS-PAGE миофибриллярной фракции, экстрагированной денатурирующими и неденатурирующими растворами из мяса и рыбы, показаны на фигурах 3 и 4 соответственно. Оба метода экстракции обеспечивали адекватное разделение миофибриллярных белков и производных фрагментов, о чем свидетельствует электрофоретический профиль с четко определенными полосами и отсутствие каких-либо примесей (например,г., липиды). В образцах мяса основными белками, идентифицированными в диапазоне молекулярных масс от 250 до 10 кДа, были тяжелая цепь миозина (MHC), α -актинин ( α -акт), десмин, актин (ACT), тропонин T (TnT), тропомиозин (TPM), легкие цепи миозина 1 (MLC1), тропонин C (TnC) и легкие цепи миозина 2 (MLC2). Напротив, электрофоретический профиль образцов рыб показал отсутствие тропонинового комплекса. Однако все проанализированные виды показали белковые фрагменты с молекулярной массой в диапазоне от 180 до 110 кДа, от 95 до 55 кДа, от 51 до 47 кДа, от 40 до 38 кДа, от 33 до 23 кДа, от 21 до 18 кДа и от 14 до 10 кДа и полосы при 39 и 16 кДа.
Денситометрический профиль SDS-PAGE показал, что использование денатурирующего раствора привело к более сложному профилю с точки зрения количества извлеченных полос и фрагментов (30, 32 и 32 против 26, 27 и 28 полосы в неденатурирующем профиле образцов мяса и полосы 35, 29 и 30 против 31, 26 и 28 полос в неденатурирующем профиле образцов рыбы), в то время как использование неденатурирующего раствора выявило большую интенсивность для большей части проанализированных миофибриллярных белков.
Процент основных миофибриллярных белков, экстрагированных с использованием неденатурирующих и денатурирующих растворов из мясных и рыбных видов, представлен на рисунках 5 и 6, соответственно. Все образцы, экстрагированные неденатурирующим раствором, показали самые высокие значения MHC (у говядины, баранины, курицы, камбалы и хека; у морского окуня), α -актинина (в баранине; в говядине, курице и камбале; в Европейский хек) и десмин (в говядине; в морском окуне; в баранине, у европейского хека не обнаружено).
Известно, что миозин в основном способствует прочности на разрыв мышцы, тогда как α -актинин и десмин являются белками цитоскелета, ответственными за поддержание структурной и механической целостности актиновых филаментов в Z-диске [ 15]. В любом случае, независимо от того, является ли уменьшенное относительное количество всех этих белков результатом протеолиза, денатурации или их комбинации, десмин также считается маркером свежести у некоторых видов рыб [16].В настоящем исследовании использование раствора с низкой ионной силой в неденатурирующем методе экстракции привело к значительной экстракции этих белков с высокой молекулярной массой.
Значение pH раствора при использовании солерастворимого метода оказалось благоприятным для экстракции белка. Соответственно, Chen et al. [2] сообщили о большей солюбилизации миозина при использовании 0,6 М раствора KCl pH 6,0 из-за диссоциации миозиновых филаментов, вызванной низкой ионной силой буферного раствора. Уменьшение содержания соли в неденатурирующем растворе могло привести к модификации физиологических условий белка из-за изменения pH, улучшающего растворимость белков с высокой молекулярной массой.
Использование денатурирующих растворов привело к значительной экстрагируемости миофибриллярных белков с низкой молекулярной массой (менее 45 кДа), таких как актин (у ягненка, европейского хека и морского окуня), тропонин Т (у говядины, баранины и курицы, европейского хека). белок . Не было обнаружено значительных различий между двумя методами экстракции в MLC1 проб рыб.
Эти результаты могут быть связаны с такими соединениями, как мочевина, тиомочевина, CHAPS и DTT денатурирующего раствора. Известно, что мочевина — хаотропный агент, эффективный при разрыве водородных связей, денатурирующих белки за счет разрыва нековалентных и ионных связей между аминокислотными остатками [17]. Тиомочевина действительно нарушает гидрофобные взаимодействия, приводящие к увеличению солюбилизации мембранных белков [18]. Предыдущие исследования [19, 20] показали, что комбинация мочевины и тиомочевины демонстрирует превосходную солюбилизирующую способность и резко увеличивает экстракцию белков.Кроме того, CHAPS и DTT влияют на солюбилизацию белков, потому что они предотвращают гидрофобное взаимодействие и способствуют повторному окислению дисульфидных связей, избегая недостатка белков за счет агрегации или осаждения [21]. Присутствие денатурирующих соединений в экстракционном растворе привело к увеличению экстракции миофибриллярных белков с низкой молекулярной массой, вероятно, из-за различий в размере молекул белков, конформации, а также меж- и внутримолекулярных связях, что привело к большей чувствительности к силе экстракции метод денатурации.
4. Заключение
Неденатурирующие и денатурирующие методы экстракции были эффективными для солюбилизации основных мышечных белков. Протеомный анализ показал хорошее разделение белков с четко определенными полосами без какого-либо загрязнения для всех проанализированных образцов. Метод экстракции с использованием неденатурирующего раствора приводит к значительной экстракции миофибриллярных белков с высокой молекулярной массой; Напротив, денатурирующий метод обеспечивает хорошую экстрагируемость белков и фрагментов с низкой молекулярной массой для большинства образцов мяса и рыбы.
Неденатурирующий метод экстракции показал несколько преимуществ, таких как простота выполнения, менее инвазивность и минимальное использование токсичных и загрязняющих веществ.
Доступность данных
Данные, использованные для подтверждения выводов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.
Конфликты интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации этой статьи.