Выработка коллагена: Как увеличить выработку коллагена в организме? Советы и рекомендации.

Перезвоните мне

Почему коллаген так необходим?

Коллаген – это нитевидный белок, один из основных компонентов соединительной ткани. Вырабатывается специальными клетками – фибробластами и является наиболее распространённым протеином: его доля в организме составляет ¼ всех белков.

Название происходит от слова kolla, что в переводе с греческого означает «клей» и gen – «создавать». Это полностью соответствует функциям данного белка: он скрепляет клетки при помощи фибрилл (белых тонких волокон) и удерживает эту связь.  

В природе существует более 16 разновидностей коллагена, а для организма человека особую ценность представляет I, II и III тип:

I-й сконцентрирован практически во всех соединительных тканях, в том числе, в костях, сухожилиях, связках, зубах, роговице глаз. Волокна I типа наиболее прочные и эластичные и составляют 90% всего имеющегося в организме коллагена.

II-й находится в позвоночных дисках, стекловидном теле глаза, гиалиновых хрящах.

III-й содержится в матке, стенках артериальных сосудов, в коже, хрусталике.

Что касается кожи, то коллагеново-эластиновый каркас делает её гладкой, упругой, эластичной, увлажненной.

Записаться

Признаки нехватки коллагена

Содержание коллагена в значительной степени начинает снижаться только с возрастом. Самым ярким признаком является появление гравитационного птоза, а также морщин, складок, пигментных пятен. Однако помимо этого на дефицит белка указывают и другие приметы:

— боль в суставах;

— хрупкость костей;

— проблема с межпозвоночными дисками;

— выпадение зубов;

— глаукома; 

— длительное заживление ран;

— кровотечение из дёсен и носовой полости;

— гиповитаминоз аскорбиновой кислоты.

Где найти коллаген для кожи?

Выработка коллагена происходит благодаря участию витаминов, аминокислот, микроэлементов. К ним относятся:

— витамин С;

— витамин К;

— витамин РР;

— витамин В6;

— омега-3;

— железо;

— цинк;

— медь.

Чтобы данные микроэлементы находились в вашем организме в норме, включайте в рацион:

— овощи;

— фрукты;

— оливковое масло;

— орехи;

— яйца;

— грибы;

— говядина и телятина;

— сельдь, тунец и креветки;

— курицу, индейку, мясо кролика.

Также для стимулирования синтеза коллагена необходимы следующие шаги:

1. Отшелушивание кожи мягким пилингом.

Скрабирующие частички удалят с поверхности кожи мертвые клетки, тем самым катализируя выработку нового коллагена и эластина, а также подготовят кожу для дальнейшего ухода.

2. Биодобавки (только после сдачи анализов и консультации с врачом).

Годами ранее большой популярностью в регенеративной медицине пользовался коллаген животного происхождения, но из-за побочных эффектов от него пришлось отказаться. Поэтому сейчас врачи предпочитают использовать морской коллаген. Он добывается из костей, чешуи и кожи рыб, обладает низкой антигенностью и высокой биосовместимостью.

3. Инъекции.

К коллагеностимулирующим процедурам можно отнести:

— Биоревитализацию;

— Мезотерапию;

— SMAS-лифтинг;

— Альтера-терапию;

— Нитевой лифтинг. Методика создаёт новый коллагено-эластиновый каркас, который выравнивает и подтягивает проблемные участки на долгое время.

Конечно, восполнять уровень коллагена нужно комплексно, тогда организм отблагодарит вас за проделанную работу прекрасным внешним видом и самочувствием.

Записаться

Как восстановить объемы коллагена и восполнить дермальный матрикс: инъекции коллагена, фототермолиз, аминокислотно-заместительная терапия

Этот белок, состоящий из свернутых в спираль трех полипептидных цепей, формирует решетчатую структуру внеклеточного матрикса. В соединительной ткани преобладает коллаген I и III типов, а в базальной мембране — коллаген IV и V типов.

Показано, что фибробласты синтезируют молекулы тропоколлагена и выбрасывают их в матрикс, и только здесь происходит сборка коллагеновых волокон.

Фибробласты также вырабатывают другие структурные протеины кожи, такие как эластин и гликозаминогликаны (ГАГ). Чтобы передать сигнал или начать выработку структурных протеинов кожи, фибробластные клетки имеют рецепторы специальной формы на внешних мембранах, которые выступают в качестве связующих участков, в которые могут вписываться сигнальные молекулы соответствующей формы. Когда рецепторы связываются при помощи правильного сочетания сигнальных молекул (которое называется факторами роста фибробластов), фибробласт начинает выработку коллагена и структурных протеинов дермы. Ферментом, способным растворить коллагеновую нить за счет частичного гидролиза является коллагеназа.

Предназначение коллагеназы состоит в том, чтобы «расшивать коллагеновые нити, способствуя процессу их обновления, так как коллагеназа совместно с протеолитическими ферментами деструктирует коллагеновую молекулу до низкомолекулярных пептидов, которые вновь в качестве исходного материала возвращаются в фибробласты, в которых и происходит синтез новых предшественников коллагена.

Принято считать, что с возрастом деструктивные процессы распада коллагена в коже начинают преобладать над синтетическими, откуда логически следует, что стимуляция его синтеза является самым верным путем к восстановлению упругости кожи.

Тем не менее, исследования, проведенные в последние годы, показали, что в стареющей коже выработка коллагена нередко сохраняется на достаточно высоком уровне, а общее количество коллагена далеко не всегда снижается, а порой, напротив, повышается. Чем же тогда объяснить снижение упругости кожи, потери тонуса, эластичности, появлению динамических мимических и статических морщин? Оказывается, количество коллагена – это еще не все. Значительно большую роль играет его качество. А вот оно-то с возрастом неизбежно понижается. Отчасти это происходит из-за того, что коллаген повреждается внешними факторами, такими как УФ-излучение и свободные радикалы. Но существуют еще и внутренние причины снижения качества коллагена. Одна из них – нарушение процесса сборки коллагена, в результате чего происходит накопление дефектных волокон, не обладающих нужной упругостью.

Таким образом перед косметологом встает две задачи превентивная-максимально предотвратить и отсрочить структурные изменения коллагена. И терапевтическая- восстановления утраченных объемов коллагена и восполнение дермального матрикса.

На настоящий момент к превентивным процедурам относятся:

• Аппликационное нанесение коллагена( коллагеновые сыворотки, маски, крема с большим содержанием гидролизатов этого белка).




• Физиотерапевтические воздействия, направленные на поддержания нативной структуры коллагена, свойственного молодой коже (световая энергия, микротокковое воздействие, радиочастотная энергия).




• Назначение микронизированных форм коллагена в виде пищевых добавок, белковых коктейлей.

К процедурам, направленных на неоколлагеногенез и восстановление утраченных объемов коллагена можно отнести:

Как для косметолога, так и для пациента очень важно определиться с выбором метода на каждом жизненном этапе старения и выработать тактику стимуляции выработки коллагена и поддержания качества его структурных волокон. Разберем подробнее некоторые из методов достижения цели.

Наружное использование коллагена

Коллаген и его гидролизаты часто входят в рецептуры разнообразных кремов и сывороток как влагоудерживающие и питательные компоненты. Эффективность таких косметических средств объясняется тем, что гигроскопическая коллагеновая пленка действует наподобие влажного компресса. А значит, снижается трансэпидермальная потеря воды кожей. Благодаря гигроскопическим свойствам коллагена повышается влажность рогового слоя кожи.

Будучи термолабильным белком, коллаген, соприкасаясь с кожей, под действием температуры тела и высокого содержания влаги может подвергаться частичному протеолизу, образуя водорастворимые низкомолекулярные составляющие, которые с помощью энхансеров, присутствующих в креме, способны проникнуть через роговой слой и включиться в метаболические реакции, стимулируя обменные процессы в дерме.

Широкополосный импульсный свет

Фотоомоложение – современный популярный метод широко использующийся наряду с инъекциями коллагена. Производители аппаратов порой в качестве опции указывают выработку коллагена. Но с этим трудно полностью согласиться.

Широкополосный импульсный свет (IPL) проникает в кожу и, селективно, не повреждая эпидермиса, поглощается сосудами, меланином пигментных образований или коллагеном.

Технология омоложения основывается на воздействии импульсного света на коллаген, вызывает его нагревание. За счет эндогенного тепла происходит ретракция коллагена, увеличить количество коллагена процедура фотоомоложения не может, но происходит улучшение его текстуры, эффект омоложения происходит за счет выравнивая рельефа кожи, улучшения его текстуры. Одним из хромофоров некогерентного импульсного света является меланин, поэтому за счет осветления и деструкции поверхностных телеангиэктазий мы можем говорить об эффекте омоложения, но говорить об истинном омоложении и неоколлагеногенезе в данном случае не приходится.

Коллагенарий и коллагеновые лампы

Под эгидой фотоомоложения появляются новые изобретения такие как коллагенарии и коллагеновые лампы. Эти аппараты обещают выработку коллагена не только в области лица, шеи и декольте. Но и всего тела. Это делает коллагеновые лампы привлекательными в глазах пациента. 15 минут расслабленного отдыха и вот он вожделенный новый коллаген. Но к сожалению все не так просто.  

Производители и поставщики коллагенариев уверяют, существует 2 вида коллагеновых ламп — синего и красного света.

• Лампы синего света имеют диапазон 415 нм.

Синий свет оказывает на организм противомикробное действие, улучшает состояние иммунной систем., В отличие от других диапазонов синий свет более интенсивно поглощается многими фоторецепторами кожи, порфиринами, которые выделяют при этом кислород, убивающий бактерии (после 3-х дневного облучения дозой 320 Дж/кв.см. их содержание уменьшается на 99%).

В действительности, в дерматологической практике используется сине-фиолетовый спектр видимого света, для борьбы с бактериями Propionibacterium acne, являющейся одним из основных патогенов при обыкновенных угрях.

• Лампы красного света диапазоном 633 нм.

Лампы красного света призваны улучшить текстуру и рельеф кожи за счет выработки коллагена. Идея довольно проста: красный свет с длиной волны 633 нм. Проникает на глубину 8-10 миллиметров и достигает подкожно-жировой клетчатки, красный свет в клетках кожи преобразуется в энергию фотосинтеза, который стимулирует продуцирование коллагена и эластина.

Итак два основных момента на которые стоит обратить внимание, первое в коже должно быть достаточно строительного материала (в виде аминокислот) и второе для омоложения структуры коллагена под действием красного света нужно время — более десяти недель.

Целью этой статьи не является попытка развенчать миф о возможном синтезе коллагена и восполнение каркаса дермального матрикса при помощи различных физических агентов.

Красный и синий свет исторически и очень успешно зарекомендовали себя в физиотерапии и косметологии, но к назначению этих процедур врачи и специалисты всегда подходили с пониманием для чего используется этот принцип терапии, тщательно собирая анамнез, выясняя противопоказания, индивидуально подбирая время экспозиции и орган или участок тела или лица, который будет подвергаться воздействию.

На сегодняшний день ситуация складывается таким образом, что любой желающий может «подарить себе счастье нового коллагена» всего за 20 минут в неделю, достаточно просто заплатить за абонемент в салон красоты.

Если рекламные лозунги оказались заманчивыми — обязательно надо помнить, что перед посещением коллагенария необходимо проконсультироваться с доктором и прислушаться к его рекомендациям о кратности и времени процедуры, обязательно защищать глаза и зону молочной железы и помнить о абсолютных противопоказаниях к данной процедуре.

Инъекции коллагена

Коллаген I типа, полученный из кожи крупного рогатого скота, по своему составу и структуре максимально приближен к человеческому коллагену, очищен от аллергенов и прионов, обладает выраженной биологической активностью. Чаще всего для инъекций коллагена используется продукт животного происхождения. Долгое время читалось, что коллаген животного происхождения обладает максимальной аллергической нагрузкой, перед процедурой обязательно проведение кожной пробы в районе предплечья, по размеру папулы и венчику гиперемии доктор через 2-3 дня определяет нужно колоть или нет.

Перед тем, как делать инъекцию коллагена, врач обычно отмечает на коже места, куда вводить гель и решает, какое количество геля потребуется. Сам гель содержит физиологический раствор натрия хлорида, в котором и растворен коллаген. Поэтому первое время после инъекции кожа может выглядеть несколько отечной. Через короткое время эта отечность проходит. Длительность эффекта бычьего коллагена составляет примерно 4 – 6 месяцев. Затем он постепенно рассасывается и нужны новые инъекции коллагена. В большем количестве случаев препараты бычьего коллагена могут применяться у людей, которые прошли аллергологическую пробу на этот филлер.

Аминокислотная заместительная терапия представляет собой новую концепцию синтеза коллагена. В ее основе лежит принцип восполнения аминокислот, как структурных элементов для синтеза нового дермального матрикса. Возрастные изменения в строении коллагена обусловлены не только генетическими причинами. Для поддержания выработки коллагена клетки кожи – фибробласты – нуждаются в аминокислотах, прежде всего в глицине, лизине, пролине, лейцине. Поэтому, один из способов борьбы со старением коллагена – обеспечение дермы необходимыми аминокислотами. Причем важно, чтобы это были левовращающиеся изомеры аминокислот (L-формы) в определенном пропорциональном соотношении. Для того чтобы напитать кожу аминокислотами может потребоваться от 3 до 6 сеансов, один раз в неделю.

Процедуры аминокислотнозаместительной (АЗТ) терапии могут быть рекомендованы как самостоятельно, так и в комплексе с физиотерапевтическими процедурами, направленными на активный синтез коллагена.

Все большую популярность среди пациентов и врачей приобретают сочетание АЗТ вместе с фракционным фототермолизом.

Аминокислотнозаместительная терапия выполняется на 3, 7 и 21 день до проведения фракционного фототермолиза.

Коллагеновые коктейли

Здесь же нельзя не рассказать о коллагеновых коктейлях, основной принцип этих биологически активных коктейлей схож с принципом аминозаместительной терапии. Максимально снабдить кожу необходимыми аминокислотами. И если в случае с инъекциями коллагена введение левовращающихся изомеров все довольно понятно.

То механизм доставки аминокислот в неизменненом виде, прошедших этапы пищеварения в дерму остается открытым. При этом назвать коллагеновые коктейли, порошки и пилюли бесполезным изобретением невозможно. Ведь коллаген-это не только дермальный матрикс, но еще сухожилия, соединительная ткань и даже роговица глаза. Эти препараты могут быть рекомендованы с целью общего оздоровления организма.

Фракционный фототермолиз

Несколько слов о фракционном фототермолизе, как одном и этиопатогенетических способов борьбы со старением.

Высокоинтенсивные лазерные микролучи проникают на глубину до 1мм, образуя колонки микрокоагуляции. Запускается процесс естественного восстановления тканей с формированием нового коллагена. За счет фракциональности (разделения) лазерного луча в коже остаются островки неповрежденной ткани, из которой и идет заживление. Сохраняется регенеративный ресурс кожи, а это обеспечивает реабилитацию в течении 1-2 -х дней, что является несомненным плюсом в ритме жизни большого города.

Фракционный неабляционный лазер использует гораздо большую энергию на каждый микролуч(до 100 mJ) чем любая другая система, что делает фракционное лазерное омоложение эффективной терапевтической методикой.

Молодость все активнее становится модным трендом. Словосочетания синтез коллагена и эластина, стимуляция фибробластов ни у кого не вызывает ни малейшего опасения и сомнения. Биологические процессы, протекающие в организме и, в том числе, коже, подчинены определенным ритмам и закономерностям.

В погоне за молодостью и специалистам и пациентам не стоит забывать, что «лекарство» не должно быть сильнее «заболевания». И безопасность процедур по выработке коллагена должна оценивать так же тщательно, как эффективность.

Источник: Kosmetik I nternational journal (Украина)

UP — КРЕМ СТИМУЛИРУЮЩИЙ ВЫРАБОТКУ КОЛЛАГЕНА

Преимущества

+ Способствует синтезу нового коллагена и эластина

+ Глубоко увлажняет

+ Оказывает продвинутую антиоксидантную защиту

+ Не содержит минеральных масел

+ Гипоаллергенный

+ Некомедогенный

Состав

Не тестируется на животных, не содержит в составе компонентов животного происхождения.

Ингредиенты:
Water/Aqua/Eau, Isoamyl Laurate, Glycerin, Polyacrylate-13, Polyisobutene, Sodium Hyaluronate, Pseudoalteromonas Ferment Extract, Tripeptide-1, Hexapeptide-2, Palmitoyl Tetrapeptide-7, Palmitoyl Tripeptide-1, Palmitoyl Tripeptide-5, Copper Tripeptide-1, Tripeptide-10 Citrulline, Acetyl Tetrapeptide-9, sh-Oligopeptide-1, Dipeptide Diaminobutryroyl Benzlamide Diacetate, Hydrolyzed Wheat Protein, Hydrolyzed Soy Protein, Physalis Angulata Extract, Betaine, Tremella Fuciformis Sporocarp Extract, Tocopherol, Beta-Glucan, Avena Sativa (Oat) Kernal Extract, Glycine Soja (Soybean) Oil, Hydrogenated Lecithin, Dimethylmethoxy Chromanol, Mannitol, Polysorbate 20, Ethylhexylglycerin, Caprylhydroxamic Acid, Caprylyl Glycol, Carbomer, Sodium Lactate, Lecithin, Xanthum Gum, Triethanolamine, Butylene Glycol, Disodium EDTA, Sodium Oleate, Sorbitan Isostearate, Caprylic/Capric Triglyceride, Potassium Sorbate, Phenoxyethanol.

Как использовать

ОЧИЩЕНИЕ + ТОНИК:

Для увеличения эффективности оптимально использовать эмульсию Pep Up™ после приема душа, когда поры раскрыты. Или же для открытия пор приложите к коже теплое влажное полотенце. Нанесите ваш любимый тоник, если вы им пользуетесь, а затем эмульсию.

ДОЗИРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ:

Отмерьте двумя нажатиями на дозатор эмульсию и нанесите небольшими каплями на лицо и шею. Для области декольте может понадобиться дополнительная порция крема.

МАССАЖ И ПОХЛОПЫВАНИЕ:

Легкими, быстрыми движениями нанесите эмульсию по массажным линиям. Пока эмульсия еще влажная, постукивая пальцами, добейтесь полного впитывания.

Снижение выработки коллагена в коже с хронологическим возрастом

Abstract

Снижение синтеза коллагена I и III типов характерно для хронологически стареющей кожи. В настоящем отчете представлены доказательства того, что как старение клеточных фибробластов, так и дефектная механическая стимуляция в стареющих тканях способствуют снижению синтеза коллагена. Снижение синтеза коллагена из-за старения фибробластов было продемонстрировано более низкой продукцией проколлагена типа I дермальными фибробластами, выделенными из кожи молодых (от 18 до 29 лет), по сравнению с людьми пожилого возраста (80+ лет) (82 ± 16 против 56 ± 8 нг / мл; P <0. 05). Снижение механической стимуляции в хронологически стареющей коже было выведено из морфологических, ультраструктурных и флуоресцентных микроскопических исследований. Эти исследования, сравнивающие срезы кожи молодых и старых людей, продемонстрировали больший процент клеточной поверхности, прикрепленной к коллагеновым волокнам (78 ± 6 против 58 ± 8%; P <0,01) и более широкое распространение клеток (1,0 ± 0,3 по сравнению с 0,5 ± 0,3; P <0,05) в молодой коже по сравнению со старой кожей.Эти особенности соответствуют более низкому уровню механической стимуляции клеток старой кожи по сравнению с молодой. На основании представленных здесь результатов мы заключаем, что снижение синтеза коллагена в коже с хронологическим возрастом отражает, по крайней мере, два различных основных механизма: старение клеточных фибробластов и более низкий уровень механической стимуляции.

Уменьшение количества фибриллярного коллагена (типы I и III) является характерной чертой хронологически стареющей кожи и усиливается при фотоповреждении. Это было хорошо описано с использованием гистологического и ультраструктурного подходов в прошлом, ^1–5 , и наши собственные недавние исследования задокументировали это биохимически как в хронологическом старении ⁶ , так и в фотостарении. ⁷ Разлагающие коллаген матриксные металлопротеиназы (ММП) активируются в коже под действием УФ-излучения. ^8,9 Повторяющаяся индукция этих ферментов под воздействием солнечного излучения в течение многих лет или десятилетий, вероятно, является причиной фрагментации коллагена в поврежденной солнцем коже.Во время естественного или хронологического старения кожи количество тех же ММП, которые резко активируются в ответ на УФ-излучение, постепенно увеличивается. Это наблюдалось в монослойной культуре с клетками, полученными от старых и молодых субъектов, ^10–14 , и наши собственные исследования показали постепенное повышение уровня ММП в неповрежденной (старой по сравнению с молодой) коже. ¹⁵

Хотя разрушение существующего коллагена, несомненно, является центральным элементом пагубных изменений, наблюдаемых в стареющей / фотостареющей коже, неспособность заменить поврежденный коллаген вновь синтезированным материалом также имеет решающее значение для общей патофизиологии. Существует устойчивое подавление синтеза коллагена в фотоповрежденной коже по сравнению с тем, что происходит в здоровой защищенной от солнца коже ¹⁶ и в хронологически старой защищенной от солнца коже по сравнению с тем, что наблюдается в молодой коже. ¹⁵

Механизмы, лежащие в основе потери синтеза коллагена в фотоповрежденной коже и хронологически стареющей коже, полностью не определены. В недавней серии исследований мы продемонстрировали, что в сильно фотоповрежденной коже присутствие фрагментированного коллагена в дерме ингибирует синтез коллагена.Основываясь на результатах различных подходов in vitro и in vivo , мы пришли к выводу, что поврежденный коллаген не поддерживает уровень механического напряжения резидентных фибробластов, необходимый для эффективного синтеза коллагена. ^6,7,17,18 Неизвестно, способствует ли подобный механизм снижению выработки коллагена в хронологически стареющей коже, и если да, то в какой степени он ответственен за общее снижение коллагена, наблюдаемое в стареющей коже. Эти вопросы рассматриваются в настоящем исследовании.

Материалы и методы

Биопсии кожи

Для этого исследования были набраны люди в возрасте от 18 до 29 лет (молодая когорта) и люди 80 лет и старше (старая когорта). Повторные 2- и / или 4-миллиметровые ударные биопсии защищенной от солнца кожи бедра были получены от каждого человека. Пуансоны диаметром 4 мм использовали для флуоресцентного микроскопического и ультраструктурного анализа, а также для оценки уровней проколлагена I типа. По прибытии в лабораторию один из 4-мм биоптатов немедленно замораживали в среде с оптимальной температурой для резки (OCT), а другой кусок фиксировали в глутаральдегиде.Пунш-биопсии диаметром 2 мм использовались для рутинной гистологии на уровне светового микроскопа и в качестве источника ткани для выделения дермальных фибробластов. Для рутинной гистологии биопсии фиксировали в 10% забуференном формалине. Выделение фибробластов было выполнено, как указано ниже. Все процедуры с участием людей были одобрены институциональным наблюдательным советом, а биопсии были получены после получения информированного согласия.

Кожные фибробласты человека в однослойной культуре

Фибробласты выделяли из биоптатов кожи, как описано ранее. ¹⁵ Вкратце, биопсию измельчали ​​ножницами и пинцетом, и фрагменты ткани переносили в отдельные лунки 24-луночной чашки. В качестве культуральной среды использовалась модифицированная Дульбекко минимально необходимая среда с добавлением заменимых аминокислот и 10% фетальной телячьей сыворотки (DMEM-FBS). Добавляли только минимальное количество среды, чтобы кусочки ткани прилипали к пластиковой поверхности. Чашки поддерживали при 37 ° C в атмосфере 95% воздуха и 5% CO ₂ . В конце концов, наблюдалась пролиферация фибробластов по краю некоторых фрагментов ткани.Когда клетки были доступны в достаточном количестве, их собирали с помощью трипсин / этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и выращивали в монослойной культуре с использованием DMEM-FBS. Клетки субкультивировали путем воздействия трипсин / ЭДТА один или два раза, а затем использовали в экспериментах.

Проколлаген I типа

Серийные замороженные срезы получали из биоптатов кожи, залитых ОКТ, следующим образом: 7, 200 и 7 мкм. После окрашивания гематоксилином и эозином площади срезов с обоих концов 200-мкм образца измеряли с помощью программного обеспечения Image ProPlus для расчета объема 200-мкм образца.Растворимые белковые экстракты были приготовлены из образцов размером 200 мкм, которые были гомогенизированы в ледяном буфере для экстракции (50 ммоль / л Трис-HCl, pH 7,4, 0,15 моль / л NaCl, 1% Тритон X-100 и ингибиторы протеаз [ Complete Mini, Hoffmann-LaRoche, Nutley, NJ]) и встряхивают в присутствии стеклянных шариков (Biospec, Bartlesville, OK). После центрифугирования в течение 10 минут при 10000 × g и 4 ° C супернатанты анализировали на проколлаген I с использованием коммерческого набора для иммуноферментного анализа (Panvera, Madison, WI), как описано ранее. ¹⁵ В анализе проколлагена используется антитело к С-концевой области пропептида, которое является частью молекулы коллагена, поскольку оно синтезируется и секретируется (перед протеолитическим расщеплением). Таким образом, этот анализ является мерой вновь синтезированного коллагена. Концентрации проколлагена I типа нормализовали к объему ткани, использованной для приготовления каждого образца.

Продукция проколлагена I типа также оценивалась в дермальных фибробластах в монослойной культуре. Фибробласты высевали по 4 × 10 ⁴ клеток на лунку в 24-луночные планшеты, используя DMEM-FBS в качестве культуральной среды.Клеткам давали прикрепиться в течение ночи. На следующий день их промывали, а затем инкубировали в среде для роста кератиноцитов (Cambrex Bioscience, Walkersville, MD) с добавлением 1,4 ммоль / л Ca ²⁺ . Среда для роста кератиноцитов представляет собой бессывороточную модификацию среды MCDB-153 с низким содержанием Ca ²⁺ , дополненную эпидермальным фактором роста (EGF), инсулином, гидрокортизоном и экстрактом гипофиза. Число клеток определяли через 2 дня, высвобождая клетки с помощью трипсина / ЭДТА и подсчитывая их с помощью счетчика частиц (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Во время сбора культуральные жидкости, не содержащие сыворотки, собирали и оценивали на проколлаген I типа, используя ту же процедуру иммуноферментного анализа, а затем нормализовали по количеству клеток.

Иммуноокрашивание и конфокальная микроскопия

Моноклональные антитела мыши к винкулину были получены от Chemicon (Temicula, CA). Первичное антитело визуализировали с помощью кроличьего антитела против IgG мыши, связанного с Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), и дополнительно амплифицировали с помощью козьего антитела против IgG кролика Alexa Fluor 488.Alexa Fluor 546-фаллоидин (Invitrogen) использовали в качестве зонда на актин. Ядра контрастировали с помощью ядерного красителя 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола, дигидрохлорида (DAPI) (Prolong Gold; Invitrogen). (Обратите внимание, что Alexa Fluor 488 спектрально подобен флуоресцеину, тогда как Alexa Fluor 546 спектрально подобен родамину.)

Для окрашивания использовались замороженные биопсии кожи молодых и пожилых людей с включенными ОКТ. Вкратце, замороженные срезы ткани фиксировали 4% формальдегидом в течение 20 минут.После фиксации срезы ткани дважды промывали промывочным буфером (0,05% Твин 20 в забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко) с последующей пермеабилизацией 0,1% Тритоном Х-100 в течение 10 минут. Срезы тканей снова промывали и затем подвергали воздействию блокирующего раствора, состоящего из 1% бычьего сывороточного альбумина в забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко, в течение 30 минут. Затем срезы обрабатывали антителом против винкулина в блокирующем растворе в течение 1 часа. После трех последовательных стадий промывки (каждая по 5 минут) каждый образец обрабатывали вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 488, в блокирующем растворе и инкубировали в течение 45 минут.Срезы одновременно окрашивали на экспрессию актина с использованием фаллоидина Alexa Fluor 546 вместе со вторичным антителом. После трех дополнительных стадий промывки (по 5 минут каждая) срезы тканей обрабатывали в течение 30 минут амплификационными антителами (козий антикроличий IgG Alexa Fluor 488). За этим следовали две дополнительные стадии промывки и обработка DAPI (контрастное окрашивание ядер) в течение 3 минут. После трех заключительных этапов промывки срезы тканей один раз промывали водой. Покровные стекла помещали на предметные стекла микроскопа с помощью Prolong Anti-Fade (Invitrogen).Окрашенные срезы тканей исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии. Микроскопию выполняли на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 510 с использованием водно-иммерсионного объектива 63 × (C-Apochr) (числовая апертура (NA) = 1,2). Длины волн лазерного возбуждения включали 364, 488 и 543 нм, сканированные последовательно линейным методом.

Исследования под световой микроскопией и просвечивающей электронной микроскопией

Биоптаты кожи фиксировали в течение ночи в 2% глутаровом альдегиде в 0,1 ммоль / л какодилатном буфере (Sigma, St.Луис, Миссури) при pH 7,4. Образцы, фиксированные глутаральдегидом, обрабатывали 2% тетроксидом осмия, забуференным 0,1 ммоль / л какодилатным буфером. Образцы были обезвожены с помощью этанола с градуировкой до 2х100% этанола и 2х пропиленоксида (EM Sciences). Образцы заливали чистой эпоновой смолой. Срезы ткани размером 1 микрометр были вырезаны, окрашены толуидиновым синим и исследованы на уровне светового микроскопа. Площадь поверхности, занимаемую отдельными клетками, оценивали количественно с использованием программного обеспечения NIH Image на срезах размером 1 мкм, полученных из фиксированной глутаральдегидом и залитой пластиком ткани.

Те же срезы тканей, которые использовались для количественной оценки площади поверхности на уровне светового микроскопа, также использовались для определения областей, представляющих интерес для просвечивающей электронной микроскопии. Ультратонкие срезы вырезали из представляющих интерес областей, окрашивали цитратом свинца и уранилацетатом (оба от EM Sciences) и наблюдали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Phillips 400. Фотографии были сделаны с нескольких участков каждого образца. Используя фотографии с высоким разрешением, интерстициальные клетки количественно оценивали на предмет процентной доли границы клетки, контактирующей с отдельными коллагеновыми фибриллами или пучками коллагеновых фибрилл.Хотя сложно идентифицировать интерстициальные фибробласты со 100% точностью, очевидные контаминанты (тучные клетки, клетки сосудистых структур, железистые эпителиальные клетки и эритроциты) не оценивались.

Статистический анализ

Сравнивали пролиферацию, выработку проколлагена I типа, двумерные измерения площади поверхности и данные о прикреплении коллагена между молодой и старой кожей. Данные были проанализированы с использованием двухвыборочного теста Стьюдента t (аналитическое программное обеспечение Microsoft Excel и SAS).Сводные данные выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Все значения P двусторонние.

Результаты

Синтез проколлагена I типа в коже молодых и пожилых людей

В первой серии экспериментов содержание проколлагена I типа было измерено в коже молодых и старых людей. Содержание проколлагена I типа, маркера продолжающегося синтеза коллагена, было снижено на 68% в старой коже по сравнению с молодой кожей.

Производство проколлагена типа I в молодой и старой коже.Показанные значения являются средними ± SEM для шести молодых и шести пожилых людей. Статистическая значимость различий между молодой и старой кожей определялась с использованием критерия Стьюдента t . * Значимость на уровне P <0,05.

Синтез проколлагена типа I изолятами фибробластов из молодой и старой кожи

Затем кондиционированную среду из культур молодых и старых фибробластов оценивали на продукцию проколлагена типа I. Изоляты из когорты молодых людей синтезировали больше проколлагена типа I, чем изоляты фибробластов из когорты старых людей.Клетки, выделенные из молодой кожи, также размножались в большей степени.

Клеточная пролиферация и продукция проколлагена I типа в монослойной культуре. Пролиферация ( A ) и продукция проколлагена I типа ( B ) фибробластами, выделенными из молодой и старой кожи. Показанные значения представляют собой средние значения ± SEM на основе 26 изолятов фибробластов от восьми молодых людей и 37 изолятов от восьми пожилых людей. Статистическая значимость различий между изолятами из молодой и старой кожи определялась с использованием теста Стьюдента t .* Значимость на уровне P <0,05.

Структура коллагена, взаимодействия фибробластов и коллагена и форма клеток

in vivo : Сравнение молодой и старой кожи

Для определения взаимосвязи между структурой коллагена и формой клеток была проведена серия связанных гистологических, ультраструктурных и флуоресцентных микроскопических анализов. и распределение белка в сайте адгезии. Различия в содержании пучков волокон наблюдались между молодой и старой кожей. Пучки волокон были толще, и было меньше открытого пространства внутри и между пучками в папиллярной дерме у лиц в возрасте от 18 до 29 лет, чем в соответствующей ткани у пациентов в возрасте 80+.На срезах молодой кожи можно увидеть интерстициальные клетки, ориентированные в плоскости полимера коллагена (вставка). В старой коже сосочковый слой дермы характеризовался наличием открытого пространства, перемежающегося перекрещивающимися, спутанными тонкими волокнами. Доказательств ориентации пучков волокон было мало. Открытое пространство вокруг интерстициальных клеток было очевидным (, стрелки), и было мало свидетельств ориентации клеток (, вставка).

Гистологические особенности защищенной от солнца кожи молодых и пожилых людей, наблюдаемые на 5-мкм срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, из фиксированной формалином ткани (основные рамки) и в 1-мкм окрашенных толуидиновым синим срезах из фиксированного глутаральдегидом, салфетка заделанная пластиком ( вкладышей, ).Толстые пучки волокон присутствуют в верхней части дермы молодой защищенной от солнца кожи. Вставка: Видно, что некоторые фибробласты ориентированы в плоскости пучков волокон. В старом образце кожи пучки были заменены тонкими неорганизованными волокнами. В дерме больше открытого пространства. Интерстициальные клетки имеют округлую или продолговатую форму, некоторые окружены открытым пространством ( стрелки ). Врезка: Ориентация фибробластов ( стрелка ) не очевидна. Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, × 490; Срезы, окрашенные толуидиновым синим ( вставок, ) × 980.

Форма клеток (двумерное поперечное сечение клеток в срезах толщиной 1 мкм из ткани, залитой пластиком) была количественно исследована. Клетки от молодых особей были более распространены, чем соответствующие клетки от старых особей. Количественные данные, представленные в, были получены на срезах поверхностной (сосочковой) дермы. Когда те же анализы были сделаны в более глубоких слоях (ретикулярной) дермы, результаты были аналогичными (не показаны).

Форма фибробластов в сосочковом слое дермы защищенной от солнца кожи бедра молодых и старых людей (окрашенные толуидиновым синим срезы толщиной 1 мкм из фиксированной глутаральдегидом и залитой пластиком ткани). Верхняя панель: Клетки в молодой коже уплощены, цитоплазма и ядро ​​видны ( стрелка ). Ячейки встроены в матрицу. Клетки в старой коже выглядят круглыми, и видны только ядро ​​и небольшое количество цитоплазмы ( стрелки ). Нижняя панель: Измерения площади поверхности были выполнены количественно, как описано в разделе «Материалы и методы». Значения представляют собой среднюю площадь поверхности поперечного сечения ± SEM на основе 160 клеток защищенной от солнца кожи шести молодых людей и 57 клеток защищенной от солнца кожи шести пожилых людей.Статистическую значимость определяли с использованием критерия Стьюдента t (двусторонний). * P <0,01 (увеличение × 240).

Ультраструктурные особенности матрицы сравнивались на срезах молодой и старой кожи. В целом, не было серьезных различий во внешнем виде полимеров коллагена, которые можно было бы использовать для различения молодой и старой кожи. Однако были участки на участках старой кожи, где плотность коллагена была снижена. Такие области в основном (хотя и не всегда) ограничивались сосочковидным слоем дермы.Случайные гладкие волокна присутствовали на некоторых срезах из старых образцов кожи, но мы никогда не обнаружили эластического материала, характерного для сильно поврежденной солнцем кожи. ^2,3,5

В рамках анализа было изучено взаимодействие между интерстициальными клетками и окружающим коллагеном. В этих исследованиях мы избегали тучных клеток, эпителиальных клеток в железистых структурах, клеток, связанных с микрососудом, и любых воспалительных клеток, которые могли присутствовать. Таким образом, большинство охарактеризованных клеток были интерстициальными фибробластами.демонстрирует и количественно определяет взаимодействие этих клеток с окружающим коллагеном на срезах молодых и старых людей. На срезах кожи от 18 до 29 лет клетки контактировали с интактными фибриллами коллагена на большей части их поверхности (двухмерное изображение), чем клетки на срезах старой кожи.

Ультраструктурный вид дермальных фибробластов на здоровой защищенной от солнца коже бедер молодых и пожилых людей. A и B: Клетка с участка молодой кожи ( A ) уплощенная и хорошо разложенная.Клетка контактирует с коллагеновыми волокнами на большей части своей поверхности. Клетка в образце старой кожи ( B ) имеет округлую форму и контактирует с полимером коллагена на меньшей части своей поверхности. Вокруг камеры больше открытого пространства. (Компьютерная окраска клеток была сделана, чтобы помочь в отделении клеток от внеклеточного материала [увеличение × 2050]). C: Большое увеличение (× 3500) старой кожи, показывающее бороздки в волокнах (типичные для коллагена). D: Количественная оценка контакта между клетками и коллагеновыми волокнами. Значения представляют собой процент границы клетки, контактирующей с коллагеновыми волокнами ± SEM ( P = 0,01; двусторонний тест Стьюдента t -тест). Измерения основаны на 33 клетках на срезах здоровой кожи шести молодых людей и 38 клетках на срезах шести старых людей.

Экспрессия белка в сайте адгезии: сравнение клеток в молодой и старой коже

В последней серии экспериментов антитело против винкулина использовали для идентификации фокальных сайтов адгезии с помощью флуоресцентной микроскопии.В клетках как молодой, так и старой кожи было очевидное окрашивание против винкулина. Окрашивание срезов кожи молодых людей было связано с пучками волокон, о чем свидетельствует их тускло-оранжевый вид на окрашенных срезах. На срезах старой кожи было меньше очаговых спаек, и большая часть окрашивания была тесно связана с ядрами (синий цвет). Дифференциальный паттерн экспрессии белка сайта адгезии коррелирует с различиями в разрастании клеток, наблюдаемыми на уровне светового микроскопа, и взаимодействиями клетки с коллагеном, наблюдаемыми на уровне просвечивающей электронной микроскопии.С другой стороны, флуоресценция, связанная с ядром, может указывать на внутриклеточный (предположительно, функционально неактивный) пул винкулина.

Экспрессия белка сайта адгезии на участках здоровой защищенной от солнца кожи бедра молодых и пожилых людей. Срезы тканей (замороженные с включенным ОКТ) окрашивали с использованием антител к винкулину и одновременно с фаллоидином (актиновое окрашивание) и DAPI (ядерное окрашивание), как описано в разделе «Материалы и методы». После окрашивания клетки исследовали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.Клетки идентифицируются по их ядрам, окрашенным в синий цвет (DAPI). Ярко-зеленая пунктированная флуоресценция идентифицирует винкулин. В образцах кожи 18–29-летних винкулин можно увидеть на расстоянии от ядра, и во многих областях винкулин, по-видимому, находится в непосредственной близости к коллагеновым волокнам. В коже 80+ лет явно видны ядра, окрашенные в синий цвет, но винкулина меньше, чем в образцах молодой кожи. Там, где очевидно интенсивное очаговое окрашивание, оно окружает ядро ​​( стрелки ).Вдали от ядра окрашивание более диффузное, чем в клетках молодой кожи. Представленные разделы представляют молодую и старую защищенную от солнца кожу шести индивидуумов соответственно. Как в молодой, так и в старой коже коллагеновые волокна видны по их тускло-оранжевой флуоресценции (увеличение × 1200).

Обсуждение

Существует большое количество литературы, демонстрирующей взаимосвязь между механическим напряжением на клетках in vitro и биологическими ответами клеток на стресс. ^19–23 При достаточном уровне механического напряжения фибробластов производство коллагена и других компонентов внеклеточного матрикса является высоким. Когда напряжение снижается, производство матрикса падает, и одновременно стимулируется выработка ферментов, разрушающих матрикс. ^24–30 Lapiere et al. ³¹ непосредственно измерили механические силы, создаваемые фибробластами в трехмерных решетках коллагена. В серии исследований они продемонстрировали, что снижение синтеза коллагена, происходящее в результате снижения механического напряжения, отражает снижение транскрипции генов интерстициальных коллагенов, влияние на ферменты, участвующие в посттрансляционном процессинге проколлагеновых пептидов, и усиление выработки разлагающих коллаген ММП. Кроме того, было показано, что за измененную транскрипцию генов ответственны множественные сигнальные пути. ^32,33 Интересно, что изменения в продукции ММП, возникающие в результате потери механического напряжения, можно четко отделить от изменений, происходящих в результате стимуляции интерлейкином-1. ³⁴

В соответствии с этими прошлыми наблюдениями, исследования в нашей лаборатории показали, что когда человеческие дермальные фибробласты поддерживаются на нативных трехмерных решетках коллагена, эти клетки продуцируют проколлаген I типа.Когда коллаген в решетке фрагментировался под воздействием ММП-1 (интерстициальная коллагеназа) или ферментов, вырабатываемых кожей, подвергшейся воздействию УФ-излучения (в первую очередь, ММП-1), происходило снижение выработки коллагена. Одновременно со снижением выработки коллагена на фрагментированных решетках коллагена происходило снижение механического напряжения, о чем свидетельствовало уменьшение распространения клеток, уменьшение фокальных адгезий и растворение актиновых стрессовых волокон. ^6,7,17,18 Параллельные исследования показали, что в сильно фотоповрежденной коже (с ее обширной деградацией коллагена) резидентные фибробласты характеризовались такими же морфологическими, ультраструктурными и флуоресцентными микроскопическими данными, которые наблюдались в in vitro на фрагментированном коллагене. ¹⁸ Наша интерпретация этих результатов заключается в том, что деградация коллагена при серьезном фотоповреждении создает среду, которая неспособна поддерживать уровень механического напряжения, необходимый для эффективной синтетической активности коллагена.

Фрагментация коллагена, снижение общего количества коллагена и уменьшение взаимодействия клеток с коллагеновыми волокнами также характеризуют хронологически стареющую кожу. ^1–3,5 Ферменты, ответственные за деградацию коллагена, постепенно увеличиваются в коже. ¹⁵ Синтез коллагена также может постепенно снижаться, но снижение выработки нового коллагена наиболее очевидно, когда повреждение кожи клинически очевидно. ¹⁵ Настоящее исследование было предпринято, чтобы определить, какие факторы способствуют потере синтетической активности коллагена при хронологическом старении. Основываясь на представленных здесь результатах, мы предлагаем как минимум два механизма. Исследования in vitro показывают, что снижение синтеза коллагена в старой коже отражает, по крайней мере частично, возрастное снижение активности синтеза коллагена в резидентной популяции фибробластов.Фибробласты, полученные из защищенной от солнца кожи молодых людей (от 18 до 29 лет), синтезировали в среднем 82 нг проколлагена типа I на 5 × 10 ⁴ клеток, тогда как клетки пожилых людей (старше 80 лет) синтезировали 56 нг на 5 × 10 ⁴ клеток в идентичных условиях in vitro . В сочетании с этим фактом является меньшее количество интерстициальных фибробластов в стареющей коже по сравнению с молодой кожей, ¹⁵ , что способствует снижению способности к росту. Таким образом, даже когда все факторы окружающей среды, которые могут способствовать различиям in vivo , удалены, все еще существует возрастная разница в способности к синтезу коллагена, которая объясняет, по крайней мере, часть ранее задокументированного снижения содержания коллагена в стареющей коже. ⁶

Если снижение синтетической способности коллагена происходит как функция старения фибробластов (клеток), то какую роль играет снижение механического напряжения? Хотя может быть трудно точно оценить процент общего снижения выработки коллагена (в старой коже по сравнению с молодой кожей), обусловленный уменьшением механического напряжения, следующий анализ служит основой для сравнения. Наши прошлые исследования ¹⁵ показывают, что выработка коллагена в защищенной от солнца коже пожилых людей (80+ лет) снижается примерно на 75% по сравнению с производством в соответствующей коже молодых (от 18 до 29 лет) взрослых.И вестерн-блоттинг кожных экстрактов, и иммуноокрашивание на проколлаген I типа в этом отношении согласуются. Эти прошлые результаты также согласуются с прямыми измерениями проколлагена типа I в молодой и старой коже, представленными здесь (т. Е. Снижение на 68% для старой по сравнению с молодой кожей;). Если количество фибробластов в коже у лиц старше 80 лет снижается примерно на 35% по сравнению с количеством фибробластов в коже у лиц в возрасте от 18 до 29 лет, как показывает морфометрический анализ ¹⁵ и если проколлаген I типа синтез снижен в среднем на 30% в фибробластах из старой кожи, как указано в настоящем исследовании, тогда разумно предположить, что возрастные различия в биосинтетической активности фибробластов составляют примерно 45% от общего снижения. Остальные 30% составляют другие факторы (включая потерю механического натяжения). Это разделение схематично показано на рис. Насколько окончательная точность разделения 45% / 30% менее важна, чем тот факт, что, хотя потеря механического напряжения, по-видимому, является основным фактором, лежащим в основе снижения синтеза коллагена в фотоповрежденной коже, ¹⁸ для хронологически стареющей кожи, это одна из два содействующих механизма.

Схематическое изображение механизмов, лежащих в основе снижения синтеза коллагена в стареющей коже.

Интересно, что возрастные изменения биосинтетической активности фибробластов и снижение внешнего механического напряжения на клетках дермы стареющей кожи не могут быть независимыми. Такое же снижение механического напряжения, которое снижает выработку коллагена резидентными фибробластами, также может косвенно способствовать постоянным изменениям функции фибробластов. Принято считать, что фенотипические изменения, наблюдаемые в старых фибробластах, в значительной степени опосредованы повреждением кислородными радикалами. ³⁵ Это потенциально связано с рассматриваемой проблемой, потому что среди изменений, которые происходят в условиях пониженного механического напряжения, есть повышенный окислительный стресс, о чем свидетельствуют повышенные уровни активных форм кислорода и измененная экспрессия антиоксидантных ферментов (G.Дж. Фишер, неопубликованные наблюдения). Из этого можно сделать вывод, что повреждение окружающей среды причинно предшествует изменениям в функции фибробластов, которые наблюдаются в пожилом или старческом состоянии.

Возрастное снижение синтетической активности коллагена может быть, по крайней мере частично, обратимым. Было продемонстрировано, что такие агенты, как полностью транс-ретиноевая кислота, могут стимулировать выработку коллагена в стареющей коже. ^16,36–38 Неудивительно, что местное применение ретиноидов приводит к улучшению внешнего вида стареющей кожи ³⁹ и фотоповрежденной кожи. ⁴⁰

Таким образом, синтетическая способность коллагена в стареющей (защищенной от солнца) коже является низкой по сравнению с таковой в здоровой молодой защищенной от солнца коже. Основываясь на данных, представленных здесь, а также по аналогии с моделями in vitro и результатами исследований фотостарения, мы предполагаем, что старые фибробласты имеют зависимое от возраста снижение способности к синтезу коллагена и одновременно испытывают потерю механической стимуляции в результате снижения неповрежденные коллагеновые волокна.

важность для здоровья и красоты кожи