Арарат калия: Калия оротат таблетки 500 мг инструкция по применению — akvaufa5.ru

Калия оротат в таблетках. Инструкция и способ применения

Описание

Круглые плоскоцилиндрические таблетки белого цвета с фаской, с риской на одной стороне.

Состав

Состав на одну таблетку
Действующее вещество:

Калия оротат –500,0 мг
Вспомогательные вещества:

Лактозы моногидрат – 165,0 мг

Крахмал картофельный – 55,0 мг

Повидон К-17 – 22,5 мг

Кальция стеарат – 7,5 мг

Фармакодинамика

Препарат представляет собой калиевую соль оротовой кислоты. Оротовая кислота является
одним из предшественников пиримидиновых нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот,
которые участвуют в синтезе белковых молекул, в связи с чем соли оротовой кислоты
рассматриваются как вещества анаболического действия и применяются при нарушениях
белкового обмена для их стимуляции. Калия оротат стимулирует синтез нуклеиновых кислот,
продукцию альбумина в печени, особенно в условиях длительной гипоксии (недостаточности
кислорода), повышает аппетит, обладает диуретическим (мочегонным) и регенерирующим
свойствами.

Фармакокинетика

После приема внутрь в желудочно-кишечном тракте абсорбируется (всасывается) 10 % принятой
внутрь дозы. В печени превращается в оротидин-5-фосфат. Выводится почками (30 % в виде метаболитов).

Особые указания

В период лечения желательным является соблюдение диеты.

Влияние на управление автотранспортным средством, механизмами

Препарат не вызывает сонливости и уменьшения скорости психомоторных реакций.

Форма выпуска

Таблетки, 500 мг.
По 10 таблеток в контурную ячейковую упаковку из пленки поливинилхлоридной и фольги
алюминиевой печатной лакированной.
2, 5 контурных ячейковых упаковок по 10 таблеток с инструкцией по применению помещают в
пачку из картона.

Условия хранения и срок годности

В сухом месте при температуре не выше 25 °С в упаковке производителя.
Хранить в недоступном для детей месте.
4 года. По истечении срока годности, указанного на упаковке, не использовать.

С осторожностью

Беременность и период лактации.

Калия оротат 500 мг №10 табл.

Инструкция

по медицинскому применению

лекарственного средства

Калия оротат

Торговое название

Калия оротат

Международное непатентованное название
Оротовая кислота

Лекарственная форма

Таблетки 0.5 г

Состав

Одна таблетка содержит

активное вещество – калия оротат 0.5 г,

вспомогательные вещества: лактоза моногидрат, крахмал картофельный, желатин, кислота стеариновая

Описание

Таблетки белого цвета плоскоцилиндрической формы, с гладкой поверхностью, c риской и фаской

Фармакотерапевтическая группа

Анаболические стероидные препараты для системного использования. Прочие анаболические стероидные препараты. Код АТХ А14В

Фармакологические свойства

Фармакокинетика

Абсорбируется в пищеварительном тракте не полностью, всасывается не более 10 % принятой дозы. Превращается в печени в оротидин-5-фосфат и выводится с мочой в виде различных метаболитов.

Фармакодинамика

Нестероидное анаболическое средство. Оказывает общее стимулирующее действие на обменные процессы. Является стимулятором синтеза нуклеиновых кислот, участвующих в синтезе белка, усиливает репаративные и регенеративные процессы в тканях. Оротовая кислота усиливает образование альбуминов в печени, особенно в условиях длительной гипоксии, возникающей при некоторых заболеваниях, например, при сердечной недостаточности. Препарат улучшает переносимость сердечных гликозидов, способствует увеличению диуреза.

Показания к применению

В составе комплексной терапии:

— заболеваний печени, вызванных острыми и хроническими интоксикациями

— прогрессирующей мышечной дистрофии

— инфаркта миокарда

— алиментарной и алиментарно-инфекционной дистрофии у детей

— анемии и другие состояния, требующие стимуляции анаболических процессов, в том числе при значительных физических нагрузках.

Способ применения и дозы

Препарат принимают за 1 час до или через 4 часа после еды. Доза для взрослых от 0,5 до 1,5 г в сутки (по 0,25 г — 0,5 г 2 – 3 раза в сутки). Курс лечения длится в среднем 20-30 дней. Максимальная суточная доза для взрослых – 3 г.

Детям при алиментарной и алиментарно-инфекционной гипотрофии, при анемиях, во время реконвалесценции препарат назначают из расчета 10-20 мг на 1 кг массы тела в сутки (в 2 — 3 приема). Курс лечения 3-5 недель.

При необходимости курс лечения повторяют после месячного перерыва.

Применять по назначению врача.

Побочные действия

— аллергические кожные реакции

— диспепсия

— гиперкалиемия.

Противопоказания

— повышенная чувствительность к компонентам препарата

— цирроз печени с асцитом

— гиперкалиемия

С осторожностью

— почечная недостаточность

— беременность и период лактации

Лекарственные взаимодействия

При взаимодействии с калийсберегающими диуретиками и ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента (каптоприл, лизиноприл и другими), возможно возникновение гиперкалиемии.

Эффективность калия оротата повышается при одновременном применении с фолиевой кислотой, цианкобаламином и препаратами магния.

Калия оротат несколько снижает токсичность сердечных гликозидов. Вяжущие и обволакивающие средства могут снизить всасывание калия оротата в желудочно-кишечном тракте.

Особые указания

Препарат назначают под контролем уровня калия в крови.

Калия оротат нельзя использовать как калийзамещающий препарат.

Беременность и лактация

В связи с отсутствием необходимых клинических данных препарат не рекомендуется назначать в период беременности и лактации (грудного вскармливания). Применение препарата возможно только после тщательной оценки лечащим врачом соотношения польза/риск.

Особенности влияния лекарственного средства на способность управлять транспортным средством или потенциально опасными механизмами

Препарат не оказывает влияние на управление транспортным средством и потенциально опасными механизмами.

Передозировка

Не выявлена.

Форма выпуска и упаковка

По 10 таблеток в контурной безъячейковой упаковке из бумаги, ламинированной полиэтиленом.

Контурные безъячейковые упаковки вместе с инструкциями по медицинскому применению на государственном и русском языках помещают в коробки из картона.

Условия хранения

Хранить в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25 ºС.

Хранить в недоступном для детей месте!

Срок хранения

4 года

Не применять препарат после истечения срока годности.

Условия отпуска из аптек

Без рецепта

Производитель

ОАО «Лубныфарм».

37500, Украина, г. Лубны, Полтавской обл., ул. Петровского, 16.

Владелец регистрационного удостоверения

ОАО «Лубныфарм», Украина.

Адрес организации, принимающей на территории Республики Казахстан претензии от потребителей по качеству продукции (товара)
ТОО «Фарм-Евро»
050039, г. Алматы, ул.Майлина, д.72, кв.34
Факс: +7(272) 71-84-97
E-mail: [email protected]

Влияние оротата калия на неоколлагеногенез при имплантации полипропиленового эндопротеза и эндопротеза из полипропилена с полимолочной кислотой в эксперименте

Основой патогенеза развития грыжи передней брюшной стенки является нарушение коллагенового обмена, что обусловливает слабость апоневроза. В конце прошлого столетия внимание герниологов привлекла проблема возникновения грыжи передней брюшной стенки с точки зрения коллагенового обмена. Была предложена концепция, отражающая нарушение соотношения коллагена I и III типов и, как следствие, появление грыжи [1—3]. Определенное соотношение коллагена I и III типов обеспечивает прочность соединительной ткани. Изменение этого соотношения в сторону уменьшения коллагена III типа ведет к слабости и снижению механической функции передней брюшной стенки [4—8].

Синтез коллагеновых фибрилл является многоэтапным и сложным процессом, происходящим в организме, и на каждом из этапов возможны нарушения. Восполнение недостающих элементов нормализует этот процесс [9—11]. Оротовая кислота, входящая в состав восстанавливающего агента 4-оксипролина, необходима для сохранения атома железа при гидроксилировании пролина [12]. Пищевыми источниками оротовой кислоты являются свиная печень, кисломолочные продукты, дрожжи [13]. В медицине известен препарат калия оротат, который влияет на обменные процессы в организме, участвует в синтезе коллагеновых волокон, стимулирует деление клеток [14].

Анализируя данные литературы, мы не выявили работ, описывающих действие калия оротата на формирование соединительной ткани и изменения соотношения типов коллагена в апоневрозе при грыже передней брюшной стенки, что определило актуальность нашего исследования.

Материал и методы

Экспериментальное исследование выполнено на 185 особях сингенных белых лабораторных мышей-самцов средней массой 45—50 г. Эксперименты, проводимые на животных, выполняли в соответствии с утвержденной Советом Европы в Страсбурге в 1986 г. Конвенцией о защите позвоночных животных при проведении экспериментов и в других целях и Директивой Совета от 24.11.86.

В зависимости от вида имплантированного эндопротеза и применения препарата калия оротата все животные были разделены на 4 группы.

Животным 1-й группы (n=43) имплантировали эндопротез из полипропилена. Во 2-й группе (n=47) использовали комбинированный эндопротез, в структуру которого входили нити из полипропилена с полимолочной кислотой. 3-ю группу (n=46)составили животные, которым имплантировали эндопротез из полипропилена, а в кормовой рацион добавляли препарат калия оротат в виде порошка из расчета 0,75 мг на одно животное в сутки. Животным 4-й группы (n=49) имплантировали комбинированный эндопротез и также в кормовой рацион добавляли калия оротат. Животные 3-й и 4-й групп получали препарат на протяжении всего эксперимента.

Эксперимент проводили в условиях операционного блока НИИ экологической медицины на базе Курского государственного медицинского университета. Оперативные вмешательства выполняли в асептических условиях с использованием эфирного наркоза. Далее производили разрез кожи на передней брюшной стенке длиной 1 см и помещали подкожно стерильный эндопротез размером 0,5×1,0 см без последующей его фиксации. Рану ушивали непрерывным швом.

Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом на 7, 10, 30, 60, 90-е сутки. Для получения гистологических препаратов брали участок передней брюшной стенки размером 1,0×1,5 см вместе с эндопротезом, после чего его фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Затем фрагменты брюшной стенки заключали в парафиновые блоки, из которых получали срезы толщиной 7—10 мкм. Полученные срезы помещали на предметные стекла и окрашивали пикросириусом красным по стандартной методике [3, 9, 15, 16]. Препараты исследовали под поляризационном микроскопом Altami Polar 2 в обычном и поляризационном свете при объективах ×10, ×25, ×40. Анализ соотношения типов коллагена в соединительной ткани вокруг эндопротеза проводили по цветовой гамме, индивидуальной для каждого типа. Так, коллаген I типа при поляризационной микроскопии имел красную окраску, коллаген III типа — зеленую. Для определения соотношения коллагена I и III типов использовали программный комплекс Altami Studio 3.0 и Image J. Для изучения плотности коллагеновых волокон вычисляли их концентрацию в пикселях на 1 дюйм графического редактора [17].

При анализе гистологических микропрепаратов в поляризационном свете во всех группах на 7-е и 10-е сутки эксперимента не выявлено достоверных различий в динамике соотношения коллагена I и III типов и плотности коллагеновых волокон (см. рис. 1, а, б).

Рис. 1. Микрофотографии на 10-е сутки эксперимента. Зоны имплантации эндопротеза из полипропилена (а) и комбинированного эндопротеза (б). В обоих случаях с добавлением в кормовой рацион калия оротата. Окраска пикрофуксином красным. Ув. соответственно 250 и 400.

На 30-е сутки эксперимента в 1-й группе визуализировалась соединительнотканная капсула вокруг нитей эндопротеза со строгой направленностью и непрерывностью пучков коллагеновых волокон, в которой отмечались «рыхлые» участки соединительнотканной капсулы, что говорило о ее незрелости. Плотность коллагеновых волокон составила 114,9±15,6 пикселя на 1 дюйм (табл. 1).

Таблица 1. Плотность коллагеновых волокон

В препаратах, полученных на 30-е сутки эксперимента при имплантации комбинированного эндопротеза, капсула имела плотную структуру, в которой отсутствовали «рыхлые» участки соединительнотканной капсулы, плотность коллагеновых волокон составила 149,5±13,3 пикселя на 1 дюйм (см. табл. 1).

При поляризационной микроскопии препаратов 2-й группы, полученных на 60-е сутки эксперимента, отмечено, что структура парапротезной капсулы была более выраженной по сравнению с таковой в 1-й группе. Наблюдались организованно направленные пучки коллагеновых волокон, плотно расположенные относительно друг друга. Анализ цветовой гистограммы показал явное преобладание красного цвета, что свидетельствовало о значительном доминировании коллагена I типа по сравнению с его содержанием в предыдущий срок. Соотношение коллагена I и III типов составило 1,96, что было достоверно больше, чем в 1-й группе животных.

К 90-м суткам эксперимента отмечалось значительное преобладание коллагена I типа над III типом при использовании обоих видов эндопротезов (табл. 2). Однако в группе с применением комбинированного эндопротеза капсула более интенсивно окрашивалась в красный цвет, пучки волокон плотно располагались относительно друг друга. Плотность коллагеновых волокон составила 278,1±19,5 пикселя на 1 дюйм, что было достоверно больше, чем в группе животных, в которой использовали полипропилен (см. табл. 1). Соотношение типов коллагена при использовании эндопротеза из полипропилена составило 1,75, что практически в 1,5 раза меньше по сравнению с этим показателем в группе, в которой использовался комбинированный эндопротез.

Таблица 2. Соотношение коллагена Iи III типов в области имплантации эндопротеза Примечание. * — р≤0,05 при сравнении между эндопротезами в одинаковые сроки эксперимента; # — р≤0,05 при сравнении между типами эндопротезов и в зависимости от использования калия оротата; m — стандартное отклонение; ТК — типы коллагена.

При поляризационной микроскопии препаратов, полученных на 30-е сутки эксперимента в 3-й и 4-й группах, определялись достоверные рзличия в соотношении типов коллагена по сравнению с таковым в предыдущие сроки. Соотношение коллагена I и III типов на 30-е сутки при имплантации эндопротеза из полипропилена в 3-й группе (рис. 2, а) было достоверно меньше, чем в 4-й группе животных, которым имплантировали комбинированный эндопротез (рис. 2, б), — 1,49 и 1,92 соответственно. Плотность коллагеновых волокон в 4-й группе составила 219,1±18,4 пикселя на 1 дюйм.

Рис. 2. Микрофотографии на 30-е сутки эксперимента. Зоны имплантации эндопротеза из полипропилена (а) и комбинированного эндопротеза (б). В обоих случаях с добавлением в кормовой рацион калия оротата. Окраска пикрофуксином красным. Ув. 400.

На 60-е сутки эксперимента в 3-й группе животных отмечалась многослойная парапротезная капсула без дефектов, плотность которой составила 262,7±16,4 пикселя на 1 дюйм. При использовании калия оротата и комбинированного эндопротеза на 60-е сутки эксперимента соотношение коллагена I и III типов составило 2,94, плотность парапротезной капсулы — 305,2±21,2 пикселя на 1 дюйм.

При экспериментальном использовании полипропиленового эндопротеза в сочетании с калия оротатом на 90-е сутки капсула имела незначительные «рыхлые» участки соединительнотканной капсулы (рис. 3, а), плотность коллагеновых волокон была равна 323,9±13,2 пикселя на 1 дюйм, что по сравнению с 4-й группой животных было достоверно меньше.

Рис. 3. Микрофотографии на 90-е сутки эксперимента. Зоны имплантации эндопротеза из полипропилена (а) и комбинированного эндопротеза (б). В обоих случаях с добавлением в кормовой рацион калия оротата. Окраска пикрофуксином красным. Ув. 400.

Применение калия оротата в 4-й группе животных в срок 90 сут (рис. 3, б) позволило значительно увеличить показатели плотности коллагеновых волокон (364,5±13,1 пикселя на 1 дюйм), соотношения типов коллагена (3,44) по сравнению с этими показателями в группах, в которых использовали эндопротез из полипропилена, и в группах животных, которым препарат в кормовой рацион не добавляли.

Изучение парапротезной капсулы на 7-е и 10-е сутки эксперимента при использовании калия оротата в 3-й и 4-й группах животных показало явное отсутствие различий в соотношении типов коллагена между собой, а также по сравнению с теми группами животных, в которых препарат не применяли. Вероятнее всего, отсутствие различий в соотношении типов коллагена было связано с воспалительной реакцией и сменой фаз воспаления (альтерации и экссудации) в эти сроки исследования, что свойственно нормальному ответу организма на травму и внедрение инородного тела (синтетического материала).

При сравнении результатов исследования соотношения типов коллагена в группах с использованием одного и того же эндопротеза, начиная с 30-х суток и в последующие сроки эксперимента, отмечались достоверно лучшие результаты в группах, в которых выполняли стимуляцию коллагеногенеза калия оротата. Помимо явного влияния этого препарата на синтез коллагена, полученные результаты могли быть обусловлены сменой фаз воспаления и наступлением фазы пролиферации в эти сроки (30 сут и далее).

Также в ходе нашего исследования, начиная с 30-х суток и до окончания эксперимента, было выявлено лучшее течение процесса коллагеногенеза и формирование соединительнотканной парапротезной капсулы при использовании комбинированного эндопротеза, чем в группе животных с эндопротезом из полипропилена. С учетом полученных результатов, вероятнее всего, произошла стимуляция коллагеногенеза полимолочной кислотой, покрывающей нити комбинированного эндопротеза.

Микроскопическая оценка препаратов на 90-е сутки эксперимента показала, что соединительнотканная капсула по плотности коллагеновых волокон, соотношению коллагена I и III типов достигает своего максимума в обеих группах. При анализе цветовой гистограммы выявлено преобладание красного цвета, свидетельствовавшее о доминировании коллагена I типа над III. Такое преобладание говорило о лучшей прочности парапротезной капсулы, что важно для предотвращения возникновения рецидива вентральной грыжи. Учитывая явное стимулирующее действие калия оротата на коллагеногенез и преобладание коллагена I типа, наблюдавшиеся в ходе эксперимента, можно рекомендовать применение калия оротата для профилактики возникновения рецидива грыжи брюшной стенки у пациентов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Оротат калия в бодибилдинге: как принимать, дозировка

Об оротате калия в бодибилдинге существует несколько противоречивых мнений. Одни сравнивают его анаболические качества с Милдронатом. Есть и те, кто считает оротат калия малоэффективным. В медицинских целях эту кислоту прописывают детям с дистрофией, принимают в период восстановления после перенесения инфаркта и для поддержки нормальной работы сердечной мышцы.

Как действует оротат калия на организм?

Данную кислоту чаще всего принимают в качестве восстанавливающего препарата. Действие средства носит индивидуальный неспецифический характер. Никаких научно обоснованных доказательств высокого анаболического эффекта оротата калия на сегодняшний день не существует. Единственным установленным фактом является то, что препарат улучшает синтез белка. Лучше всего качества кислоты проявляются в связке с адаптогенами, минералами, витаминами.

С какими препаратами принимают оротат калия в бодибилдинге?

Чтобы добиться определенного эффекта, культуристы сочетают оротат калия со следующими средствами:

с токоферолом ацетатом для повышения антиоксидантного воздействия;
с рибоксином в период «сушки», что позволяет поддерживать сердце во время перехода к интенсивным кардионагрузкам;
с витаминами группы B, чтобы оптимизировать метаболические процессы;
с аспаркамом для поддержания сердечной сократительной способности.

Препарат демонстрирует мочегонный эффект, но и способствует повышению аппетита. Это и является главной причиной того, что худеющим, решившим принимать оротат калия, не удается придерживаться строгой диеты, поскольку желание есть усиливается. Кислота не оказывает никакого воздействия на жировые отложения. Следовательно, информация о пользе препарата для похудения не может быть воспринята в буквальном смысле.

Как правильно принимать оротат калия

Нет никаких специальных курсов и прочих программ. Оротат калия употребляют либо натощак, то есть за час перед приемом пищи, либо спустя четыре часа после еды, а также перед сном. Общее количество таблеток в сутки составляет три штуки. Каждую пилюлю необходимо тщательно разжевывать, а затем запивать водой. Удобнее всего пить таблетки перед едой.

Основной причиной, по которой атлеты начинают употреблять данную кислоту, является переход на интенсивный режим тренировки, физические перегрузки, набор мышечной массы. Нередко оротат калия пьют те, кто меняет аэробную на интервальную нагрузку.

Возможные побочные явления

У оротата калия не было выявлено типичных побочных эффектов. Совместный прием с минеральными и витаминными комплексами в течение продолжительного времени может привести к высыпаниям на коже. В некоторых источниках можно обнаружить сведения о том, что употребление данной кислоты способно вызвать подагру. Этот факт не является подтвержденным, но людям с этой патологией от приема оротата калия лучше воздержаться.

Отзывы о применение оротата калия в бодибилдинге

Не отличаются однозначностью. Некоторые атлеты, употребляющие кислоту, отмечают весомый прирост объема мышц и силовых показателей, но принимают и прочие препараты, что не позволяет приписать получаемый эффект оротату. Есть атлеты, причисляющие этот препарат к категории анаболических стероидов, ожидая совершенно иного результата, который ему несвойственен.

Отзывов и мнений много. Одни недовольны оротатом калия, поскольку никакого эффекта не было получено, другие, наоборот, пишут о том, как эта кислота помогла повысить плотность мышечных тканей и способствовала улучшению выполнения жима лежа. Есть мнения и от худеющих, которым средство помогло разогнать скорость метаболизма.

Оротат калия в бодибилдинге: доказательство эффективности

Если для вас важна атлетическая эффективность тела, рекомендуем обратить внимание на Оротат Калия — еще один прорыв в области повышения производительности, которая в 2005 году штурмом захватила мир спортивного питания. Оротовая кислота является промежуточным звеном в пиримидиновом обмене и находится в высоких концентрациях в коровьем молоке.

Пиримидиновые нуклеотиды являются важными компонентами фосфолипидов (структурных компонентов) в клеточных мембранах, таких как сарколемма мышечной ткани. Эти нуклеотиды также являются важными компонентами РНК, строительных блоков новых мышечных и других клеточных тканей.

Оротат калия — вещество, которое относится к группе анаболитических препаратов. Он способствует росту мышц во время занятий в бодибилдинге. Его принимают:

для регенерации;
как анаболитическое средство;
при мышечной дистрофии;
во время тяжелых нагрузок;
в случаях, когда происходит усиленный синтез белка в организме.

Передача и синтез

Передача и синтез — два ключевых принципа для понимания механизмов производства энергии в мышцах. Ключевым источником энергии для наших тел является АТФ (аденозинтрифосфат), а его передача дает активность в мышцах. Только из энергии, выделяемой в результате разрушения этого соединения, клетки могут выполнять работу. Синтетические системы — это пути, в которых энергетическое действие АТФ или подобные выбросы энергии поддерживаются через соединения, помогающие в их регенерации.

Пример этого действия можно увидеть в мышечных тканях, где мы находим высокие скорости передачи АТФ, но скорости синтеза пуринов при этом низки. Хотя концентрация высокоэнергетических соединений, таких как АТФ, была низкой, местами был высокий перенос, скорости обратного синтеза были как раз противоположными. Прекрасным примером этого можно считать сердце (миокард) — урацил и цитозин (пиримидиновые основания) имеют обороты около 7 и 14% в час с аденин-нуклеотидами, такими как АТФ с оборотом всего 2%.

Увеличение мышечного спроса на АТФ снижает общий аденин-нуклеотид и общий пиримидиновый синтез там, где находятся метаболиты. Эти метаболические резервуары могут быть значительно уменьшены в результате ишемии миокарда или скелетных мышц (недостаточное снабжение кровью), некоторых метаболических заболеваний. Но наиболее важными они являются для спортсменов, пытающихся достичь следующего уровня при повторных упражнениях высокой интенсивности.

Синтез оротовой кислоты и карнозина

Влияние карнозина на контроль рН (кислотность в мышцах) и связанное с ним расширение высокоинтенсивных физических упражнений было хорошо изучено. Во время тренировки чрезмерное производство лактата является частью процесса крайней усталости. Однако, протоны, производимые в то же время, ограничивают дальнейшее действие. В результате исследовательской работы был определен четкий путь превращения оротата калия в β-аланин и карнозин в тканях скелетных мышц.

Активность вещества при физических нагрузках

В двух больших исследованиях было доказано реальное влияние добавок калия на способность к физической нагрузке и биохимические маркеры, на рост мышц (кортизол) и восстановление (лейкоциты).

Это говорит о том, что существует механизм для усиления производства силы после добавления оротата, а также многих других полезных эффектов. Это хорошая новость для всех пауэрлифтеров!

Итак, каковы могут быть его потенциальные применения и комбинации в качестве пищевой добавки?

Одно из возможных применений в сочетании с креатином является бесспорным чемпионом в спортивном питании. Креатин является жизненно важным компонентом для регенерации и поддержания АТФ во время интенсивных мышечных сокращений. Его влияние на повышение эффективности было показано в рецензируемых исследованиях.

Наиболее эффективными питательными веществами, которые хорошо работают с оротатом, является магний. Магний-минерал оказался в недостаточном количестве у человека, а увеличение потерь через пот и выработку мочи увеличивает частоту дефицита у тех, кто регулярно тренируется.

Основные механизмы оротовой кислоты, согласно инструкции

Усовершенствование и обслуживание бассейнов СПС
Увеличение потребления глюкозы.
Увеличенные рибозные фрагменты, что приводит к усилению образования рибозы.
Увеличенные емкости карнозина.
Поддержка и повышение гипертрофии мышц (через поддержку синтеза РНК во время роста).
Повышает уровень уридина в основании ДНК, что увеличивает мышечную сократительную способность.

Использование в бодибилдинге

Применение в бодибилдинге популярно из-за его непосредственного участия в синтезе белковых молекул. Спортсмены силовики пьют его с рибоксином, что увеличивает их уровень мощности и способствует росту мышечной массы. О его эффективности можно прочесть в большинстве отзывов.

Физиологические свойства препарата

ускорение метаболических процессов в организме;
улучшение аппетита;
мягкий мочегонный эффект;
используется в сочетании с препаратами, действующими на функцию сердца;
укрепляет сердечно-сосудистую систему;
стимулирует репаративные процессы;
увеличивает скорость восстановления мышц после интенсивных нагрузок мощности;
это облегчает работу печени.

Бодибилдеры сочетают оротат с другими БАДами, которые могут повысить его эффективность. В качестве дополнения к используемому препарату:

Рибоксин;
Различные витамины и минералы;
Рибофлавин;
Фолиевая кислота;
Пиридоксин и другие.

Эти комбинации позволяют получить более высокую производительность силовой тренировки.

В качестве вспомогательного вещества при похудении оротат калия доказал свою эффективность только при интенсивных физических нагрузках. Но необходимо учесть, что оротовая кислота способствует повышенному аппетиту. Судя по отзывам, оротат скорее мешает похудению, когда человек просто хочет скинуть пару килограмм, не прибегая к тренировкам.

Режим приема и дозировка

Принимать добавку необходимо, сочетая с другими необходимыми лекарствами: рибоксином, витаминно-минеральными комплексами, рибофлавином, фолиевой кислотой, пиридоксином и т. д. Это помогает повысить производительность и силу.

Согласно инструкции: одна таблетка оротата принимается за полчаса до еды или через четыре часа после приема пищи. Таблетку тщательно разжевывают и запивают небольшим количеством воды. Дозировка для спорта — принимать три, четыре или пять таблеток в день, деля их на три части, утром, днем и вечером. Курс длится один месяц, а при желании его можно повторить после двухмесячного перерыва.

В бодибилдинге оротат принимают точно так же, часто сочетая с рибоксином. Повторите курс, сосредоточив внимание на своем самочувствии и личных эффектах при наиболее интенсивной силовой тренировке. На индивидуальной основе после консультации с врачом доза увеличивается до шести таблеток в день, режим приема остается неизменным. В медицинской практике оротат хорошо переносится и не влечет за собой побочные эффекты. В редких случаях он вызывает аллергический дерматит, который проходит сразу после приема антигистаминов.

Противопоказания

Гиперчувствительность, острые и хронические органические поражения печени, включая цирроз печени с асцитом, нефроуролитиазом, почечной недостаточностью.

Беременность и кормление грудью . Согласно инструкции, не стоит принимать при беременности и грудном вскармливании, препарат может нанести вред плоду.

Побочные эффекты

Нестабильный стул, диарея;
Аллергические реакции (включая кожную сыпь, аллергический дерматит).
Применение в высоких дозах — гепатодистрофия (на фоне низкобелковой диеты ).

Препарат Калия оротат

ОТЗЫВЫ:

Отличный продукт! Много лет страдала лишним весом и отеками. У меня было два диетолога, которые рекомендовали оротат калия. После недельного курса, стала легче себя чувствовать. Поэтому я надеюсь, что он поможет моему телу справиться с лишними кг.

Виктория, 37

ОЧЕНЬ ПОЛЕЗНО У меня сердечное заболевание, которое нарушает баланс калия. Особенно порадовало, что пропали ночные судороги.

Даниил

Доктор рекомендовал

Мой врач рекомендовал принимать оротат калия для нерегулярного сердечного ритма. Кажется, помогает, и цена приятно удивила.

Владимир, 54

Оротат калия для набора веса

Как действует оротат калия на организм?

С какими препаратами принимают оротат калия в бодибилдинге?

Чтобы добиться определенного эффекта, культуристы сочетают оротат калия со следующими средствами:

с токоферолом ацетатом для повышения антиоксидантного воздействия;
с рибоксином в период «сушки», что позволяет поддерживать сердце во время перехода к интенсивным кардионагрузкам;
с витаминами группы B, чтобы оптимизировать метаболические процессы;
с аспаркамом для поддержания сердечной сократительной способности.

Как правильно принимать оротат калия

Возможные побочные явления

Отзывы о применение оротата калия в бодибилдинге

Для улучшения своей формы, некоторые спортсмены прибегают к использованию препаратов метаболического свойства. К таким фармацевтическим средствам можно отнести калия оротат. Он продаётся в аптеке и является безопасным негормональным анаболическим средством. Калия оротат в бодибилдинге и в спорте используется повсеместно, с целью стимуляции сердечной мышцы, набора мышечной массы, повышения иммунитета.

Для чего нужен оротат калия качкам

Если разобрать химический состав препарата, то фактически, он представляет из себя калиевую соль. Эта минеральная соль содержится в каждом живом организме и участвует в синтезе ДНК и РНК. Повышенные физические нагрузки предполагают усиленный рабочий режим сердечно-сосудистой системы, для чего нужен оротат калия качкам.

Оба составляющих элемента препарата (калий и оротат) присутствуют в организме человека и являются жизненно необходимыми. У спортсменов чаще, чем у других людей, возникает угроза дефицита калия, поэтому важно поддерживать его уровень в организме.

Доктор Nieper, после исследований оротата калия пришёл к выводу, что это соединение является эффективным восстанавливающим средством. Вот почему многие бодибилдеры используют его. В связи с тем, что качки часто устраивают организму сушку тела, используя диуретики, риск лишить сердце важных микроэлементов, в том числе калия, возрастает.

Показания к применению оротата калия

Главная задача препарата — лечение сердечно-сосудистой дисфункции. Однако, это средство довольно многопланово и применяется для лечения и поддержания не только сердца.

Болезни печени и желчного пузыря.
Инфаркт миокарда.
Дерматоз.
Алиментарная и алиментарно-инфекционная гипотрофии у детей.

Всё же, основные показания к применению этого препарата больше сводятся к функционалу сердечной мышцы.

Инфаркта миокарда.
Хронической сердечной недостаточности II и III стадии.
Экстрасистолии.
Мерцательной аритмии.
Регенерации мышечных тканей.

Спортсмены используют оротат калия в период набора мышечной массы, а также для восстановления после сверхтяжёлых нагрузок.

Инструкция по применению калия оротата

Аннотация к препарату рекомендует употреблять его в дозе, не превышающей 250-500 мг 2-3 раза в сутки, желательно, запивая большим количеством жидкости, за один час до еды. Однако, всё зависит от показаний, согласно которым доза может меняться.
Оротат калия можно применять даже детям, что лишний раз доказывает его относительную безопасность. Для большей эффективности, лучше совмещать препарат с витаминами, минералами, пиридоксином, фолиевой кислотой, рибоксином.
Курс применения составляет месяц, но может быть продлён в некоторых случаях.
Для усиления эффекта от оротата, его курс может быть повторён с перерывом 2-3 месяца.

Инструкция по применению утверждает, что наибольшая польза достигается именно при правильном применении, а также в комбинации с вышеупомянутыми дополнениями.

Как правильно принимать рибоксин и оротат калия

Рибоксин в бодибилдинге является не последним звеном, в алгоритме правильного поддержания организма во время усиленных физических нагрузок. Как правильно принимать рибоксин и оротат калия можно прочитать на самих упаковках препаратов или в авторитетных спортивных изданиях. Для начала, стоит рассмотреть причины, по которым рибоксин и оротат рекомендуется принимать в комбинации:

Улучшение работы сердечно-сосудистой системы.
Повышение аппетита.
Слабый диуретик.
Ускорение обмена веществ и других обменных процессов.
Регенерация мышечных тканей.
Улучшение работы печени.

По своим свойствам оба препарата схожи, но некоторые отличия делают целесообразным их совмещённое применение. Востребованность двух препаратов среди спортсменов с каждым годом растёт в связи с общедоступностью информации и отзывам тех, кто использует. Силовые показатели заметно растут, равно как и мышцы.

Употреблять комбинацию таблеток следует по две штуки за один приём. 3 раза в день.
Начинающие спортсмены могут дополнить этот курс приёмом гомеопатического средства — элеутерококка. Его природные свойства усиливают процессы метаболизма и придают организму энергетическую подпитку.

Отзывы спортсменов о препарате

Культуристы, тяжелоатлеты и спортсмены других направлений улучшают свои показатели за счёт приёма вспомогательных препаратов, к которым относится Калия оротат (латинское название Potassium orotate) и рибоксин. Используя свой организм на полную катушку, это реальный шанс сократить время для восстановления. Не зря применяют спортсмены эти препараты по всему миру в разных видах силового спорта.

Читая отзывы профессиональных спортсменов об оротате калия, можно сделать однозначный вывод по поводу пользы и положительного влияния препарата на способности организма и его самочувствие, после серьёзных нагрузок. К примеру, большую роль спортсмены отдают этому лекарству в вопросах исполнения некоторых упражнений, таких как жим лёжа. Отмечают, что их выполнение стало легче, а плотность мышечных тканей заметно улучшилась.

Существуют мнения тех, кто пытается скинуть лишние килограммы. После применения препарата, они заметили улучшение метаболизма, которое привело к снижению веса.

Аналоги калия оротата

Оротат калия производится российскими специалистами и не является дорогим препаратом. Несмотря на это, существуют и более дешевые аналоги, такие как: Гепатосан (Россия), Дипана (Индия), Карсил Форте (Болгария), Легалон 140 (Германия), Гепафор (Россия), Силимар (Россия), Гепа-Мерц (Германия). Эти препараты, также, как и сам Оротат калия, в свободном доступе можно приобрести в аптеке. Для этого не нужен рецепт от врача, поскольку побочные эффекты практически не наблюдаются.

Для хорошего самочувствия и результативных физических нагрузок придумано множество препаратов. Среди них, особой эффективностью отмечен калия оротат, который, в связке с рибоксином, приводит к высоким спортивным показателям и поддержанию здоровья органов.

Видео: калия оротат для роста мышц

Таблетки для набора веса у мужчин и женщин могут понадобиться в тех случаях, когда увеличить массу тела с помощью диеты и упражнений не получается. Начинать использование препаратов следует с добавок, не имеющих существенных побочных эффектов: витаминно-минеральных комплексов, различных китайских пилюль растительного происхождения, спортивного питания, пивных дрожжей и БАДов, помогающих восполнить дефицит питательных веществ в организме. Большего эффекта можно добиться с помощью лекарств, стимулирующих метаболические процессы: калия оротата и кальция глицерофосфата. В самых тяжелых случаях разрешается применять гормональные и психотропные медикаменты: тестостерон, инсулин, бензодиазепины и другие. Эти препараты используются в профессиональном бодибилдинге и под контролем врача, самостоятельно назначать их себе запрещено.

Недостаток массы тела зачастую обусловлен нарушениями процессов пищеварения и обмена веществ. Вызвать сбои метаболизма способен дефицит витаминов, макро- и микроэлементов.

Для того чтобы поправиться, в первую очередь, необходимо обеспечить организм:

Витаминами Е и С. Они обладают антиоксидантными свойствами, снижают количество свободных радикалов, улучшая защитные механизмы клеток и тканей. Продуктами, содержащими много витамина С, являются шиповник, черная смородина, клубника, апельсины. Витамина Е больше всего в растительных маслах, орехах, семечках и морепродуктах.
Витаминами группы В. Они содержатся практически во всей растительной пище, не прошедшей термическую и химическую обработку. Существенное количество витаминов имеют в своем составе молоко, яйца, пивные дрожжи. Их дефицит приводит к нарушениям в организме: замедляется обмен веществ, ухудшается усвоение пищи, угнетается синтез белка, нарушается липидный метаболизм.
Витамином А. Контролирует скорость обмена веществ, воздействуя на катаболические и анаболические гормоны: тиреоидные, тестостерон, соматропин, инсулин. Достаточное количество витамина А необходимо для роста мышечной ткани, формирования костей и суставов. Лучшими источниками являются рыба и другие морепродукты, мясо, яйца, печень, курица.

Для нормального функционирования организма также необходим достаточный объем таких макро- и микроэлементов, как магний, калий, фосфор, медь, цинк, кальций, железо.

В ситуации, когда получить их с пищей не представляется возможным, целесообразно использовать витаминно-минеральные комплексы: Компливит, Алфавит, Супрадин, Витрум, Пиковит, Центрум.

Биологически активная добавка к пище стимулирует аппетит и улучшает усвоение питательных веществ из пищи. За эти свойства отвечают витамины группы В и аминокислоты, содержащиеся в пивных дрожжах в большом объеме.

Энергетическая ценность продукта – 75 килокалорий на 100 грамм.

В зависимости от формы выпуска добавка может быть сырой или автолизированной. Первый вариант используется для набора массы нечасто, так как такие дрожжи противопоказаны людям, имеющим проблемы с желудочно-кишечным трактом. Также они способны вызывать аллергические реакции и кандидоз.

Автолизат не активизирует процессы брожения в кишечнике, а все полезные вещества содержатся в легкоусвояемом виде.

Добавку следует принимать согласно инструкции. Автолизат в виде порошка употребляют по 1-3 грамма 2-3 раза в сутки. Перед применением вещество необходимо размешать с водой. Таблетки пьют по 3-5 штук трижды в день.

В ситуациях, когда низкая масса тела связана с отсутствием возможности регулярно получать все необходимые питательные вещества из пищи, на помощь могут прийти различные биологически активные добавки. Как правило, они имеют натуральный состав, а приобрести их в аптеке можно без рецепта.

Наибольшую популярность имеют китайские БАДы, содержащие вытяжки и экстракты растений.

По заверениям производителей, добавка Samyun Wan позволяет набрать до 8 кг в течение 4 недель. Данный эффект обусловлен способностью БАДа увеличивать скорость обмена веществ, повышать усвояемость пищи, улучшать настроение.

За эти свойства отвечают:

экстракт плодов японской айвы;
экстракт корня женьшеня;
экстракт корня атрактилодеса большеголового;
вытяжка из рогов оленя.

Samyun Wan принимают один раз в день по одной капсуле во время еды. Продолжительность приема составляет около 3-4 недель.

Во время использования БАДа возможен такой побочный эффект, как сонливость. Добавку не рекомендуется принимать детям до 8 лет и женщинам в период беременности.

Нутризон представляет собой заменитель пищи для людей, у которых существуют проблемы с потреблением нормальной еды.

В зависимости от состава выпускается два вида добавки:

1. Нутризон. Может использоваться как полноценный заменитель пищи или как дополнительный источник энергии. Энергетическая ценность 100 мл смеси Нутризон – 100 ккал. Соотношение БЖУ: белки – 4 г, жиры – 3,9 г, углеводы – 12,3 г.
2. Нутризон энергия. Добавка имеет высокую калорийность (150 ккал на 100 мг смеси) и большое содержание протеина (6 г на 100 мл смеси).

Оба вида также выпускаются с пищевыми волокнами.

Добавку можно потреблять взрослым и детям после 1 года. Побочных эффектов при приеме Нутризона не наблюдается.

Самый действенный класс лекарств для набора массы тела представлен анаболическими гормональными препаратами.

Наиболее эффективные из них представлены в таблице:

Название препарата	Действие, побочные эффекты и противопоказания	Фото
Дюфастон	Действующим веществом препарата является дидрогестерон – гормон, проявляющий прогестагенные свойства: увеличивает синтез белка, провоцирует задержку жидкости в организме, повышает аппетит. Прием лекарства может сопровождаться головной болью, нарушением функции печени, кожным зудом, отечностью. Препарат не следует принимать при заболеваниях печени и сердца
Джинтропин	Лекарство содержит гормон роста человека – соматропин. Препарат способствует росту мышечной массы без набора жира и воды. Большой прибавки веса от Джинтропина ожидать не стоит: всего 2-4 кг в месяц. Прием гормона может сопровождаться повышением сахара крови, увеличением внутренних органов, задержкой воды. Лекарство не следует принимать для увеличения веса у худых детей. Это способно привести к преждевременному закрытию зон роста. От употребления Джинтропина необходимо отказаться мужчинам и женщинам, имеющим наследственную предрасположенность к онкологическим заболеваниям
Метандростенолон

Один из самых старых и проверенных гормонов для быстрого набора веса. Таблетки позволяют эффективно увеличивать вес тела как молодым девушкам, так и взрослым мужчинам. В среднем, месячная прибавка массы составляет от 5 до 8 кг. При этом набор происходит как за счет мышечной гипертрофии, так и в результате задержки жидкости в организме.

Наиболее существенными побочными эффектами являются:

гинекомастия;
угревая сыпь;
скачки давления;
увеличение печени и желтуха.

Препарат противопоказан при заболеваниях печени, гинекомастии, раке простаты и грудной железы

Росинсулин В ситуации, когда необходимо быстро набрать 8-10 или даже 12 кг, инсулин является препаратом выбора. Лекарство существенно повышает аппетит и скорость обмена веществ, что позволяет ежедневно потреблять большое количество пищи. При соблюдении дозировки существенные побочные эффекты отсутствуют. Иногда возможны аллергические реакции. Главная опасность, которую представляет собой инсулин, – это риск гипогликемической комы и летального исхода в результате передозировки Оксандролон Анаболический стероид, позволяющий набрать качественную мышечную массу без жира. Быстрой прибавки веса, как от Инсулина или Метандростенолона, Оксандролон не даст, однако большая часть набранного за курс приема препарата останется и после его отмены. Лекарство обладает меньшим количеством побочных эффектов по сравнению с другими анаболическими стероидами.

Наиболее опасным из них является прекращение выработки тестостерона и, как следствие, атрофия яичек у мужчин. Оксандролон противопоказан при онкологических заболеваниях, патологиях печени

Гормональные препараты являются самыми эффективными и самыми опасными средствами быстрого повышения массы тела. Схема приема и дозировки лекарств должны устанавливаться только врачом. Самолечение недопустимо.

Лекарства данного класса содержат гормон этинилэстрадиол – синтетический аналог эстрадиола – вещества, обладающего мощным анаболическим действием. Во время приема препаратов улучшается аппетит и настроение, повышается работоспособность, происходит задержка жидкости в организме.

Для того чтобы выбрать самые эффективные противозачаточные таблетки для набора веса, необходимо обращать внимание на содержание в них этинилэстрадиола. Большего всего данного вещества содержится в следующих препаратах:

Следует иметь в виду, что побочным эффектом в виде увеличения массы тела обладают препараты, которые начали выпускаться 15-20 лет назад. Современные противозачаточные таблетки лишены такого свойства.

Препарат проявляет анаболические свойства, не являясь стероидом. Во время приема калия оротата в организме происходит повышение скорости синтеза белка, усиливаются процессы заживления ран и сращивания костей, улучшается аппетит и пищеварение.

По своей эффективности калия оротат нельзя сравнивать с инсулином или синтетическим тестостероном, однако данные таблетки не обладают опасными побочными эффектами. Наиболее распространенными из них являются нарушение функции печени, задержка воды в организме.

повышенная чувствительность к компонентам;
заболевания печени;
нарушение функции почек;
непереносимость лактозы.

Не следует применять калия оротат и детям в возрасте до 3 лет.

Таблетки обладают умеренным анаболическим действием. Их применение оправдано в тех ситуациях, когда дефицит массы тела связан с переутомлением, нервным истощением.

Лекарство выпускается в двух формах: гранулах для приготовления суспензии для приема внутрь и таблетках.

Противопоказаниями к использованию кальция глицерофосфата являются индивидуальная непереносимость компонентов, возраст до 2 лет, тромбоз, гиперкальциемия, тромбофлебит. Побочные действия проявляются чаще всего аллергическими реакциями.

Устанавливать схему приема и дозировку препарата должен лечащий врач.

Препараты данного класса обладают седативным и снотворным действием, помогают справиться с чувством тревожности, судорогами, эпилептическими припадками.

Наиболее популярными лекарствами, содержащими бензодиазепин и применяемыми для набора веса, являются феназепам, диазепам, бромазепам.

Борясь с бессонницей и снимая психоэмоциональное напряжение, они помогают нормализовать аппетит и пищеварение, способствуя прибавке в весе.

При длительном использовании лекарства данного класса могут приводить к возникновению психологической и физической зависимости. Другими существенными побочными эффектами являются угнетение дыхания и обострение некоторых психических заболеваний.

Не следует применять бензодиазепины людям с расстройствами личности и умственной отсталостью, одновременно с алкоголем, наркотическими средствами.

Для взрослых мужчин самым действенным способом быстрого набора веса является прием синтетических аналогов тестостерона и инсулина. По соотношению цены, безопасности и эффективности данные препараты являются лучшими. Использование БАДов, калия оротата и кальция глицерофосфата будет оправдано, если повышать массу тела необходимо медленно, не более чем на 3-4 кг за месяц.

Для худых женщин лучшими средствами быстрого набора веса являются противозачаточные таблетки и инсулин. Молодым девушкам после 20 лет имеет смысл обратить внимание на гормон роста. Препарат позволит им набрать качественную массу без жира.

Для того чтобы поправиться худым детям, эффективнее и безопаснее всего использовать натуральные препараты: витамины и минералы, Нутризон и другие добавки растительного и животного происхождения. В некоторых ситуациях может быть целесообразным употребление кальция глицерофосфата. Применение сильнодействующих гормональных и психотропных препаратов детьми допускается только в экстренных случаях, когда низкая масса тела угрожает их жизни.

Метаборат калия — современная альтернатива борной кислоте — Ботаничка.ru

Название удобрения «Метаборат калия» большинству дачников пока ни о чем не говорит. При этом все мы слышали (да, что там «слышали» — пользуемся регулярно) о борной кислоте. При всех недостатках приготовления раствора борная кислота очень полезна для наших растений. А теперь представьте себе, что на рынке появилось удобрение, которое имеет все те же преимущества (и много других), но полностью лишено недостатков борной кислоты. В чём уникальность метабората калия, расскажем в рубрике «вопрос-ответ» от компании «Буйские удобрения».

Метаборат калия — современная альтернатива борной кислоте

Вопрос: что это за удобрение и когда его надо применять?

На этот вопрос ответит начальник агрохимслужбы ОАО “Буйский химический завод” Белозёров Дмитрий Александрович.

Ответ: метаборат калия – это водорастворимое борное удобрение. Эффективен для бобовых, овощных и плодово-ягодных культур.

Метаборат калия

Бор – необходимый для растений микроэлемент. Наиболее распространенное борсодержащее удобрение – борная кислота.

Многие садоводы этим удобрением пользуются, но многие испытывают при этом трудности, связанные с растворением. Борная кислота плохо растворяется.

Метаборат калия – это современное новое борсодержащее удобрение. В состав его входит бор и калий, но по дозам внесения мы ориентируемся на бор.

Удобрение, в отличие от борной кислоты, очень хорошо растворяется и в холодной воде.

Для сравнения: борной кислоты при температуре 20^°С в 100 мл воды растворяется 5 г, а метабората калия при той же температуре в 100 мл воды растворяется 70 г.

Бор, как элемент, необходим для растений:

при прорастании пыльцевых зерен,
при росте пыльцевой трубки,
при делении клетки,
при формировании семян и оболочки клетки,
при синтезе белка,
при переносе сахаров.

Метаборат калия избавит ваши растения от хлороза

Применять борсодержащие удобрения необходимо в период бутонизации и цветения культур, а так же в период формирования урожая. Некорневые подкормки или полив рекомендуется совмещать со средствами защиты растений или другими видами удобрений (комплексами).

Недостаток бора проявляется сильнее всего на щелочных (карбонатных) почвах либо при поливе водой из скважин с рН выше 7,0 и содержащей большое количество карбонатов (бикарбонатов).

Смотрите наше видео о том как вырастить томат и перец в домашних условиях, а также в нём мы расскажем о таком важном препарате для подкормки растений и оздоровления почвы как метаборат калия — высокоэффективная замена борной кислоты.

Арарат Балларат Калийная сетка геодезическая

Всплывающее окно расширенного поиска позволяет создавать / уточнять сложные запросы в одном всплывающем окне с вкладками. Из расширенного поиска вы можете создавать логические поисковые запросы и применять к поиску одну или несколько категорий фильтров.

Обратите внимание, что нет определенного порядка вкладок в расширенном поиске, и вы можете применять фильтры в любом порядке по вашему выбору. Если есть несколько вариантов для категории фильтра, например (Субъекты) отображаемые параметры и количество записей основаны на вашем запросе.Каждый раз, когда вы переключаете вкладки, доступные параметры фильтра и счетчики записей обновляются, чтобы отразить любые изменения на предыдущей вкладке.

Просмотр расширенного поиска

По мере создания / уточнения поиска во всплывающем окне расширенного поиска вы можете просмотреть весь поиск и количество результатов, которые будут возвращены, выбрав вкладку «Обзор». Вкладка также позволяет вам изменять поиск, удаляя фильтры.

Конструктор запросов поисковых запросов

Конструктор запросов предоставляет способ поиска записей с использованием нескольких комбинаций поисковых терминов и логических операторов.

Строки запроса

Расширенные запросы, созданные с помощью конструктора запросов, состоят из строк. Каждая строка состоит из поля, оператора условия и значения. Значение указывает поиску, что искать, Поле указывает поиску, где искать, а Оператор условия сообщает поиску, должна ли запись «содержать» или «исключать» значение.

Несколько условий поиска, введенных в одно значение условия, рассматриваются поиском как разделенные логическим оператором AND.
Условия поиска обрабатываются как нечувствительные к регистру. «Дождь» — это то же самое, что «дождь».
Точные фразы можно также ввести в Значения Условий, используя кавычки «» Например. «ледяные щиты»
The? Символ может использоваться для поиска по подстановочному знаку, состоящему из одного символа. Например. Организации.
Символ * может использоваться для поиска по нескольким символам с подстановочными знаками. Например. Продлить *

Примечание. Подстановочные знаки можно применять к отдельным условиям поиска, но не к фразам.

Логические операторы

Конструктор запросов поддерживает использование логических операторов «И» и «ИЛИ» между строками запроса. Операторы применяются на уровне поиска, то есть все строки запроса разделяются одним и тем же логическим значением. Изменение логического значения между двумя строками запроса изменит значение между всеми строками запроса.

Пример — построение расширенного запроса

Здесь мы шаг за шагом построим расширенный запрос, в котором мы хотели бы найти все записи, которые содержат «дождь» в заголовке и «наводнение» и «погода» в описании.

Убедитесь, что вы начали новый поиск, удалив все предыдущие поиски.
Откройте всплывающее окно расширенного поиска и убедитесь, что вы находитесь на вкладке «Поисковые запросы». По умолчанию должны отображаться две строки запроса.
В раскрывающемся списке «Поле» в 1-й строке запроса выберите «Заголовок».
В пустом поле значения в 1-й строке запроса введите поисковый запрос «Дождь».
В раскрывающемся списке «Поле» во 2-й строке запроса выберите «Описание».
В пустом поле значения во 2-й строке запроса введите поисковый запрос «наводнение».
Нажмите кнопку «Добавить строку», чтобы добавить третью строку запроса.
В раскрывающемся списке «Поле» в третьей строке запроса выберите «Описание».
В пустом поле значения в третьей строке запроса введите поисковый запрос «погода».
Нажмите кнопку «Поиск», чтобы выполнить поиск.

Тематический фильтр

Вкладка «Тема» позволяет уточнить поиск, выбрав темы, которые использовались для описания записей данных. Тематический словарь по умолчанию в Research Data Australia, который постоянно используется поставщиками данных, — это ANZSRC Field of Research.Также доступны другие поддерживаемые тематические словари, которые можно выбрать с помощью раскрывающегося списка, отображаемого в верхней части вкладки (обратите внимание, что для их загрузки может потребоваться некоторое время).

Тематические словари отображаются в виде иерархических деревьев с возможностью просмотра. Литералы темы, отображаемые в виде зеленых ссылок, можно щелкнуть, чтобы отобразить или скрыть дочерние темы.

Предметы могут быть добавлены или удалены из вашего поиска с помощью флажка, отображаемого рядом с каждым литералом темы. Можно выбрать несколько предметов в рамках одного предметного словаря, а также из разных словарей.

Количество записей с темой будет отображаться в конце каждого предметного литерала, например, «Экономика (30)». Обратите внимание, что, поскольку отношения между записями и субъектами могут быть много-много, подсчет, отображаемый с предметами, не обязательно будет соответствовать количеству записей, возвращаемых вашим поиском. Например, вы можете увидеть 3 объекта со знаком (1) рядом с ними. Это может разрешить одну запись, содержащую всех трех субъектов. Если записей с предметным значением не существует, с литералом будет отображаться (0).

Фильтр поставщика данных

Вкладка «Поставщик данных» позволяет ограничить поиск записями, опубликованными в Research Data Australia конкретными поставщиками. Количество записей, доступных от поставщиков, будет отображаться в конце каждого литерала поставщика, например «Университет Бонда (25)».

Поставщики данных могут быть добавлены или удалены из поиска с помощью флажка, отображаемого с каждым литералом поставщика данных.

Фильтр доступа

Вкладка «Доступ» позволяет ограничить поиск записями с определенными типами доступа.Записи данных в Research Data Australia делятся на один из четырех типов доступа:

Открыть: Легкодоступные и повторно используемые данные.
Условный: Доступные и повторно используемые данные при соблюдении определенных условий (например, требуется бесплатная регистрация)
Ограничено: Доступ к данным каким-то образом ограничен (например, доступен только определенной группе пользователей или в определенном физическом месте)
Другое: <нет значения> или <пользовательское настраиваемое значение>

Количество записей, доступных для каждого типа доступа, будет отображаться в конце литерала доступа E. g «Открытый (23)».

Типы доступа могут быть добавлены или удалены из поиска с помощью флажка, отображаемого с каждым литералом доступа.

Лицензионный фильтр

Группа фильтров лицензий	Включены типы лицензий
Открытая лицензия : Лицензия с широкими разрешениями, которые могут включать требование указывать источник или одинаковый общий ресурс (или и то, и другое), требующее производная работа подлежит лицензированию на тех же или аналогичных условиях, что и повторно используемый материал.	CC-BY CC-BY-SA PL
Некоммерческая лицензия : Что касается Открытой лицензии, но также ограничение повторного использования только в некоммерческих целях.	CC-BY-NC CC BY-NC-SA
Непроизводная лицензия : Что касается Открытой лицензии, но также запрещает адаптацию материала, и во втором случае также ограничивается повторное использование только в некоммерческих целях.	CC BY-ND CC-BY-NC-ND
Ограниченная лицензия : Лицензия, запрещающая повторное использование материала, если не установлены определенные ограничительные условия выполнены. Обратите внимание на лицензионные ограничения и права на контакты обладатель разрешений, выходящих за рамки условий лицензии.	AusGOAL
Без лицензии : Все права на повторное использование, передачу, публикацию или воспроизведение материала являются защищены, за исключением конкретных прав, содержащихся в Закон об авторском праве 1968 года или аналогичные законы.Свяжитесь с правообладателем для разрешение на повторное использование этого материала.	Нет лицензии
Прочие	<нет значения> или <пользовательская настройка значение>

Количество записей, доступных в каждой группе фильтров лицензий, будет отображаться в конце буквенного обозначения лицензии, например, «Нет лицензии (57)».

Лицензионные группы могут быть добавлены или удалены из поиска с помощью флажка, отображаемого рядом с каждым лицензионным литералом.

Фильтр периода времени

Вкладка «Период времени» позволяет ограничить поиск только записями, которые содержат информацию о временном охвате *, попадающую в определенный годовой диапазон. Фильтр реализован в виде пары текстовых полей, позволяющих ввести «С года».
и «Год». Текст-заполнитель, отображаемый в текстовых полях, указывает доступный временной диапазон, в котором вы можете выполнять поиск.

Чтобы отфильтровать результаты по периоду времени:
Откройте всплывающее окно расширенного поиска и убедитесь, что вы находитесь на вкладке «Период времени».Введите диапазон периода времени с помощью полей From Year и To Year.
Нажмите кнопку «Поиск», чтобы выполнить поиск.

* Временное покрытие = период времени, в течение которого были собраны данные или проводились наблюдения

Примечание: если записи в вашем поиске не содержат временной информации, на вкладке будет отображаться следующее сообщение:
«Результаты поиска не содержат информации о периоде времени».

Фильтр местоположения

Вкладка «Местоположение» позволит вам отфильтровать результаты поиска только по записям, в которых описана сопоставимая информация о местоположении, которая попадает в указанный регион.

Чтобы нарисовать регион на карте:

Откройте всплывающее окно расширенного поиска и убедитесь, что вы находитесь на вкладке «Местоположение».
Используйте инструменты навигации по карте в левой части карты, пока не получите требуемый вид карты.
Выберите инструмент «Коробка» ().
Щелкните карту и перетащите мышь, чтобы нарисовать прямоугольник.
Отпустите кнопку мыши, чтобы закончить. Если есть записи с информацией о местоположении, доступной для вашего выбора, для первых 15 записей будет отображаться красный маркер.
Нажмите кнопку «Поиск», чтобы выполнить поиск.

Примечание. Чтобы изменить или перерисовать область, просто выполните указанные выше действия еще раз.

Калиевые каналы

Kv2 образуют соединения эндоплазматического ретикулума / плазматической мембраны посредством взаимодействия с VAPA и VAPB

Значимость

Помимо функционирования в качестве канала замедленного выпрямления K ⁺, Kv2.1 взаимодействует с кортикальным эндоплазматическим ретикулумом (ER) в нейроны гиппокампа с образованием соматических соединений ER / плазматической мембраны (ER / PM).Активность нейронов и инсульт вызывают высвобождение Kv2.1 из кортикального ER и последующее удаление ER из PM. Нейрональные контакты ER / PM составляют> 10% поверхности клетки и играют роль в мембранном переносе, регуляции импульсного возбуждения, гомеостазе Ca ²⁺ и контроле липидов PM. Мы сообщаем здесь, что взаимодействие канала Kv2 с VAMP-ассоциированным белком (VAP) связывает кортикальный ER с PM через неканонический мотив FFAT, содержащийся в C-конце канала. Поскольку VAPs обладают широким диапазоном взаимодействий, Kv2-индуцированное ремоделирование ER и концентрация VAP в контактах ER / PM, вероятно, играют центральную роль в физиологии нейронов.

Abstract

Kv2.1 демонстрирует две различные формы паттернов локализации на плазматической мембране нейронов: одна популяция является свободно диффузионной и регулирует электрическую активность через зависящую от напряжения проводимость K ⁺, а вторая локализуется в кластерах микрометрового размера, которые содержат плотно упакованные, но непроводящие каналы. Мы ранее установили, что эти кластеры представляют соединения эндоплазматического ретикулума / плазматической мембраны (ER / PM), которые функционируют как концентраторы мембранного переноса, и что Kv2.1 играет структурную роль в формировании этих участков контакта с мембраной как в первичных культурах нейронов, так и в трансфицированных клетках HEK. Кластеризация и образование контактов ER / PM регулируются фосфорилированием в пределах C-конца канала, предлагая клеткам быстрый динамический контроль над физическими взаимоотношениями между кортикальными ER и PM. Настоящее исследование обращается к механизмам, с помощью которых Kv2.1 и связанный с ним канал Kv2.2 взаимодействуют с мембраной ER. Используя методы биотинилирования на основе близости в трансфицированных клетках HEK, мы идентифицировали ER VAMP-ассоциированные белки (VAP) как потенциальные Kv2.1 интеракторы. Для подтверждения того, что Kv2.1 и -2.2 связывают VAPA и VAPB, использовались анализы на основе колокализации / перераспределения, нокдауна siRNA и резонансного переноса энергии Ферстера (FRET). Химеры CD4, содержащие последовательность от С-конца Kv2.1, использовали для идентификации неканонического VAP-связывающего мотива. Впервые VAP были идентифицированы как белки, необходимые для высвобождения нейротрансмиттеров в Aplysia , и теперь известно, что они являются многочисленными каркасными белками, участвующими в формировании сайтов контакта с мембраной по всему ER.Интерактом VAP включает AKAP, киназы, механизмы мембранного переноса и белки, регулирующие транспорт невезикулярных липидов от ER к PM. Следовательно, Kv2-индуцированная концентрация VAP в местах контакта ER / PM, по прогнозам, будет иметь широкое влияние на биологию нейрональных клеток.

Kv2.1 и Kv2.2 представляют собой многочисленные потенциал-управляемые каналы K ⁺ в головном мозге млекопитающих. Kv2.1 является преобладающим каналом в гиппокампе, в то время как оба канала по-разному экспрессируются в коре головного мозга (1).Оба канала локализуются в кластерах микрометрового размера на нейрональной поверхности сомы, проксимальных дендритах и начальном сегменте аксона (AIS) in vivo и in vitro (2). Кластерные каналы Kv2.1 рассеиваются в ответ на ишемические или гипоксические условия, нейрональную активность и индуцированную глутаматом эксайтотоксичность посредством кальциневрин-зависимого дефосфорилирования С-конца канала (3, 4). Хотя кластеризация Kv2.1 была впервые предложена для регулирования зависимости напряжения канала (5), несколько исследований указывают на слабую связь между кластеризацией каналов и регулированием проводимости (6-8).Фактически, наши данные свидетельствуют о том, что популяция свободно диффузионных каналов обеспечивает зависящую от напряжения проводимость K ⁺, которая регулирует электрическую активность нейронов, в то время как сгруппированные каналы являются непроводящими и имеют другие функции. Ранее мы сообщали, что кластеры представляют собой центры трафика, в которых локализованы вставка и извлечение мембранного белка на поверхности клетки (9). Эти данные согласуются с результатами Lotan и соавторов (10), которые указывают на одну непроводящую функцию Kv2.1 заключается в усилении высвобождения плотных сердцевинных пузырьков из нейроэндокринных клеток. Недавние исследования также показывают, что кластеры Kv2.1 регулируют экзоцитоз инсулина из бета-клеток поджелудочной железы (11, 12). Взятые вместе, эти исследования убедительно подтверждают, что кластеризация Kv2.1 играет структурную роль, связанную с клеточной биологией на поверхности нейронов. Действительно, мы недавно определили, что кластерный паттерн локализации обусловлен взаимодействием Kv2.1 с кортикальным эндоплазматическим ретикулумом (ER) и индукцией стабильных участков контакта ER / плазматической мембраны (ER / PM) (13).В нейронах гиппокампа крыс это ремоделирование кортикального ER регулируется активностью, поскольку обработка глутаматом индуцирует декластеризацию Kv2.1, за которой вскоре следует ретракция кортикального ER с поверхности клетки (13). Хотя контакты ER / PM лучше всего поняты из-за их роли в поступлении кальция в хранилище и переносе невезикулярных липидов из ER на поверхность клетки (14), дополнительные исследования показывают, что эти микродомены регулируют нейрональную вспышку (15) и уровни PIP2 в плазматической мембране ( 16). Кроме того, недавнее исследование, проведенное Hess и соавторами (17), показывает, что сайты контакта нейронов с ER / PM составляют ~ 12% соматической поверхности in vivo.Учитывая обилие и функциональное значение контактов нейронов ER / PM, а также вероятность того, что на процессы в этих доменах влияет взаимодействие Kv2.1-ER, чрезвычайно важно понять механизмы, лежащие в основе зависимого от активности взаимодействия между каналами Kv2 и корковый ER.

Наша настоящая работа демонстрирует, что каналы Kv2 взаимодействуют с VAMP-ассоциированными белками (VAP), встроенными в мембрану ER. VAP были впервые обнаружены у Aplysia , где они необходимы для быстрого высвобождения нейромедиаторов (18).В настоящее время известно, что VAP являются повсеместными каркасными белками ER с большим и постоянно растущим списком взаимодействующих, включая AKAP, протеинкиназы, Rab и белки-переносчики липидов (19, 20). Интересно, что замены одной аминокислоты в VAP-B вызывают позднюю мышечную атрофию позвоночника и боковой амиотрофический склероз (БАС) типа 8 (21, 22), что интригует, учитывая, что кластеризация Kv2.1 над кортикальным ER также существует в альфа-диапазоне. мотонейроны (23). И кластеризация каналов Kv2, и индукция соединений ER / PM происходит через неканонический мотив связывания VAP, содержащийся в С-конце канала Kv2.Этот связывающий мотив содержит сайты фосфорилирования, которые, как известно, регулируют кластеризацию Kv2 и ремоделирование кортикального ER. Баланс фосфорилирования / дефосфорилирования в этих сайтах, вероятно, управляет сродством к VAPs, таким образом объясняя зависимость от фосфорилирования взаимодействия Kv2-ER. Так как каналы Kv2 концентрируют VAPs в месте контакта ER / PM, взаимодействие Kv2-VAP, обобщенное в настоящей работе, вероятно, будет иметь большое влияние на физиологию нейронов.

Результаты

Идентификация VAP как предполагаемого партнера по связыванию Kv2 ER.

Предыдущие исследования, в которых применялась аффинная очистка Kv2.1 на основе антител либо из трансфицированных клеток HEK, либо из мозга крысы, выделяли белок канала, свободный от каких-либо избыточных взаимодействующих белков (24). Этот результат не является неожиданным, поскольку большая часть Kv2.1 нерастворима в неионогенных детергентах, используемых для аффинной очистки (24⇓ – 26), и макромолекулярные комплексы, содержащие Kv2.1, вероятно, будут находиться в этой нерастворимой в детергенте фракции. Действительно, при визуализации кластеров GFP-Kv2.1 в трансфицированных клетках HEK во время нанесения 1% TX-100 при 37 ° C, в условиях, которые солюбилизируют предполагаемые структуры липидного рафта (27), кластеры оставались неповрежденными, поскольку остальная часть мембраны оставалась неизменной. солюбилизированный.Поскольку попытки биохимической очистки этих нерастворимых в детергенте микродоменов с использованием различных процедур фракционирования оказались безуспешными, мы использовали методы биотинилирования APEX (28) в трансфицированных клетках HEK для идентификации предполагаемых Kv2.1-взаимодействующих резидентных белков ER, ответственных за образование Переходы ER / PM. APEX в присутствии биотин-фенолов и перекиси водорода генерирует свободно диффундирующие, но короткоживущие радикалы биотина, которые неразборчиво биотинилируют близлежащие белки.Чтобы максимизировать биотинилирование соседних белков, в отличие от самого Kv2.1, APEX был присоединен к цитозольному концу бета-субъединицы Kv2.1 AMIGO, как показано на рис. 1 A . С-концевая последовательность Kv2.1, о которой известно, что она участвует в кластеризации и фенотипе связывания ER, обозначена ранее описанными точечными мутациями, которые отменяют кластеризацию сомы и взаимодействие ER, выделенными черным цветом (29). AMIGO, единственная молекула трансмембранной клеточной адгезии, ассоциируется с кластером Kv2.1 каналы при коэкспрессии (30, 31). Важно отметить, что в наших клетках HEK AMIGO на PM не кластеризуется и не связывается с кортикальным ER, когда экспрессируется отдельно. Как показано на фиг. 1 B , совместная экспрессия CFP-Kv2.1 и AMIGO-YFP-APEX индуцировала биотинилирование белка вблизи кластеров Kv2.1, на что указывает связывание стрептавидина, конъюгированного с CF640R. Связывание стрептавидина было наиболее заметным в кластерах поверхности клеток Kv2.1, указывая на локализованное биотинилирование (фиг. 1 B , нижняя правая вставка ).Затем был проведен вестерн-блоттинг для характеристики биотинилированных белков. Нетрансфицированные клетки и клетки, экспрессирующие растворимый APEX, исследовали в дополнение к клеткам, в которых AMIGO-YFP-APEX экспрессировался отдельно, с Kv2.1 или с некластеризованным точечным мутантом Kv2.1 (S586A) (13). Вестерн-блоты зондировали стрептавидином, конъюгированным с флуорофором, для обнаружения биотинилированных белков. Как указано звездочкой на фиг. 1 C , белок 33 кДа был обнаружен в клетках, котрансфицированных AMIGO и Kv2.1, но не в клетках, трансфицированных либо одним AMIGO, либо AMIGO плюс точечный мутант Kv2.1 (S586A), который не взаимодействует с ER. VAP — это обильные ER-белки размером 33 кДа, которые участвуют в формировании мембранных сайтов контакта между ER и различными органеллами (20). Таким образом, очевидным кандидатом стали ВАП.

Рис. 1.

Использование бесконтактного биотинилирования для идентификации потенциальных интеракторов Kv2.1. ( A ) Схема подъезда. APEX был присоединен к C-концевому концу субъединицы бета Kv2.1, AMIGO.( B ) Локализация биотинилирования, опосредованного APEX. Клетки HEK трансфицировали Kv2.1 и AMIGO-YFP-APEX, обрабатывали биотином и H ₂ O ₂, а затем фиксировали с использованием формальдегида и метили стрептавидином, конъюгированным с CF640R, для визуализации биотинилированных белков, отображаемых с помощью лазерного сканирования. конфокальный микроскоп. Биотинилирование, локализованное в соединениях ER / PM, происходит только в клетках, экспрессирующих AMIGO-YFP-APEX и Kv2.1 (см. , нижнюю правую вставку для улучшенного представления о биотинилировании в Kv2.1 кластер). (Масштаб: 5 мкм.) ( C ) Параллельные образцы собирали и подвергали Вестерн-блот-анализу без аффинной очистки, используя стрептавидин-пероксидазу хрена для визуализации всех биотинилированных белков. Диапазон 33 кДа присутствует, когда AMIGO-YFP-APEX коэкспрессируется с каналом WT Kv2.1 (звездочка). Эта полоса отсутствует на указанных контрольных дорожках, т.е. без какой-либо трансфекции APEX, с экспрессией растворимого APEX и когда AMIGO-YFP-APEX экспрессируется отдельно или экспрессируется с мутантным Kv2.1 канал, который не может образовывать переходы ER / PM.

VAP специально перераспределяют для Kv2-индуцированных переходов ER / PM.

В то время как наша предыдущая работа (13) продемонстрировала индукцию Kv2.1 соединений ER / PM, в то время не было известно ни одного партнера по прямому связыванию. Наш первый подход к определению, взаимодействуют ли VAP с Kv2.1, заключался в проведении экспериментов по совместной локализации. VAPA-GFP или VAPB-GFP экспрессировались либо отдельно, либо с конструкцией Kv2.1-loopBAD, которая позволяла метить CF640-стрептавидин только поверхностных каналов.Поскольку все клетки экспрессируют эндогенные ВАП, экзогенные ВАП, меченные GFP, действуют как маркер для эндогенных белков при экспрессии на низких уровнях (20). Как проиллюстрировано на фиг. 2 A , когда выражается отдельно, VAPA-GFP показывает равномерное распределение по всей ER, как и ожидалось. Рис. 2 B показывает, что в присутствии Kv2.1 локализация VAPA-GFP резко изменилась с очевидным перераспределением в пользу Kv2.1-индуцированных соединений ER / PM. Затем мы использовали junctophilin 4 (JPh5) для индукции соединений ER / PM независимо от Kv2.1, чтобы исключить возможность того, что VAP благоприятствует всем контактам ER / PM, независимо от молекулярного состава. JPh5 представляет собой мембранный белок ER, который индуцирует мембранные контакты путем связывания липида PM (32). Когда коэкспрессируется с mCherry-JPh5, VAPA-GFP остается равномерно диспергированным по всему ER, не обнаруживая концентрации на индуцированных JPh5 контактах ER / PM (фиг. 2 C ). Таким образом, наличие соединений ER / PM само по себе не влияет на распределение VAPA-GFP. Мы также совместно экспрессировали GFP-Kv2.2 с VAPB-Ruby2, начиная с Kv2.2 также кластеры над ER (1, 30). Фиг.2 D показывает, что Kv2.2 также концентрирует VAP на сайтах индуцированного контакта с ER / PM. Когда Kv2.1 и Kv2.2 коэкспрессируются с VAPB, все три белка совместно локализуются в одних и тех же сайтах контакта ER / PM, как показано в SI Приложение , Fig. S1 A . Чтобы определить, зависит ли перераспределение VAP в Kv2.1-индуцированные контакты ER / PM от связывания мотива FFAT с помощью VAP, мы соэкспрессировали мутант VAPA K87D / M89D (20), который неспособен связывать мотивы FFAT, с Kv2.1, как показано на рис. 2 E . Этот мутант VAP показал меньшее перераспределение в Kv2.1-индуцированные соединения ER / PM, но все еще был немного обогащен в кластерах Kv2.1. Взятые вместе, эти данные предполагают, что концентрация VAP в соединениях ER / PM зависит от присутствия Kv2 каналов и что эта локализация в значительной степени зависит от функционального FFAT-связывающего мотива в белке VAP.

Рис. 2.

каналов Kv2 влияют на локализацию VAPA и VAPB в ячейках HEK. ( A ) VAPA-GFP, экспрессируемый отдельно, демонстрирует однородную локализацию по всей ER.( B ) VAPA-GFP, экспрессируемый с помощью Kv2.1-loopBAD, перераспределяется в индуцированные Kv2.1 соединения ER / PM. ( C ) VAPA, экспрессируемый с помощью белка, образующего соединение ER / PM, JPh5, не перераспределяется по соединениям. ( D ) Kv2.2, коэкспрессируемый вместе с VAPB-GFP, перераспределяет этот VAP в индуцированные соединения ER / PM. ( E ) VAPA (K87D / M89D) имеет пониженную способность к перераспределению в соединения ER / PM, индуцированные Kv2.1. (Масштаб: 5 мкм.) ( F ) Столбиковая диаграмма, суммирующая перераспределение VAP путем расчета отношения флуоресценции в соединениях ER / PM к флуоресценции в ER глубже в клетке, когда соединения формируются с использованием Kv2 и / или JPh5, как указано.Только Kv2.1 и Kv2.2 увеличивают коэффициент флуоресценции VAP. Для анализа использовалось логарифмическое преобразование, чтобы удовлетворить условие однородности дисперсии, и был выполнен односторонний дисперсионный анализ, F (8, 36) = 25,699, P = 1,106 × 10 ⁻¹² с апостериорным попарным Тесты Тьюки. * P <0,0001, значительная разница по сравнению с контролем dsRedER. ^# P <0,01 значимость. Планки погрешностей представляют SEM. В каждом случае исследовали двадцать пять областей интереса из пяти ячеек.

Эффект экспрессии Kv2.1 на локализацию VAP суммирован на рис. 2 F . Здесь мы рассчитали отношение флуоресценции VAP-GFP в PM к цитоплазматическому сигналу ER, расположенному дальше внутри клетки (соотношение флуоресценции), чтобы количественно оценить степень, в которой VAP концентрируются в соединениях ER / PM, образованных различными белками. dsRedER, растворимый маркер ER, имел отношение 0,67, что указывает на более низкую интенсивность ER в кластерах Kv2.1 на PM по сравнению с сигналом в ER глубже внутри клетки.Это соотношение существенно не отличалось от соотношений VAPA и VAPB при совместной экспрессии с JPh5 (соотношение 0,64, P = 1 для VAPA и соотношение 0,62, P = 0,9996 для VAPB). В отличие от того, что наблюдалось с соединениями, индуцированными JPh5, VAP были значительно более сконцентрированы в соединениях Kv2.1 ER / PM (соотношение 2,9, P ≤ 0,0001, для VAPA и соотношение 2,9, P ≤ 0,0001, для ВАПБ). Обратите внимание, что JPh5 и Kv2.1 образуют схожие по внешнему виду ER / PM-переходы (рис.2 C ) и, фактически, Kv2.1 и JPh5 совместно локализуются в пределах одних и тех же соединений, когда выражаются вместе, как показано в приложении SI , рис. S1 B . Присутствие Kv2.1 рядом с JPh5 в местах контакта ER / PM приводит к значительному перераспределению VAPA, не наблюдаемому, когда JPh5 формирует только соединения (соотношение 2,90 против 0,67, P = ≤0,0001 по сравнению с одним JPh5). Обратите внимание, что хотя соотношение 0,87 для VAPA (K87D / M89D) не было статистически значимым по сравнению с контролем dsRedER, наблюдалась тенденция к увеличению концентрации, причем это перераспределение было заметно заметно в некоторых клетках.Эти данные подтверждают идею, что связывание мотива FFAT является критическим для перераспределения VAP в Kv2.1-индуцированные соединения ER / PM; однако может существовать вторичный механизм, с помощью которого VAPs концентрируются на Kv2.1-содержащих соединениях ER / PM, который не зависит от связывания мотива FFAT.

Анализ резонансной передачи энергии Фёрстера поддерживает прямое взаимодействие Kv2.1 – VAP на соединениях ER / PM, индуцированных Kv2.1.

Данные, представленные до сих пор, подтверждают взаимосвязь между каналами Kv2 и VAP, но не демонстрируют прямого связывания между двумя белками.Поэтому мы использовали резонансный перенос энергии Ферстера (FRET), чтобы определить, вероятно ли, что эти два белка находятся в прямом контакте. Мы прикрепили акцептор FRET (mRuby2) и донор (Clover) к цитоплазматическим доменам VAP и N-концам Kv2.1 соответственно. Связанную тандемную конструкцию Clover – mRuby2 использовали в качестве положительного контроля, в то время как совместная экспрессия растворимых несвязанных mRuby2 и Clover служила отрицательным контролем. Сигналы FRET, полученные от этих двух элементов управления, и FRET, наблюдаемые между Kv2.1 и VAPA, показаны на рис.3 A , справа . Сигналы FRET, наблюдаемые во всех экспериментах, представлены на рис. 3 B . Мы наблюдали значительную эффективность FRET между Kv2.1 и как VAPA, так и VAPB (75% связанного контроля и 63% связанного контроля, P ≤ 0,000001 и P ≤ 0,000001 по сравнению с несвязанным контролем, соответственно), что указывает на белок– белковое взаимодействие. Напротив, несвязанные Clover и mRuby2 отображали значения эффективности FRET, которые составляли только 3% от связанного контроля.Дополнительный положительный контроль исследовал эффективность FRET, существующую между субъединицами Kv2.1 в пределах гетеромерного канала, то есть субъединицами mRuby2- и Clover-Kv2.1 (68% связанного контроля). Снижение FRET между субъединицами Kv2.1 относительно связанного положительного контроля Clover-mRuby2, вероятно, связано со случайной сборкой тетрамера канала. Интересно, что второй отрицательный контроль, мутант VAPA (K87D / M89D), который неспособен связывать мотивы FFAT (33), показал уменьшенное, но все же значительное (16% связанного контроля, P ≤ 0.000001 по сравнению с несвязанным контролем) Эффективность FRET. Этот сигнал может быть связан с олигомеризацией с эндогенными VAP через трансмембранный домен, как было описано ранее (34). По сути, мутант VAPA (K87D / M89D), который не способен связывать Kv2.1, олигомеризуется с эндогенными VAP, которые связаны с каналом. Такой механизм позволит накопление VAP с доступными доменами связывания мотивов FFAT в пределах Kv2.1-индуцированных контактов ER / PM.

Рис. 3.

FRET между Kv2.1 и оба VAP в трансфицированных клетках HEK. ( A ) Репрезентативные изображения эффективности донора, акцептора и FRET между указанными конструкциями. Величина эффективности FRET проиллюстрирована типичными тепловыми картами. (Шкала: 5 мкм.) ( B ) Количественная оценка эффективности FRET. Здесь сигналы FRET были стандартизированы по сигналам, полученным с помощью связанного положительного контроля Clover-Ruby2. Положительные контроли обозначены черными полосами, отрицательные контроли — светло-серыми, а взаимодействия Kv2.1 / VAP — более темными серыми.Был проведен односторонний дисперсионный анализ, F (5, 481) = 195,7, P = 1,81 × 10 ^-133 с апостериорным тестом Тьюки для проверки значимости. * P <0,000001, значимое различие относительно несвязанного отрицательного контроля. Планки погрешностей представляют SEM. n = 109 связанных, 104 VAPA, 76 VAPA (мутантных), 48 VAPB, 75 Kv2.1 и 58 несвязанных клеток. В каждой ячейке было исследовано 15 областей интереса.

Нокдаун белка VAP влияет на кластерное поведение Kv2.1.

Подтвердить, что VAP напрямую участвуют в Kv2.1 кластеризация над ER, мы использовали подход siRNA для снижения экспрессии эндогенного VAP в клетках HEK. Как проиллюстрировано на фиг. 4 A , в то время как скремблированный контроль миРНК не влиял ни на экспрессию VAPA, ни на экспрессию VAPB, объединение обеих миРНК значительно снижало как VAPA, так и VAPB. Затем мы исследовали влияние нокдауна VAP на кластеризацию Kv2.1, как показано на рис. 4 B и суммировано на рис. 4 C . Как показано на рис. 4 B , отключение как VAPA, так и VAPB визуально уменьшало степень GFP-Kv2.Кластеризация 1-loopBAD, как показано на изображении со связыванием CF640-SA с биотинилированными каналами на поверхности клетки. Поскольку размер и интенсивность кластера Kv2.1 зависят от уровней экспрессии Kv2.1, мы количественно оценили эффект нокдауна VAP, просто сравнив процент клеток с кластерами, наблюдаемыми при различных обработках siRNA. Чтобы ячейка была классифицирована как бескластерная Kv2.1, она должна иметь однородное поверхностное распределение, показанное двумя ячейками ( ii и iii ) на рис.4 B , Нижний правый . Ячейка и была классифицирована как обладающая кластеризованным Kv2.1. При использовании этого количественного подхода эффекты снижения уровней VAPA или VAPB суммированы на фиг. 4 C (83,4% и 83,1%, NS, по сравнению с контролем скремблированной siRNA). Комбинация обеих миРНК оказала наибольшее влияние на процент кластеризации Kv2.1, уменьшив кластеризацию со 100% до 58,9% ( P <0,00001) по сравнению с контрольным скремблированным миРНК. Таким образом, результаты, представленные на рис.4 указывают на то, что обе изоформы VAP участвуют в кластеризации Kv2.1, то есть в связывании с кортикальным ER в клетках HEK. Хотя это не видно на фиг. 4, siRNA VAP, по сравнению со скремблированным контролем siRNA, снижает общую поверхность Kv2.1 до 41% от контроля и снижает интенсивность кластеров Kv2.1 до 40%. Интенсивность GFP была снижена до 55% от контроля. Таким образом, нокдаун VAP подавлял поверхностные уровни Kv2.1 в несколько большей степени, чем общая экспрессия Kv2.1. Связаны ли уровни VAP с Kv2.1 биосинтез, торговля или стабильность остается открытым вопросом.

Рис. 4.

Эффект siRNA-опосредованного нокдауна VAPA и VAPB на кластеризацию Kv2.1. ( A ) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий эффективность миРНК VAPA и VAPB. Протеиновый блот анализировали антителом против VAPB, которое перекрестно реагирует с VAPA. ( B ) Типичное изображение кластеризации GFP-Kv2.1-loopBAD в присутствии скремблированных миРНК или VAPA и VAPB, полученное с помощью микроскопии с вращающимся диском. Показаны проекции максимальной интенсивности z -стека.На изображении вверху справа все три ячейки ( a – c ) были оценены как имеющие сгруппированный Kv2.1. На изображении нижнего правого только ячейка i была оценена как имеющая кластеры. Обратите внимание, что это изображение представлено просто, чтобы проиллюстрировать, как определялась кластеризация, в отличие от количественной оценки эффекта обработки миРНК. (Масштаб: 5 мкм.) ( C ) Количественная оценка процента клеток, демонстрирующих кластеризацию Kv2.1 после различных обработок миРНК.Восемьдесят шесть клеток, получающих скремблированную миРНК, 90 клеток, получающих миРНК VAPA, 61 клетку, получающую миРНК VAPB, и 144 клетки, получающие миРНК VAPA и VAPB, были исследованы в пределах 26, 27, 21 и 41 изображений соответственно. Планки погрешностей представляют SEM. Для анализа был выполнен односторонний дисперсионный анализ, F (3, 111) = 13,61, P = 1,27 × 10 ^-7, с апостериорными тестами Тьюки. * P <0,01 значимость.

Время резидентности VAP на соединениях ER / PM, индуцированных Kv2.1, давно существует.

Наш предыдущий анализ поведения Kv2.1 на уровне одной молекулы показал, что отдельные каналы Kv2.1 могут находиться внутри кластера более 25 мин (35), что свидетельствует об очень стабильном взаимодействии между C-концом Kv2.1 и его ER-связывающий партнер. Чтобы изучить стабильность связывания Kv2.1 VAP, мы измерили кинетику диссоциации фотоактивируемого GFP (paGFP) VAPA в кластерах Kv2.1 после фотоактивации. Мы выборочно активировали и количественно измерили флуоресценцию VAP-paGFP только в поле TIRF, чтобы избежать активации флуоресценции, удаленной из PM, как показано на рис.5 А . Активация paGFP и затем измерение его потери из-за диффузии в цитоплазматический ER позволили нам измерить относительную стабильность взаимодействия VAP-Kv2.1 (Fig. 5 B ). Мы обнаружили, что VAPs были явно более стабильными в соединениях Kv2.1, чем в соединениях, индуцированных JPh5, как и ожидалось, если каналы Kv2.1 и VAPs взаимодействуют с образованием этого соединения. Как показано на рис. 2, хотя VAPs не концентрируются в этих областях, VAPs присутствуют в соединениях мембраны JPh5 исключительно потому, что они существуют по всему ER.Флуоресценция paGFP снижалась до исходного уровня с индуцированными JPh5 соединениями, в то время как в присутствии Kv2.1 стабильно сохранялась приблизительно одна треть исходного VAPA-paGFP, что указывает на стабильное взаимодействие Kv2.1-VAP, продолжающееся более 10 мин. Если VAP действительно функционируют как каркасные белки в контактах ER / PM, эта стабильность делает возможным существование долгоживущих комплексов. Для соответствия данным требовалось двухэкспоненциальное затухание, показывающее постоянные времени 9,1 с и 80,5 с для мембранных переходов JPh5 по сравнению с 13.9 с и 186,3 с для контактов ER / PM, индуцированных Kv2.1. Эти постоянные времени, вероятно, являются результатом диффузии VAP в более глубокий ER, который удаляется из PM. Увеличение постоянной времени, наблюдаемое в присутствии Kv2.1, может быть связано с увеличением молекулярного скопления в присутствии Kv2.1 по сравнению с JPh5.

Рис. 5. Анализ на основе

Photoactivatable-GFP (paGFP) стабильности VAPA на Kv2.1-индуцированных соединениях ER / PM. ( A ) Типичные TIRF-микроскопические изображения VAPA-paGFP при любом Kv2.1- или JPh5-индуцированные переходы ER / PM через 1, 120 и 600 с после индуцированной 405 нм фотоактивации в TIRF. (Шкала: 5 мкм.) ( B ) Динамика потери флуоресценции paGFP. Нормализованные измерения флуоресценции соответствовали двухэкспоненциальному затуханию, черные линии (y = y0 + A1e- (x-x0) / t1 + A2e- (x-x0) / t2). VAPA был значительно менее стабильным на соединениях ER / PM, индуцированных JPh5 (τ1 = 9,1, τ2 = 80,5), чем на соединениях Kv2.1 (τ1 = 13,9, τ2 = 186,3), P = 0,0395 при 600 с. Планки погрешностей представляют SEM.Использовали двадцать пять областей интереса от 5 клеток, экспрессирующих Kv2.1, и 20 областей интереса от 20 клеток, экспрессирующих JPh5.

Связывание с VAP опосредуется концами Kv2.1 и Kv2.2 C.

VAP связывают слабо выраженный мотив FFAT (два фенилаланина в кислотном тракте), содержащийся в их партнерах по связыванию. Кластеризация Kv2.1 требует ранее определенного мотива внутри С-конца канала, как показано на фиг. 6 A (29), с подчеркнутыми серинами, вероятно, представляющими фосфорилированные аминокислоты, участвующие в Kv2.1 кластеризация над ER (13, 29). Однако очевидные VAP-связывающие мотивы FFAT, которые имеют консенсусную последовательность EFFDAxE (20), отсутствуют как на C-концах Kv2.1, так и на -2.2 (по сравнению с фиг. 6 A ). В качестве первого шага к идентификации последовательностей в каналах Kv2, которые участвуют в связывании VAP, мы добавили аминокислоты 445–609 из Kv2.1 и аминокислоты 552–911 из Kv2.2 к однопроходному трансмембранному белку CD4, как показано на рис. 6 В . Эти аминокислоты были выбраны для сохранения общей длины аминокислот от PM до областей, которые, как известно, необходимы для кластеризации, как можно ближе к WT Kv2.1 насколько это возможно, так как есть основания полагать, что расстояние между ER – PM мембраной может иметь глубокий эффект на локализацию белков в соединениях ER / PM (36). CD4 был выбран потому, что CD4 дикого типа демонстрирует гомогенное распределение на клеточной поверхности как в трансфицированных нейронах гиппокампа крысы, так и в клетках HEK. Таким образом, легко обнаруживается любое скопление или концентрация в кортикальном ER. Поскольку структурные исследования показывают, что CD4 образует димер (37), мы предполагаем, что каждая из этих химерных конструкций содержит два С-концевых домена Kv.Затем химеры CD4 / Kv2 коэкспрессировали с VAPA-GFP в клетках HEK, а CD4 локализовали с использованием конъюгированного с CF640 моноклонального антитела против CD4, направленного против внеклеточного эпитопа. Как показано на фиг. 6 C , химера С-конца CD4 / Kv2.1 сгруппировалась на поверхности клетки и сконцентрировала VAPA, аналогично полноразмерному Kv2.1 на фиг. 2 B . Такая же кластеризация и перераспределение VAPA наблюдались с С-концевой химерой CD4 / Kv2.2 (фиг. 6 D ). Таким образом, неканонический VAP-связывающий мотив, вероятно, присутствует в этих С-концевых последовательностях.

Рис. 6.

Kv2-канала C-конца достаточно для формирования соединений ER / PM посредством взаимодействия VAP. ( A ) Сравнение последовательностей C-концов Kv2.1 и Kv2.2. Обратите внимание на высокую степень сохранности в области, необходимой для кластеризации, но ее отсутствие в других местах. Известная последовательность, необходимая для кластеризации в Kv2.1, обозначена пурпурной линией. Известные аминокислоты, необходимые для кластеризации, выделены голубым цветом. ( B ) Схема WT CD4 справа и конструкции CD4-Kv2.1: 445–609 слева.Критические аминокислоты для кластеризации Kv2.1 выделены черным. ( C ) Присоединение аминокислот 445–609 Kv2.1 к C-концу CD4 приводит к соединениям ER / PM, которые концентрируют VAPA на PM. ( D ) С-конец Kv2.2, присоединенный к CD4, также приводит к конструкции, которая объединяется в кластеры и взаимодействует с VAP. ( E ) Экспрессия VAPA-GFP с помощью конструкции CD4-Kv2.1: 445-609, в которой серины, подчеркнутые в A , были мутированы в аланины. ( F ) Экспрессия VAPA-GFP с CD4-Kv2.1: 445–609, в которой серины, подчеркнутые в A , были мутированы в аспарагиновые кислоты. (Масштаб: 5 мкм.)

Поскольку считается, что фосфорилирование регулирует взаимодействие Kv2.1-ER и результирующий фенотип кластеризации каналов, мы затем мутировали подчеркнутые серины, выделенные на рис. 6 A , в аланины, неспособные к фосфорилированию. (CD4-Kv2.1: AAAA) или аспарагиновые кислоты для создания фосфомиметиков (CD4-Kv2.1: DDDD). CD4-Kv2.1 С-концевые химеры, содержащие эти замены в пределах присоединенных 445-609 аминокислотных остатков Kv2.1 затем коэкспрессировались с VAPA-GFP, и оценивалось перераспределение VAPA. Как показано на фиг. 6, замена аланина E предотвращала как кластеризацию химер, так и перераспределение VAPA, тогда как фиг. 6 F показывает устойчивую кластеризацию и перераспределение VAPA с фосфомиметическими заменами. Эти данные дополнительно подтверждают идею, что взаимодействие Kv2.1-VAP регулируется с помощью фосфорилирования в пределах небольшого участка С-конца канала.

Kv2.1 формирует соединения ER / PM посредством взаимодействия с VAP через неканонический мотив FFAT.

Чтобы идентифицировать точную С-концевую последовательность Kv2.1, участвующую в связывании VAP, мы создали серию химер CD4, содержащих различные количества С-концевой последовательности Kv2.1 (суммировано на фиг. 7 D ). Чтобы обеспечить достаточную глубину цитоплазмы для контакта с кортикальным ER, мы добавили β2-микроглобулин между CD4 и последовательностью канала, чтобы создать жесткий линкер. Гибкие линкеры переменной длины также вставляли между микроглобулином и длинами короткой последовательности Kv2.1, чтобы поддерживать постоянное расстояние между ER и PM.В качестве положительного контроля мы также добавили классическую последовательность FFAT оксистеринсвязывающего белка (OSBP) как с восходящими, так и с нижележащими фланкерами (см. SI Приложение , Дополнительные материалы и методы для дополнительных деталей). OSBP — это белок-переносчик липидов, который является известным взаимодействующим с VAP и имеет хорошо охарактеризованный мотив FFAT (14, 20, 38). Мы начали с подтверждения того, что аминокислотная последовательность, которая, как уже известно, отвечает за кластерное поведение каналов Kv2.1 [аминокислоты 573–598 (29)], также отвечает за связывание VAP.Как показано на фиг. 7 A , химера CD4-Kv2.1 с С-концом, содержащая только аминокислоты 579–592 из Kv2.1, как кластеризованные, так и концентрированные VAPA на стыке ER / PM. Напротив, химеры с аминокислотами 586–598 не смогли ни кластеризовать, ни перераспределять VAP, как показано на рис. 7 B . Фиг. 7 C показывает связывание VAP, наблюдаемое с положительным контролем на мотив CD4-OSBP FFAT. Последовательность и поведение этих и других конструкций суммированы на фиг. 7 D .Для сравнения включена С-концевая последовательность Kv2.2, использованная на фиг. 6 D . Сравнения, показанные на фиг. 7 D , предполагают, что существует неканонический мотив FFAT, присутствующий как на Kv2.1, так и на -2.2 C-концах. 7 аминокислотных остатков желтого цвета представляют собой основной мотив, в котором отсутствует второй ожидаемый фенилаланин. Расположенные выше аминокислоты синим цветом, вероятно, заменяют расположенный выше кислотный тракт, очевидный в последовательности OSBP. В Kv2.1 фосфорилирование серина, вероятно, обеспечивает отрицательный заряд, необходимый для управления взаимодействием Kv2-VAP, подобно другим изученным FFAT-содержащим белкам, которые, как известно, взаимодействуют с VAPs (20).Это необходимое фосфорилирование объясняет индуцированную кальциневрином декластеризацию Kv2.1, которая происходит в ответ на эксайтотоксичность или нейрональное повреждение (3, 39, 40). Обратите внимание, что 579-592 строят кластеры только тогда, когда VAP котрансфицируются, указывая тем самым, что отсутствие нижестоящей последовательности снижает сродство VAP. Мы не можем сказать, увеличивают ли эти специфические аминокислоты сродство связывания или какая-либо случайная последовательность после мотива FFAT может служить этой цели; насколько нам известно, никогда не было описано ни одного мотива FFAT, локализованного на самом конце любого белка, как в случае с этой химерой CD4.

Рис. 7.

Определение минимального домена, необходимого для взаимодействия Kv2.1 – VAP. ( A ) CD4-Kv2.1: 579–592, образуя соединения ER / PM в клетках HEK посредством взаимодействия VAP. Эта конструкция представляет минимальную последовательность аминокислот, которую мы наблюдали, способную к такому поведению (однако, см. Звездочку в D ). ( B ) CD4-Kv2.1: 586–598 не был способен формировать соединения ER / PM посредством взаимодействия VAP. ( C ) Конструкция CD4-OSBP, демонстрирующая, что образование ER / PM и концентрация VAP происходят в присутствии классического белка, содержащего мотив FFAT, на PM.(Масштаб: 5 мкм.) ( D ) Схема, показывающая идентичность аминокислот и относительное положение фрагментов последовательности Kv2.1, присоединенных к основной цепи CD4. Правая сторона указывает, какие химеры образуют кластеры на мембране с сопутствующей релокализацией VAP в эти места. * CD4-Kv2.1: 579–592 был способен образовывать соединения ER / PM, если VAP коэкспрессировался, но не формировал эти микродомены только с эндогенными уровнями VAP.

Интересно, что 3 из 4 уже признаны критическими для кластеризации Kv2.1 (S586, F587, S589) находятся непосредственно в мотиве FFAT (13, 29). Четвертый критический остаток (S583) расположен всего на 3 аминокислотных остатка выше и внутри фланкерной области мотива FFAT, которая, как известно, важна для связывания VAP (20). Серин 586 является известным сайтом фосфорилирования (41).

Kv2.1 и Kv2.2 взаимодействуют и регулируют локализацию VAPA и VAPB в нейронах гиппокампа крыс.

Чтобы подтвердить, что взаимодействия Kv2 VAP также происходят в нейронах гиппокампа, Kv2.1-loopBAD коэкспрессировался с VAPA-GFP в нейронах гиппокампа крысы DIV 7, как показано на рис.8 А . Опять же, VAPA концентрируется на Kv2.1-индуцированных соединениях ER / PM. На рис. 8 B показан аналогичный результат при совместной экспрессии GFP-Kv2.2 и VAPB-mRuby2. Каналы Kv2 также образуют соединения ER / PM внутри AIS (42, 43), и Рис. 8 C и D иллюстрирует концентрацию VAP здесь в присутствии Kv2.1 и Kv2.2, соответственно. Рис. 8 E иллюстрирует взаимодействие химеры CD4-Kv2.1: 573–589 с VAPA внутри AIS. Недавние работы показывают, что Kv2.1, вероятно, содержит два независимых сигнала локализации AIS в пределах C-конца; один содержится в последовательности, показанной на рис. 6 A , а другой расположен дистально на аминокислотах 720–745 (44). У химеры CD4 отсутствует этот вторичный сигнал локализации AIS, что демонстрирует, что связывание VAP само по себе может локализовать Kv2.1 в AIS. Количественное определение взаимодействия Kv2-VAP показано на рис. 8 F . Здесь указан процент трансфицированных нейронов, концентрирующих либо VAPA, либо VAPB в Kv2-индуцированных соединениях ER / PM.Химеры CD4, которые не смогли взаимодействовать с VAP в клетках HEK (рис. 7), также не смогли связать VAP в нейронах. Эти данные показывают, что взаимодействие Kv2-VAP сходно между клетками HEK и нейронами гиппокампа крысы, что неудивительно, учитывая, что клетки HEK имеют нейрональное происхождение (45) и кальциневрин-зависимая регуляция кластеризации Kv2.1 сохраняется между этими двумя клетками. типы (46).

Рис. 8. Взаимодействие

Kv2 с VAP в нейронах гиппокампа крысы. ( A ) Совместное выражение Kv2.1-loopBAD и VAPA-GFP. Поверхность Kv2.1-loopBAD визуализировали с помощью стрептавидина, конъюгированного с CF640. ( B ) Коэкспрессия GFP-Kv2.2 и VAPB-mRuby2. ( C — E ) Совместная локализация Kv2.1-loopBAD, GFP-Kv2.2 и химеры CD4-Kv2.1: 573–589 с VAPA-GFP, VAPB-mRuby2 и VAPA-GFP соответственно , в AIS. AIS подтверждали окрашиванием антител к нейрофасцину, как показано в приложении SI , рис. S2. (Шкала: 5 мкм.) ( F ) Сводная информация о проценте нейронов, концентрирующих VAP на индуцированных соединениях ER / PM.Планки погрешностей указывают на SEM. Значения P , сравнивающие взаимодействие первых трех химер CD4-Kv2.1 с VAPA или VAPB с WT Kv2.1, не были значимыми, со значениями ANOVA Краскела – Уоллиса P = 0,37 и P = 0,1, соответственно.

Discussion

Наши данные демонстрируют, что взаимодействие Kv2 канал-VAP связывает PM с кортикальным ER, как суммировано на Рис. 9. Формирование этого сайта контакта с мембраной дает начало кластерам каналов Kv2 на поверхности нейронов.VAPA и VAPB обильно экспрессируются в гиппокампе, кортикальном слое и двигательных нейронах на основе методов вестерн-блоттинга и иммуноокрашивания, и эти типы нейронов обнаруживают заметные кластеры Kv2.1 на соматической поверхности (47). Однако ранее не сообщалось о концентрации VAP в кластерах, связанных с плазматической мембраной, возможно, потому что доступные антитела нацелены на домены VAP, связанные со связыванием мотива FFAT, тем самым предотвращая иммунное мечение VAP в собранном комплексе. Хотя ранее мы предполагали, что отдельные каналы Kv2 в этих микродоменах должны быть загнаны за цитоскелетным забором из-за их высокой латеральной мобильности внутри PM (35), и мобильность, и кластеризация теперь лучше всего объясняются связыванием со свободно диффундирующими VAP внутри ER. .Эксперименты с FRET, представленные на рис. 3, показывают, что Kv2.1 и VAP находятся в пределах 1–10 нм друг от друга (48), что позволяет предположить, что они находятся в прямом контакте. Кинетика потери флуоресценции после фотоактивации VAP-paGFP (рис. 5) предполагает, что это взаимодействие является относительно долгоживущим (> 10 мин), что согласуется с нашими предыдущими исследованиями, показывающими, что отдельные каналы Kv2.1 могут оставаться в кластере в течение 25 минут или более. в условиях покоя (35). Эксперименты по нокдауну siRNA VAP (рис. 4) подтверждают идею, что VAPs необходимы для Kv2.1 и указывают, что в этом процессе участвуют как VAPA, так и VAPB. Однако поверхностная экспрессия Kv2.1 снижалась на 60% после нокдауна как VAPA, так и VAPB. Означает ли этот результат, что VAPs специфически участвуют в биосинтезе, перемещении или стабильности Kv2.1, остается открытым вопросом. Однако каналы Kv2.1 доставляются на клеточную поверхность в Kv2.1-индуцированных соединениях ER / PM (9), что делает вероятным, что нарушение этого сайта контакта с мембраной будет влиять на доставку Kv2.1. Обратите внимание, что когда Kv2.1 сначала синтезируется в трансфицированной клетке HEK, он доставляется на поверхность клетки через небольшие и динамические контакты ER / PM, которые существуют в отсутствие Kv2.1 (49). По мере того как Kv2.1 накапливается на поверхности, он начинает связывать ER VAP и формировать большие и стабильные мембранные соединения.

Рис. 9.

Рабочая модель, в которой каналы Kv2 концентрируют ER VAP как путем прямого связывания через C-концевой неканонический мотив FFAT, так и за счет олигомеризации VAP через трансмембранный домен VAP.

ВАП связывают мотивы FFAT через положительно заряженную поверхность, расположенную в их основном подобном белку сперматозоиду домену (20).Ядро мотива FFAT представляет собой последовательность из 7 аминокислотных остатков, которые, как правило, вытянуты вверх по кислотному тракту. Связывание мотива VAP-FFAT инициируется через неспецифические отрицательно заряженные аминокислоты выше основного мотива, как показано на фиг. 7 классическим мотивом FFAT нашей конструкции CD4-OSBP (FFAT). Хотя первоначально определенная последовательность для доменов FFAT — EFFDAxE, этот мотив может допускать высокую степень вариабельности. Например, два фенилаланина не присутствуют во всех VAP-связывающих последовательностях; например, протрудин имеет мотив, подобный FFAT, с лизином в положении 3 (по сравнению с изолейцином в Kv2.1) (20). VAP-связывающие домены Kv2.1 и -2.2, идентифицированные в нашей настоящей работе, SFISCAT и SFTSCAT, соответственно, снова демонстрируют, что два фениаланина не являются необходимыми для связывания и что фосфорилированные серины, вероятно, могут замещать кислотные остатки. Важно отметить, что последовательности Kv2 соответствуют минимальным требованиям для FFAT-подобных мотивов: F / Y в положении 2, отрицательный остаток в положении 4, небольшой остаток в положении 5 и отрицательный фланг. Тем не менее, критерии, предложенные для поиска мотивов FFAT, поместят последовательности Kv2 ниже установленного порога (20).Особенность, которая сделала эти мотивы обнаруживаемыми, — это предыдущее точное отображение на конце C Kv2.1 (29).

Кластеризация Kv2.1 и в меньшей степени Kv2.2 регулируется фосфорилированием (1, 3, 50) и фосфорилированием серинового остатка 586 в начале неканонического мотива FFAT, что подтверждается масс-спектрометрией и фосфорилированием. специфическое связывание антител (41, 50), вероятно, генерирует отрицательный заряд, необходимый для облегчения связывания VAP. Уже известно, что фосфорилирование остатков, окружающих мотивы FFAT, для облегчения связывания происходит в других взаимодействующих VAP (20).В настоящее время неизвестно, фосфорилируется ли серин 583 в вышестоящем линкере, необходимый для кластеризации Kv2.1 (29), или серин 589, критический остаток мотива FFAT. Известно, что нейрональные инсульты, такие как ишемия и активность нейронов, приводят к кальциневрин-зависимому дефосфорилированию канала, рассредоточению кластеров каналов и ретракции кортикального ER (3, 13, 39, 40). Как кальциневрин получает доступ к фосфорилированным серинам, участвующим в связывании VAP, неясно. Возможно, индивидуальные взаимодействия мотивов FFAT и VAP достаточно динамичны, чтобы обеспечить доступ кальциневрина в течение 2-минутного периода, необходимого для значительной индуцируемой глутаматом декластеризации и ретракции ER (13).Важно отметить, что каналы Kv2 являются тетрамерными. Это текущее исследование не исследовало стехиометрию, участвующую во взаимодействии Kv2-VAP, но вполне вероятно, что один тетрамер Kv2 может связывать до четырех VAP. Отдельные VAP, связывающие и быстро связывающие различные α-субъединицы как в пределах одного канала, так и между каналами, могут объяснять временный доступ кальциневрина к FFAT и все же согласовываться с общей долгосрочной стабильностью белков в этих доменах. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования для выяснения точных механизмов, лежащих в основе зависимого от фосфорилирования взаимодействия VAP.

Данные, представленные на рис. 2 и 3 предполагают, что мутант VAPA (K87D / M89D), который не способен связывать мотивы FFAT, все еще локализуется в соединениях ER / PM, индуцированных каналом Kv2, хотя и в меньшей степени по сравнению с WT VAPA. Поскольку VAP могут образовывать гомомерные и гетеромерные олигомеры, возможно, через трансмембранный мотив GxxxG (34), мутантный GFP-меченный VAPA может собираться в олигомеры с эндогенными WT VAP, которые связаны с каналами Kv2 в местах соединения. Такой механизм позволил бы локализовать VAP в этих микродоменах, которые обладают FFAT-связывающими мотивами, доступными для взаимодействия с дополнительными партнерами, кроме каналов Kv2 (см.рис.9 для изображения). VAP имеют растущий список взаимодействующих, включая AKAP, протеинкиназы, регуляторы киназ, факторы транскрипции, Rab и белки-переносчики липидов (19, 20, 38), и любая концентрация этих белков в сайтах контакта ER / PM должна быть физиологически значимой. Учитывая, что взаимодействие Kv2-VAP, вероятно, непосредственно регулируется фосфорилированием внутри и рядом с С-концевым мотивом FFAT Kv2, возможно, что вовлеченные киназы и фосфатазы связаны с VAP. Однако, насколько нам известно, известный Kv2.1-модифицирующие киназы (CDK5, p38 MAPK, src) (51⇓-53) и фосфатазы (кальциневрин) (3, 40) не были подтверждены как часть взаимодействия VAP (19). Однако белки, содержащие мотив FFAT, участвуют в невезикулярном переносе церамидов, холестерина и фосфотидилинозитолов между ER и поздними секреторными органеллами, включая TGN и PM. Каналы Kv2 могут образовывать соединение ER / PM, где концентрированные VAP функционируют в качестве связующего звена, делая эти участки контакта с мембраной не только функционально отличными от контактов ER / PM, таких как те, которые индуцируются STIM1 или расширенными синаптотагминами (14), но и регулируются. по активности нейронов и чувствительны к оскорблениям.Кроме того, возможно обратное, когда VAP-опосредованная концентрация каналов Kv2 придает определенные функции соединению ER / PM за счет доменов, содержащихся в самом канале. Kv2.1 содержит синтаксин-связывающую область (10, 54), ионную пору и домен, чувствительный к напряжению, который даже в непроводящем канале реагирует на мембранный потенциал (8). В дополнение к локализованному связыванию белка SNARE или проводимости K ⁺, возможно, Kv2.1 передает электрическую активность нейронов функциям, возникающим в контактах ER / PM.

Контактные сайты ER / PM составляют ~ 12% соматической поверхности in vivo, но не все соединения создаются одинаковыми (17). Соединения могут быть образованы протяженными синаптотагминами, белками STIM, юнктофилинами и другими белками (14) в дополнение к каналам Kv2, и очевидный вопрос связан с динамическим составом этих мембранных контактов в любое конкретное время. Вероятно, что могут присутствовать белки, образующие множественные соединения, и что эти компоненты будут по-разному рекрутировать специфические интеракторы, как предложено здесь для рекрутирования Kv2 VAPs.Kv2.1 и Kv2.2 по-разному экспрессируются в типах клеток по всему мозгу и проявляют разные функциональные свойства, включая реакцию на стимулы, такие как острая гипоксия, при этом Kv2.2 менее отзывчив с точки зрения как кластеризации, так и измененной зависимости от напряжения (1) . Кажется вероятным, что эти различия в расположении и стабильности соединений, а также в функциональности значительны по отношению к разным типам клеток. Кроме того, Kv2.1 демонстрирует различное поведение в зависимости от субклеточного компартмента, в котором он расположен.Каналы Kv2.1 на AIS более устойчивы к индуцированной глутаматом декластеризации по сравнению с каналами на соме (44, 55). Хотя наши данные указывают на то, что связывание на основе VAP происходит в обоих компартментах, существует домен, расположенный ниже мотива FFAT (аминокислоты 720-745), который достаточен для AIS-специфической локализации (44). Возможно, во время эволюции добавление второго мотива нацеливания на ER гарантирует, что активность нейронов не изменяет контакты Kv2.1-ER внутри AIS.

Как и во многих ионных каналах, мутации в Kv2.1, изменение проводимости связано с заболеванием человека, а мутации, изменяющие селективность ионов и чувствительность к напряжению, связаны с эпилепсией и задержкой развития (56, 57). Однако три недавно описанные мутации Kv2.1 приводят к преждевременным стоп-кодонам, которые, как предполагается, не изменяют проводимость Kv2.1 (58). Эти мутации происходят ниже доменов консервативных каналов, попадая между последним трансмембранным доменом и неканоническим мотивом FFAT, идентифицированным в настоящей работе. Одна из этих мутаций урезает Kv2.1 на остатке аргинина непосредственно перед фланкерной областью мотива FFAT (R571). Все три мутации приводят к задержке развития, и ожидается, что все три устранят соединения ER / PM, образованные с помощью Kv2.1. Таким образом, мутации, которые специфически мешают связыванию Kv2.1-VAP, вероятно, вовлечены в заболевание человека.

Материалы и методы

Конструкции ДНК.

Плазмиды, кодирующие флуоресцентный белок и акцепторный домен биотина, меченный Kv2.1, были описаны ранее (25, 35, 59).Вкратце, флуоресцентные белки прикреплены к N-концу канала, а акцепторный домен биотина (BAD) вставлен во внеклеточную петлю между первым и вторым трансмембранными доменами. Котрансфекцию биотинлигазой BirA в векторе pSec проводили, как описано ранее, для биотинилирования определенного лизина в последовательности BAD (35, 60, 61). Kv2.1 содержит два остатка метионина, разделенных пятью остатками, в начале кодирующей последовательности, каждый из которых был выбран в качестве исходной аминокислоты в различных публикациях.Таким образом, в литературе по Kv2.1 / KCNB1 в настоящее время используются две отдельные системы нумерации. Для согласованности между этой статьей и ранее опубликованной работой, касающейся последовательности Kv2, критической для кластеризации (29, 41), мы решили сохранить исходную нумерацию аминокислот, которая устанавливает второй метионин как аминокислоту 1. Синтетический полноразмерный Kv2. 2 была получена от Genewiz и вставлена в вектор экспрессии peGFP-C1 (Clontech). AMIGO в pDONR221 был получен из репозитория плазмид DNASU (плазмида ID HsCD00296150), и из этого AMIGO-YFP был создан с использованием сайтов разрезания ApaI и XhoI и помещения фрагмента AMIGO в вектор peYFP-N1.Дополнительные подробности относительно конструкции плазмиды представлены в SI Приложение , Дополнительные материалы и методы .

Культура клеток, трансфекция и маркировка поверхностных химер Kv2.1 и CD4.

Клетки HEK 293 [Американская коллекция типовых культур (АТСС), пассажи 45–48] культивировали, трансфицировали указанными конструкциями ДНК посредством электропорации и высевали на покрытые матригелем 35-миллиметровые чашки для покровного стекла со стеклянным дном, покрытые матригелем (Matsunami Glass Corporation), как описано ранее (13).Котрансфекцию BirA использовали для индукции биотинилирования BAD, содержащего конструкции Kv2.1, например GFP-Kv2.1-loopBAD. Визуализацию проводили через 24 часа после трансфекции. Чтобы пометить поверхность Kv2.1-loopBAD, клетки инкубировали с разведением 1: 1000 CF640-конъюгированного стрептавидина (CF640-SA) (Biotium) в течение 10 минут в физиологическом растворе HEK для визуализации [146 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl ₂, 0,6 мМ MgSO ₄, 1,6 мМ NaHCO ₃, 0,15 мМ NaH ₂ PO ₄, 0.1 мМ аскорбиновая кислота, 8 мМ глюкоза и 20 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота (Hepes), pH 7,4]. Несвязанный CF640-SA удаляли с помощью солевых растворов для визуализации. Химеры CD4 на клеточной поверхности специфически детектировались путем инкубации трансфицированных клеток с разведением 1: 1000 конъюгированных с CF640 анти-CD4-антител, нацеленных на внеклеточный эпитоп, в течение 10 мин.

Нейроны гиппокампа были изолированы от эмбриональных (E18) животных, подвергнутых глубокой анестезии с использованием изофлурана, в соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Университета штата Колорадо (идентификатор протокола: 15-6130A).Были собраны эмбрионы обоих полов, и, таким образом, культуры нейронов содержат смешанную популяцию мужских и женских клеток. Нейроны диссоциировали и культивировали, как описано ранее (13, 60, 61). На DIV7 чашки нейронов гиппокампа крысы промывали физиологическим раствором для нейрональной визуализации (NIS) (126 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 2,5 CaCl ₂, 0,6 мМ MgSO ₄, 0,15 мМ NaH ₂ PO ₄, 0,1 мМ аскорбиновой кислоты, 8 мМ глюкозы и 20 мМ Hepes, pH 7,4) с последующей инкубацией либо с CF640-конъюгированным стрептавидином, либо с антителом против CD4, как описано выше.При необходимости использовали моноклональные антитела против нейрофасцина для идентификации начального сегмента аксона. Здесь антитело против NF186 (Neuromab) использовали в разведении 1: 1000 в течение 10 минут с последующими двумя промываниями NIS и 10-минутной инкубацией с флуоресцентными (Alexa 594 или 647) вторичными антителами козы против мыши, разведенными 1: 1000. . Посуду трижды ополаскивали и сразу снимали.

Бесконтактное биотинилирование на основе APEX.

Беспорядочное биотинилирование компонентов соединения ER / PM осуществляли путем трансфекции клеток HEK с помощью AMIGO-YFP-APEX, в действительности APEX2 (62), с другими плазмидами или без них, как указано.Через 24 часа после трансфекции клетки инкубировали с 500 мкМ биотинфенола в DMEM + 10% FBS в течение 30 минут, обрабатывали 1 мМ H ₂ O ₂ в течение 1 минуты и затем фиксировали в 4% формальдегиде в течение 15 минут перед маркировка 2 нг / мл стрептавидина, конъюгированного с CF640 (CF640-SA), и последующая визуализация. Для вестерн-блот-анализа незакрепленные клетки соскребали с планшетов в PBS, содержащем полный мини-ингибитор протеазы (Roche), и центрифугировали, и осадок клеток ресуспендировали в SDS-геле, буфере для образцов Laemmli (Biorad), содержащем β-меркаптоэтанол.После обработки ультразвуком и кипячения в течение 10 мин неочищенные образцы фракционировали стандартным электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле на 10% геле. После переноса на нитроцеллюлозные мембраны белки исследовали либо мышиным анти-Kv2.1 (Neuromab) в разведении 1: 1000, либо мышиным антителом против AMIGO (Neuromab) в разведении 1: 1000. Связывание антител детектировали с помощью козьих антимышиных антител LiCor IRDye800CW. Биотинилированные белки детектировали с помощью стрептавидина LiCor IRDye 680RD в соотношении 1: 10 000.Визуализацию проводили с использованием двухцветной системы Odyssey CLx LiCor. Таким образом, любые биотинилированные резидентные белки ER были визуально отделены от любых потенциальных продуктов распада белка Kv2.1 или AMIGO.

Микроскопия.

Лазерная сканирующая микроскопия и микроскопия с вращающимся диском использовались в дополнение к визуализации TIRF. Если в подписях к рисункам не указано иное, использовалась система с вращающимся диском. Дополнительные сведения о микроскопии представлены в приложении SI , дополнительных материалах и методах и наших ранее опубликованных исследованиях (13, 60, 61).

FRET.

FRET с сенсибилизированной эмиссией, визуализированный в живых клетках, использовали пары Clover-Ruby2, проанализированные, как описано в ссылке. 63. Клетки HEK 293 трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (2 мкл; Invitrogen) и 100 мкл OptiMEM (Life Technologies) на чашку, используя следующие ДНК: 1 мкг Clover-Kv2.1, 1 мкг Ruby2-Kv2.1, 200 нг. pcDNA3.1-Clover-Ruby2 (тандем), 200 нг mClover-C1, 200 нг mRuby2-C1, 600 нг Ruby2-VAPA, 600 нг Ruby2-VAPAmut и 600 нг Ruby2-VAPB. Изображения FRET были получены на конфокальном микроскопе с вращающимся диском Olympus / Andor.Для каждой ячейки было собрано четыре изображения: ( i ) возбуждение с 488 нм в паре с полосовым фильтром 500/25 (изображение донора), ( II ) возбуждение с 488 нм в паре с полосовым фильтром 600/50 (FRET изображение), ( iii ) возбуждение 561 нм в паре с полосовым фильтром 600/50 (Acceptor image) и ( iv ) изображение DIC. Используя ImageJ, 15 представляющих интерес областей размером 3 на 3 пикселя (ROI) были помещены в кластеры Kv2.1 (или случайным образом в случае тандемных и растворимых условий), и была измерена интенсивность флуоресценции каждого канала.Клетки, экспрессирующие только конструкции донора (Clover) или акцептора (Ruby2), были визуализированы для расчета коэффициентов просачивания для расчетов эффективности FRET. Коэффициенты просачивания ( BT _Clover или BT _Ruby2) рассчитывались как средняя интенсивность канала FRET ( I _FRET ), деленная на среднюю интенсивность донора или акцептора ( I _Clover или I _Ruby2).Для наших экспериментальных условий BT _Clover = 11% и BT _Ruby2 = 4,3%. Хотя есть много вариантов для расчета FRET, мы решили использовать N _FRET из-за его поправки на уровни экспрессии донора и акцептора и его полезности при изучении межмолекулярных взаимодействий белков (64). Для расчета FRET ( N _FRET ) использовалась следующая зависимость, как описано ранее (63): NFRET = (IFRET-BTClover × IClover-BTRuby2 × IRuby2) √ (IClover × IRuby2).

изображений эффективности FRET были созданы с помощью калькулятора изображений в ImageJ и применения математических преобразований к FRET и изображениям донора и акцептора, как описано в уравнении выше. После выполнения всех преобразований к каждому изображению применялась королевская таблица поиска (LUT) в ImageJ.

Нокдаун VAPA и VAPB на основе siRNA.

Клетки HEK 293, помещенные либо в чашки для культивирования тканей диаметром 100 мм, либо в чашки для покровного стекла диаметром 35 мм, трансфицировали 250 нМ миРНК (Dharmacon), используя реагент для трансфекции DharmaFECT в соответствии с инструкциями производителя.Через 24 ч клетки на 35-миллиметровых чашках для покровного стекла снова трансфицировали siRNA и плазмидами GFP-Kv2.1-loopBAD и BirA, 1 мкг и 0,5 мкг, соответственно. Клетки на 100-миллиметровых чашках не получали плазмидную ДНК, кодирующую Kv2.1, во время второго раунда трансфекции миРНК. Еще через 24 ч клетки на 35-миллиметровых чашках для покровного стекла были визуализированы для оценки кластеризации Kv2.1, в то время как клетки на 100-миллиметровых чашках собирали, как описано выше для вестерн-блот-анализа экспрессии VAP.Инкубация с мышиными антителами против VAPA и -VAPB (разведения 1: 1000 и 1: 2000, MAB5820 и MAB58551, соответственно; R&D Systems) с последующим введением конъюгированных с HRP козьих антимышиных антител и обнаружение с помощью SuperSignal West Dura (продукт 34075; Thermo Scientific) были использованы для оценки экспрессии VAP в присутствии различных миРНК.

Обработка и анализ изображений.

Обработка изображений выполнялась с помощью ImageJ. Изображения были псевдоцветными, обрезаны и скорректированы по контрастности и яркости.Анализ изображений был выполнен с использованием программного обеспечения для анализа ImageJ или Volocity. Подробности, относящиеся к каждому эксперименту, представлены в Результатах или в подписях к рисункам. Если не указано иное, представлены одиночные конфокальные плоскости.

Экспериментальный план и статистический анализ.

Большинство наших экспериментов проводилось на клетках HEK 293 в отличие от культивируемых нейронов гиппокампа, поскольку эти клетки хорошо подходят для демонстрации межбелковых взаимодействий, которые происходят только в определенных компартментах живых клеток.Кроме того, в клетках HEK 293 отсутствуют субъединицы ионных каналов, которые могли бы собираться с экспрессируемыми конструкциями, и они менее гетерогены, чем культуры нейронов. Наша основная забота в отношении дизайна экспериментов была сосредоточена на вопросах сверхэкспрессии, поскольку экспрессия высокого уровня может вызывать взаимодействия белков, которые в противном случае не существовали бы. Уровни Kv2.1, экспрессируемые как в трансфицированных клетках HEK 293, так и в нейронах, аналогичны уровню эндогенного Kv2.1, как описано ранее (7, 9, 59), где иммуноокрашивание трансфицированных клеток сравнивали с окрашиванием эндогенного канала в культивируемые нейроны гиппокампа.Уровни экспрессии CD4-химеры были аналогичны уровням экспрессии эндогенных каналов. Мы не использовали более высокие уровни экспрессии, чтобы избежать потенциальных артефактов, и наша цель состояла в том, чтобы экспрессировать ровно столько флуоресцентных меченых белком VAP, чтобы действовать как индикатор для эндогенных белков, тем более, что любое перераспределение VAP теряется при сверхэкспрессии. Кроме того, сверхэкспрессия VAP изменяет морфологию ER, как описано ранее (33), чего мы не наблюдали с нашими уровнями экспрессии трансфицированных VAP. Обратите внимание, что высокие уровни экспрессии не были необходимы, учитывая чувствительность наших микроскопов TIRF и вращающегося диска, которые оба способны отображать отдельные молекулы.

Для статистического анализа был проведен односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) со специальными тестами Тьюки с использованием программного обеспечения Origin 2018b. Для данных, представленных на рис. 8, был проведен дисперсионный анализ Крускала – Уоллиса. Количество исследованных областей интереса и ячеек и значения P указаны в Результатах .

Благодарности

Мы благодарим Эмили Иден (Университетский колледж Лондона) и Диего Крапфа (Университет штата Колорадо) за полезные обсуждения и Энн Хесс (Статистическая лаборатория Graybill, Университет штата Колорадо) за помощь в проведении статистического анализа.Эта работа была поддержана грантом R01GM109888 Национального института здравоохранения (M.M.T.).

Сноски

Вклад авторов: B.J., A.N.L., L.S., E.E.M., T.P.L. и M.M.T. спланированное исследование; B.J., A.N.L., L..S., E.E.M. и M.M.T. проведенное исследование; T.P.L. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; B.J., A.N.L., L.S., E.E.M. и M.M.T. проанализированные данные; и B.J., A.N.L., L.S., E.E.M., T.P.L. и M.M.T. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.
См. Комментарий на стр. 7849.
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1805757115/-/DCSupplemental.

Арарат Василий Информация и факты

Фермер

Описание / вкус

Базилик араратский состоит из небольших листьев, в среднем от 5 до 8 сантиметров в длину, прикрепленных к толстым стеблям, образующих густое компактное растение.Листья от овальных до ланцетных, глянцевые, текстурированные, с глубокими прожилками и слегка зазубренными краями. Листья также имеют пестрые оттенки темно-пурпурного и зеленого, в зависимости от климата и окружающей среды, что придает растению необычный пестрый вид. Бордовые стебли полутолстые, волокнистые и мясистые, а когда растение цветет, на концах стеблей появляются маленькие и эффектные розово-пурпурные цветки. Араратский базилик обладает выраженным анисовым ароматом. Листья нежные, хрустящие и сочные, содержат сладкий и пряный, теплый травяной аромат с растительными нюансами и оттенками лакрицы.

Сезоны / Наличие

Араратский базилик доступен круглый год, пик сезона приходится на лето.

Текущие факты

Араратский базилик, ботанически классифицируемый как Ocimum basilicum, — редкое ароматное растение, принадлежащее к семейству Lamiaceae или мяты. Базилик семейной реликвии был разработан в середине 20 века в Израиле и был выбран из-за его необычного внешнего вида и отчетливого вкуса солодки. Араратский базилик достигает 45 сантиметров в высоту, растет во всем мире в теплом и умеренном климате, а любители базилика предпочитают его за его двухцветную листву.Растения выращивают в домашних садах, чтобы добавить глубины и цвета, а листья также собирают для использования в лечебных и кулинарных целях. Араратский базилик обычно добавляют в свежем виде и готовят как в сладких, так и в соленых блюдах, а листья также используются в качестве съедобного гарнира из-за их привлекательного внешнего вида.

Пищевая ценность

Базилик является отличным источником витамина К, который способствует более быстрому заживлению ран, витамина С для укрепления иммунной системы и железа для создания протеина гемоглобина для транспортировки кислорода через кровоток.Ароматная зелень также является хорошим источником магния для поддержания здорового функционирования нервов, кальция для защиты костей и зубов и калия для баланса жидкости в организме. В натуральных лекарствах базилик ценится за его антоцианы, пигменты, содержащиеся в листьях, которые обладают антиоксидантными свойствами для удаления токсинов из организма. Листья также считаются успокаивающим средством и обладают антибактериальными свойствами для защиты от инфекций.

Приложения

Араратский базилик обладает сладким, травяным и анисовым вкусом, который хорошо подходит в качестве гарнира или для придания легкого вкуса свежим и приготовленным блюдам.Редкий базилик можно использовать в качестве заменителя в рецептах, требующих фиолетового или зеленого базилика, а зелень можно использовать целиком, нарезать, порезать или нарезать. Араратский базилик обычно добавляют в садовые салаты, размешивают в фруктовых тарелках, плавают над супами и карри, смешивают с соусом песто или добавляют в заправки, соусы и уксус. Зелень также можно использовать в качестве начинки для пиццы, смешивать с макаронами на томатной основе, накладывать слоями в бутерброды, обжаривать в сливочном соусе или слегка обжаривать в овощах, лапше и блюдах из риса.Помимо пикантных блюд, араратский базилик можно добавлять в мороженое, шербеты, шоколад и торты для придания вкуса лакричнику. Его также можно сушить для длительного использования и смешивать со специями или использовать для украшения коктейлей, чая и лимонада. Двухцветные листья дополняют ароматы, обычно встречающиеся в итальянской, тайской и французской кухне. Араратский базилик хорошо сочетается с помидорами, картофелем, капустой, кабачками, сырами, такими как пармезан, фета и пекорино, орехами, такими как сосна, миндаль и грецкие орехи, мясом, таким как птица, индейка и рыба, и фруктами, такими как цитрусовые, арбуз , клубника и манго.Свежий араратский базилик хранится до одной недели при хранении в вертикальном положении в стакане воды и неплотно накрытом полиэтиленом в холодильнике. Листья также можно зажать между бумажными полотенцами и хранить в пластиковом пакете в течение нескольких дней в ящике для свежих продуктов холодильника.

Этническая / культурная информация

Название Арарат происходит от иврита и, как полагают эксперты, означает область священной земли. Самая известная ссылка на название Арарат связана с историей о Ноевом ковчеге. Легенда гласит, что ковчег приземлился в горном хребте, когда-то известном как горы Арарат.Помимо мифов, базилик глубоко переплетен с еврейским фольклором и, как считалось, придает силу постящимся. Считалось, что яркий травяной ароматизатор помогает утолить голод, и многие еврейские общины создавали гирлянды из базилика для ношения во время поста. В наши дни базилик все еще входит в традиционные еврейские обычаи и связывается в небольшие букеты, чтобы вдохнуть мощный аромат для определенных фестивалей и торжеств.

География / История

Базилик — это древняя трава, которую люди выращивали на протяжении тысячелетий.Эксперты полагали, что ароматическое растение возникло в Азии и распространилось через миграцию людей и торговые пути. Базилик был завезен в Израиль и на остальную часть Ближнего Востока в ранние века, где он стал распространенной травой, используемой в религиозных и лечебных практиках. Растение также широко культивировалось, со временем появилось много новых сортов. В 1950-х годах базилик Арарат был выведен в Израиле как улучшенный сорт, демонстрирующий уникальную двухцветную листву и богатый аромат. Сегодня базилик Арарат продается в основном через семена и через интернет-компании по всему миру.Ароматические листья иногда продаются на местных рынках и в специализированных продуктовых магазинах в Европе, Азии, на Ближнем Востоке и в Соединенных Штатах, и этот сорт также является любимым сортом домашнего сада, выращиваемым энтузиастами базилика.

Заменитель соли снижает частоту инсультов и сердечных приступов | The Ararat Advertiser

life-style,

Согласно новому исследованию, опубликованному в Медицинском журнале Новой Англии, «заменитель соли» с пониженным содержанием натрия и калием снижает частоту инсультов, сердечных приступов и смертей.Исследователи из Института глобального здравоохранения Джорджа показали, что заменитель соли с большим содержанием хлорида калия и меньшим количеством хлорида натрия — «обычная» поваренная соль — приводит к снижению артериального давления и уменьшению проблем с сердцем без вредных последствий. «Почти каждый в мире ест больше соли, чем должен, — говорит ведущий автор Брюс Нил. — Каждый мог бы перейти на заменитель соли, если бы заменители соли были на полках супермаркетов. «Еще лучше, хотя заменители соли немного дороже, чем обычная соль, они по-прежнему очень дешевы — всего несколько долларов в год, чтобы перейти на новый продукт.«Наше исследование не только демонстрирует явную пользу для важных результатов для здоровья, но и снимает опасения по поводу возможных рисков. Мы не обнаружили признаков какого-либо вреда от добавления калия в заменитель соли. Конечно, пациентам с серьезным заболеванием почек не следует использовать заменители соли, но им также нужно держаться подальше от обычной соли «. В исследовании приняли участие 21000 взрослых, перенесших инсульт или проблемы с артериальным давлением, из 600 сельских китайских деревень в 2014/15 году. Для тех, кто использовал соль с низким содержанием натрия, команда обнаружила, что количество случаев инсульта снизилось на 14%, общее количество сердечно-сосудистых событий (включая сердечный приступ) снизилось на 13%, а преждевременная смерть снизилась на 12%.Они также показали, что разница в цене между поваренной солью и заменителем невысока — 1,48 доллара за килограмм для обычной соли по сравнению с 2,22 доллара за килограмм для соли с низким содержанием натрия. «В прошлом году модельное исследование, проведенное для Китая, показало, что ежегодно можно предотвращать около 400 000 преждевременных смертей за счет национального потребления заменителя соли, — говорит Нил. — Наши результаты теперь подтверждают это. Если бы во всем мире заменили соль заменителем соли, ежегодно можно было бы предотвратить несколько миллионов преждевременных смертей.«Это просто самое ценное исследование, в котором я когда-либо участвовал. Замена поваренной соли на заменитель соли — это вполне осуществимая и недорогая возможность принести огромную пользу здоровью во всем мире». Из-за этого результата исследователи призвали производителей соли перейти на соль с низким содержанием натрия, а правительства — проводить политику, продвигающую заменители соли.

/images/transform/v1/crop/frm/123151812/2282e155-a3aa-4e46-9556-f724cb603382.jpg/r0_191_6240_3717_w1200_h678_fmax.jpg

2 сентября 2021 — 10:00 утра

«Заменитель соли» с пониженным содержанием натрия и калием снижает частоту инсульта, сердечного приступа и смерти, согласно новому исследованию, опубликованному в журнале The New England Journal of Medicine. .

Исследователи из Института глобального здравоохранения Джорджа показали, что заменитель соли с большим содержанием хлорида калия и меньшим содержанием хлорида натрия — «обычная» поваренная соль — приводит к снижению артериального давления и уменьшению проблем с сердцем без вредных последствий.

«Почти каждый в мире ест больше соли, чем должен», — говорит ведущий автор Брюс Нил.

«Переход на заменитель соли — это то, что мог бы сделать каждый, если бы заменители соли были в супермаркете. полки.

«Еще лучше, хотя заменители соли немного дороже, чем обычная соль, они все еще очень дешевы — всего несколько долларов в год, чтобы перейти на новый уровень.

» Кроме того, они демонстрируют явные преимущества для важного здоровья результаты, наше исследование также развеивает опасения по поводу возможных рисков.Мы не увидели никаких признаков вреда от добавления калия в заменитель соли. Конечно, пациенты с серьезным заболеванием почек не должны употреблять заменители соли, но им также следует воздерживаться от обычной соли ».

Исследование проводилось с участием 21 000 взрослых, перенесших инсульт или проблемы с артериальным давлением в анамнезе. из 600 сельских китайских деревень в 2014/15 г.

Для тех, кто использовал соль с низким содержанием натрия, команда обнаружила, что количество случаев инсульта снизилось на 14%, общее количество сердечно-сосудистых событий (включая сердечный приступ) снизилось на 13%, а число преждевременных смертей снизилось на 12%.

Они также показали, что разница в цене между поваренной солью и заменителем была низкой — 1,48 доллара за килограмм для обычной соли по сравнению с 2,22 доллара за килограмм для соли с низким содержанием натрия.

«В прошлом году модельное исследование, проведенное для Китая, показало, что ежегодно около 400 000 преждевременных смертей можно предотвращать за счет национального потребления заменителя соли», — говорит Нил.

«Наши результаты теперь подтверждают это. Если бы во всем мире заменили соль заменителем соли, ежегодно можно было бы предотвратить несколько миллионов преждевременных смертей.

«Это просто одно из самых ценных исследований, в которых я когда-либо участвовал. Переход поваренной соли на заменитель соли — это вполне осуществимая и недорогая возможность принести огромную пользу для здоровья во всем мире. . »

Из-за этого результата исследователи призвали производителей соли перейти на соль с низким содержанием натрия, а правительства — проводить политику, продвигающую заменители соли.

Эта статья опубликована в партнерстве с Cosmos Magazine.»Космос» производится Королевским институтом Австралии.

Атаракс Пероральный: применение, побочные эффекты, взаимодействия, изображения, предупреждения и дозировка

Перед приемом гидроксизина сообщите своему врачу или фармацевту, если у вас на него аллергия; или цетиризину; или левоцетиризину; или если у вас есть другие аллергии. Этот продукт может содержать неактивные ингредиенты, которые могут вызвать аллергические реакции или другие проблемы. Поговорите с вашим фармацевт для получения более подробной информации.

Перед использованием этого лекарства расскажите своему врачу или фармацевту о своей истории болезни, особенно о: проблемах с дыханием (таких как эмфизема, астма), высоком давлении в глазах (глаукома), высоком кровяном давлении, проблемах с почками, проблемах с печенью, судорогах, Проблемы с желудком / кишечником (например, язва, закупорка), гиперактивность щитовидной железы (гипертиреоз), затрудненное мочеиспускание (например, из-за увеличения простаты).

Hydroxyzine может вызвать состояние, которое влияет на сердечный ритм (удлинение интервала QT). Удлинение интервала QT редко может вызывать серьезные (редко со смертельным исходом) учащенное / нерегулярное сердцебиение и другие симптомы (например, сильное головокружение, обмороки), которые требуют немедленной медицинской помощи.

Риск удлинения интервала QT может увеличиваться, если у вас есть определенные заболевания или вы принимаете другие препараты, которые могут вызвать удлинение интервала QT. Прежде чем принимать гидроксизин, сообщите своему врачу или фармацевту обо всех принимаемых вами лекарствах, и если у вас есть какие-либо из следующих состояний: определенные проблемы с сердцем (сердечная недостаточность, медленное сердцебиение, удлинение интервала QT на ЭКГ), семейный анамнез определенных проблем с сердцем (QT пролонгирование ЭКГ, внезапная сердечная смерть).

Низкий уровень калия или магния в крови также может увеличить риск удлинения интервала QT. Этот риск может возрасти, если вы принимаете определенные лекарства (например, диуретики / «водные таблетки») или если у вас есть такие состояния, как сильное потоотделение, диарея или рвота. Поговорите со своим врачом о безопасном приеме гидроксизина.

Этот препарат может вызвать у вас головокружение, сонливость или помутнение зрения. Алкоголь или марихуана (каннабис) могут вызвать у вас головокружение или сонливость. Не садитесь за руль, не пользуйтесь механизмами и не делайте ничего, что требует бдительности или ясного зрения, пока вы не научитесь делать это безопасно.Избегайте алкогольных напитков. Поговорите со своим врачом, если вы употребляете марихуану (каннабис).

Перед операцией расскажите своему врачу или стоматологу обо всех продуктах, которые вы используете (включая рецептурные лекарства, лекарства, отпускаемые без рецепта, и растительные продукты).

Жидкие продукты могут содержать сахар и / или спирт. Рекомендуется соблюдать осторожность, если у вас диабет, заболевание печени или любое другое состояние, которое требует от вас ограничения / отказа от этих веществ в своем рационе. Спросите своего врача или фармацевта о безопасном использовании этого продукта.

Дети могут быть более чувствительны к побочным эффектам этого препарата. Этот препарат часто может вызывать у маленьких детей возбуждение, а не сонливость.

Пожилые люди могут быть более чувствительны к побочным эффектам этого препарата, особенно к сонливости, спутанности сознания, запорам, проблемам с мочеиспусканием или удлинению интервала QT (см. Выше). Сонливость и спутанность сознания могут увеличить риск падения.

Во время беременности этот препарат следует использовать только в случае крайней необходимости. Обсудите риски и преимущества с вашим врачом.

Неизвестно, проникает ли этот препарат в грудное молоко. Перед кормлением грудью проконсультируйтесь с врачом.

Активизация антибиотиков | Feature

В почве горы Арарат, Турция, живут бактерии, которые дали последний по-настоящему новый класс антибиотиков. ¹ Вычерпанные и отправленные в лаборатории фармацевтического гиганта Eli Lilly в Индианаполисе, США, составы, на которые были созданы микробы, разрабатывались в течение 1980-х и 1990-х годов. Но когда полученный кандидат в лекарство — липопептид с общим названием даптомицин (торговое название кубицин) — прошел клинические испытания, внутривенная доза, необходимая для эффективного лечения инфекции, также повредила мышцы пациентов.При поддержке тогдашнего вице-президента Lilly по обнаружению инфекционных заболеваний Барри Эйзенштейна компания отложила это лекарство. Затем, в середине 1990-х, он полностью прекратил исследования натуральных антибиотиков, многие исследователи покинули компанию, в том числе Эйзенштейн, а даптомицин остался в подвешенном состоянии.

В то же время похожие истории разворачивались во всей фармацевтической отрасли, когда ведущие компании сокращали исследования как натуральных продуктов, так и антибиотиков. Но, как показали далее Эйзенштейн и его коллеги, при этом они отказались от мощных потенциальных боеприпасов для битвы между бактериями и людьми.Теперь Всемирная организация здравоохранения предупреждает о «постантибиотической эре, когда обычные инфекции и легкие травмы, которые лечились десятилетиями, снова могут убивать». С такими предупреждениями, вызывающими библейские пророчества, уместно, что интерес снова растет к соединениям, подобным тому, что обнаружено на Арарате, где, как сказано в Ветхом Завете, приземлился Ноев ковчег. Ученые обращаются к пептидам, чтобы сдерживать поток устойчивых бактерий.

Пептидные цепи использовались в антибиотиках с тех времен, когда их открытия регулярно делались из почвы.Хотя ванкомицин, структура которого объединяет аминокислоты и сахарные кольца, был открыт в 1953 году, мы не открывали, насколько важны немодифицированные пептидные цепи для борьбы с бактериями до 1980 года. были обнаружены во всех многоклеточных организмах, где они играют ключевую роль в системе врожденного иммунитета. «Почему насекомые хорошо обходятся без антител и лимфоцитов?» — спрашивает Пол Хансен из Копенгагенского университета в Дании.«Потому что они содержат антимикробные пептиды».

Разрушение клеточных стенок

AMP часто быстро убивают как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии. Это важно, потому что отрицательный результат окрашивания по Граму указывает на высокий уровень липополисахарида эндотоксина в стенках бактериальных клеток, что стимулирует иммунный ответ, ответственный за лихорадку и другие симптомы. Никакого нового класса антибиотиков, эффективных против грамотрицательных видов, не было обнаружено со времени появления фторхинолонов в 1960-х годах.Не менее важно, учитывая, что устойчивость к некоторым новым лекарствам возникла вскоре после того, как они вышли на рынок, считается, что AMP нелегко создать устойчивые к лекарствам мутантные штаммы.

AMP обычно связываются со стенками бактериальных клеток и либо пробивают в них дыры, либо проникают сквозь них и атакуют внутренние цели. «Бактериальная мембрана заряжена отрицательно, и большинство антимикробных пептидов являются гидрофобными и катионными», — говорит Хансен. «Это означает, что они электростатически притягиваются к бактериальной мембране.Клетка животных, как правило, цвиттерионная и содержит много холестерина в мембране, а это означает, что она не так активна против них. в клетках человека остается проблемой. Тем не менее, специалист по антибиотикам Cubist Pharmaceuticals из Лексингтона, США, по-прежнему считал, что было бы полезно, если бы можно было улучшить баланс антибактериального действия и повреждения мышц.После лицензирования даптомицина от Eli Lilly в 1997 году Cubist преследовал один особенно важный ключ к достижению этой цели: в исследованиях на животных одна большая однократная доза, а не две дозы в день, минимизировала повреждение мышц.

«Даптомицин действует путем агрегирования в присутствии ионов кальция», — объясняет Эйзенштейн, который сейчас является старшим вице-президентом кубистов по научным вопросам. «В результате образуются поры, которые вызывают деполяризацию бактерий за счет потери внутренних ионов калия, тем самым останавливая синтез ДНК, РНК и белка.Эффективность антибиотика напрямую зависит от концентрации антибиотика. Напротив, мышечные клетки млекопитающих повреждаются не при концентрации, а при длительном воздействии препарата без восстановления. Таким образом, менее частые, но более высокие дозы одновременно повышают эффективность и снижают мышечную токсичность ». Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило даптомицин для использования при кожных и тканевых инфекциях в сентябре 2003 года и для Staphylococcus aureus в крови в мае 2006 года.

Вернувшись из безвестности

Другие теперь надеются последовать примеру кубистов по возрождению кандидатов, ранее отброшенных во время разработки.Например, компания Dipexium Pharmaceuticals в Нью-Йорке, США, была создана специально для вывода на рынок Локилекса (пексиганана), 22-аминокислотного АМФ, впервые выделенного из кожи африканской когтистой лягушки. Пексиганан разрабатывается как крем для лечения диабетической стопы. Дипексиум приобрел права в 2010 году после того, как FDA отклонило заявку на новое лекарство от ныне несуществующей компании Magainin Pharmaceuticals в 1999 году.

Мы планируем подать заявку на новое лекарство в следующем году

Дэвид Люси

‘Это было единогласно одобрено с точки зрения безопасности », — отмечает главный исполнительный директор Dipexium Дэвид Люси.Однако FDA вызвало — несправедливо в глазах Магайнина — другое, плацебо-контролируемое испытание, а также выразило озабоченность по поводу производства. «Одним из них было отделение воды в сливках», — говорит Люси. «Другой — более 5% примесей в активном фармацевтическом ингредиенте». Эти проблемы связаны с более общей проблемой производства AMP: если они производятся химическим путем, а не путем ферментации, как даптомицин, они будут слишком дорогими. Тем не менее Люси отрицает, что трудоемкая последовательность добавления амино-защищенных остатков и последующего снятия защиты с них обходится дорого.

«Пептид стоит дешево, как чипсы», — говорит он. «Мы наняли полипептидные лаборатории для производства активного фармацевтического ингредиента в соответствии с сегодняшними производственными стандартами, которые намного более развиты, чем 15 лет назад. В них примеси не превышают 2%. Проблема физической нестабильности также была решена лабораторией DPT, подразделением Smith and Nephew. Все, что осталось, — это плацебо-исследование фазы III. Сейчас мы проводим эти исследования и планируем подать новую поправку к заявке на лекарство во второй половине следующего года.«Состав в виде крема для кожи не только сводит к минимуму токсические побочные эффекты, связанные с механизмом разрушения мембран пексиганана, но и предотвращает системную резистентность, поскольку не имеет системного воздействия», — объясняет Люси.

Перенаправление утилизации мусора

Ацилдепсипептиды (ADEP) — это еще один взрыв из прошлого, впервые заявленный в патентной заявке, поданной Lilly в 1982 году. Они производятся бактериями, собранными в каньоне Аризоны, Bayer Healthcare пересмотрела их в 2000-х годах, когда Срок действия патентов Лилли истек.«Соединения, полученные из бактерии, были совершенно неэффективны в моделях инфекции на мышах, поэтому Байер инициировал программу медицинской химии», — говорит Джейсон Селло из Университета Брауна в Провиденсе, США.

Байер обнаружил, что ADEP убивают бактерии иначе, чем AMP. «Они связывают пептидазу под названием ClpP, которую мы думаем как утилизация мусора для клеток», — говорит Селло. «Когда белки синтезированы не полностью и помечены для разложения, они расщепляются ClpP. ADEP нацелены на ClpP, и связывание позволяет ферменту расщеплять неструктурированные пептиды и некоторые белки, которые не были помечены для деградации.Представьте, что мусоропровод на вашей кухне открывается и пережевывает все, что находит. сердце молекулы. Это снижает потерю энтропии, когда ADEP связывает ClpP, делая взаимодействие более энергетически выгодным. В поисках таких дальнейших улучшений команда Брауна добавила дополнительные заместители к пипеколиновой кислоте и еще одной ключевой аминокислоте.

«Ригидифицированные ADEP в семь раз лучше, чем природные продукты, связывающиеся с ClpP и активирующие пептидолитическую активность в пробирке. Однако эти изменения улучшили эффективность ADEP в антибактериальных анализах в 1200 раз », — говорит Селло. ² Он считает, что этот скачок произошел благодаря тому, что ADEP лучше проникают в клетки. Повышение жесткости усиливает водородные связи, которые образуются между разными сторонами кольца, уменьшая образование водородных связей с водой. Менее тесно связанные с окружающей водой соединения легче проникают в бактериальные клетки.

Университет Брауна в настоящее время разрабатывает лицензионные соглашения в надежде на установление партнерских отношений между отраслью и академическим сообществом. Почему теперь это могло быть успешным, когда интерес Лилли и Байер угас? Селло признает, что фармацевтика отошла от программ натуральных продуктов, «которые должны существовать сегодня», и предполагает, что компании также отталкивает дорогостоящая репутация пептидов. Однако он цитирует Halaven (эрибулин), поликетидный противораковый препарат, полученный из морских губок, который японская фирма Eisai производит с помощью 62-ступенчатого синтеза.«Халавен невероятно мощный, поэтому дозировка очень мала», — говорит Селло. «Наш ADEP также чрезвычайно эффективен, поэтому необходимое количество может быть особенно низким».

Срочная угроза

Структурная модификация также была важна для кубистов, даже несмотря на то, что даптомицин производится путем бактериального брожения. Мы почти готовы пожинать плоды от сосредоточения на Clostridium difficile , которые Центры по контролю и профилактике заболеваний США классифицируют как «неотложную угрозу».После существующей терапии непептидом C. difficile -ассоциированной диареи (CDAD) Дифицидом (фидоксамицином) его исследуемый пероральный антибиотик суротомицин, тесно связанный с даптомицином, проходит III фазу испытаний для того же заболевания.

«Целью оптимизации суротомицина было повышение эффективности молекулы липопептида против организма-мишени без повышения эффективности против нормального микробиома желудочно-кишечного тракта», — говорит Эйзенштейн. «Наши усилия по созданию аналогов поддерживали каркас даптомицина и проводились либо путем полусинтеза — химической модификации хвостовой и аминокислотной боковых цепей — либо путем биосинтетического сопоставления (модификация генов в организме-продуценте).’

Суротомицину был присвоен статус квалифицированного препарата для лечения инфекционных заболеваний (QIDP), недавнее определение FDA, которое ускоряет процесс рассмотрения. По словам Эйзенштейна, оказывают влияние и другие новые стимулы, такие как возможное продление эксклюзивности маркетинга на пять лет. «В последние годы более благоприятная нормативно-правовая среда помогла создать некоторую тягу к восстановлению интереса к этой области и укреплению конвейера».

Molecular Lego

Тем не менее, многие крупные фармацевтические компании не участвуют в разработке антибиотиков.Хансен видит в этом проблему, хотя он понимает, что новые лекарства, вероятно, будут оставлены в резерве, отталкивает их. Поэтому его команда стремится удовлетворить серьезную неудовлетворенную потребность в новых антибиотиках для грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa . Вместо того, чтобы возродить старую молекулу свинца, химики из Копенгагенского университета начали с аноплина, AMP, обнаруженного в яде ос в 2001 году и состоящего всего из 10 аминокислот.

«Мы искали небольшие пептиды, для которых можно было бы провести исследования структуры и активности, чтобы выяснить, какие аминокислоты важны», — говорит Хансен.Его команда начала с замены каждой аминокислоты аланином, чтобы увидеть, как боковые цепи способствуют его активности. «Как только вы поймете, какие из них важны, вы можете поиграть в« молекулярное Лего », чтобы улучшить? -Активность».

Как и другие АМП, аналоги аноплина, по-видимому, разрушают мембраны бактериальных клеток. «Самая большая проблема в том, что трудно отстраниться от активности против красных кровяных телец», — признает Хансен. «Вам также нужна селективность против некоторых других патогенов». Подобно Люси и Селло, он не считает, что стоимость пептидов должна быть проблемой, ссылаясь на введение компанией «Рош» пептидного препарата против ВИЧ Фузеон (энфувиртид).«Они синтезировали его в тоннах, и цена на пептидные реагенты резко упала. Возможно, то же самое произойдет, если популярны антибиотики на основе пептидов ».

Еще одна проблема, с которой сталкиваются пептидные препараты, заключается в том, что они будут расщепляться ферментами пептидазы в организме, прежде чем убьют достаточное количество бактерий. Эту угрозу можно минимизировать, преобразовав пептиды в форму, которую пептидазы не распознают, как показала группа Хансена, производя аналоги пептоидного аноплина. ³ «Пептоиды перемещают боковую цепь пептида от α-углерода к азоту в основной цепи», — поясняет он.«Они намного более устойчивы к протеолитическому перевариванию».

Наконец-то безопасны

Хотя путь от университетских исследований к пептидным антибиотикам, которые являются реальным медицинским вариантом, нелегок, Polyphor теперь соблазнительно близок к тому, чтобы продемонстрировать это может быть сделано. Основанная в Альшвиле, Швейцария, в 1996 году, компания Polyphor использует платформу для разработки лекарств Protein Epitope Mimetics (PEM), которую она разработала вместе с Джоном Робинсоном из Цюрихского университета. PEM представляют собой циклические молекулы, аминокислотные цепи, концы которых соединены вместе тем, что Polyphor называет «шаблоном», таким как дипептид d-пролин – 1-пролин.Многие AMP обладают похожей структурой ß-шпильки, поэтому они стали логической отправной точкой для исследований, — объясняет Дэниел Обрехт, главный научный сотрудник Polyphor.

«Наш очень эффективный процесс параллельного синтеза позволяет нам быстро оптимизировать структурные и физико-химические свойства PEM», — говорит Обрехт. «Вы можете оптимизировать шаблон, строительные блоки, но, как вы понимаете, существует множество возможных вариантов, поэтому вам нужна управляемая оптимизация. Это сочетание анализа данных, интуиции и знаний медицинских химиков, которые на самом деле оптимизируют молекулы?.’

Исходя из AMP-протегрина I, компания Polyphor с использованием этого подхода произвела свинцовое соединение, известное как POL7080. «Мы фактически открыли новый специфический для бактерий механизм, отличный от типичных антимикробных пептидов», — говорит Обрехт. ⁴ «Наша молекула не разрушает мембрану, а нацелена на транспорт липополисахарида, который специфичен для грамотрицательных бактерий. Это определенно новый способ действия, поэтому он не принадлежит ни к какому другому классу антибиотиков.’

Новый механизм позволяет POL7080 избежать проблем токсичности, которые, по словам Обрехта, придают «дыроколам» образный «неоднозначный запах». Polyphor также заявляет, что молекулы PEM можно оптимизировать, чтобы они были стабильными против протеолитической деградации и производились «экономически эффективно с помощью хорошо отлаженного и масштабируемого процесса синтеза». Благодаря этим преимуществам Polyphor в настоящее время является партнером компании Roche в рамках фазы II испытаний внутривенного введения POL7080 против P. ? aeruginosa ? Инфекции.

«В обсуждениях с фармацевтическими компаниями было очень важно показать, что наши молекулы разные и безопасны», — говорит Обрехт. «На стадии исследования у нас есть другие антибиотики PEM, которые подтверждают утверждение, что POL7080 не является отдельным соединением, а на самом деле является новым развивающимся классом лекарств. И у нас есть четкие доказательства того, что вы можете связаться с другими штаммами грамотрицательных бактерий. Все это вместе показывает, насколько замечательным было это открытие ».

Решимость ученых и инновационных фармацевтических компаний на переднем крае исследований пептидных антибиотиков показывает, что резкие предупреждения ВОЗ не останутся незамеченными.Однако возрождение идей, которые ранее были связаны с токсичностью и отвергнуты, может показаться не самой многообещающей моделью открытия лекарств в долгосрочной перспективе. По крайней мере, AMP и родственные молекулы поддерживают надежду на то, что современная медицина останется на плаву, несмотря на растущую волну устойчивости бактерий. Но на самом деле они представляют собой нечто большее, чем просто отчаянное ведение дела — они демонстрируют, как современная наука решает проблемы, которые в прошлом было слишком сложно решить.

Энди Экстэнс, научный писатель из Эксетера, Великобритания

Что ждет артезианский бассейн в Араратской долине, озере Севан и реках в результате изменения климата и антропогенного воздействия

Каковы тенденции уменьшения и изменения качества ресурсов подземных вод в Араратской долине, какова потребность сообществ в воде, сколько воды они получают из-за потерь воды, каковы угрозы озеру Севан, реки можно очистить от горных сточных вод?

Лиана Маргарян, эксперт по качеству воды 4-го национального сообщения ПРООН по изменению климата, выступила с докладом по этим и другим вопросам на круглом столе на тему «Водная безопасность в Армении при прогнозном сценарии климата», который прошел 30 марта в пресс-клубе ЭкоЛур.

Лиана Маргарян отметила тенденцию к сокращению ресурсов подземных вод Араратской долины. По его словам, превышен средний допустимый объем водозабора — 1094,1 тыс. Кубометров, соответственно, составив 1753,4 тыс. Кубометров в 2013 году и 1608,50 тыс. Кубометров в 2016 году. Параллельно изменилось качество воды.

«С понижением уровня грунтовых вод повысился уровень минерализации воды.Такая картина наблюдалась в результате исследований питьевой воды в 16 селах Масисского района и 9 селах Армавирского района. Исследования показали, что подземные воды в Араратской долине характеризуются высокой минерализацией с преобладанием кальция, магния и углеводородов. Максимальное содержание минерализации в колодезной воде наблюдалось в поселке Мясникян, где минерализация составляла около 2000 мг / л, а жесткость — 20 мг-экв / л.

По сравнению с 1981 годом минерализация воды увеличилась на 1.2-1,8 раза в 2017 году. Наибольшая площадь наблюдалась в районе Масиса, где концентрации калия, натрия и хлоридов в воде увеличились в 1,7-2,3 раза. Это связано с понижением водного горизонта артезианского бассейна. Большое использование воды привело к изменению качественного состава », — сказал спикер.

По ее словам, одним из изменений качества питьевой воды является повышение уровня жесткости. Общая жесткость воды в колодцах Масисского района превышала норматив качества питьевой воды (7 мг-экв / л) на 1.В 5-1,8 раза, в Армавирской области — в 1,3-2,5 раза. Из-за отсутствия других источников питьевой воды Минздрав увеличил норму для Араратской долины с 7 мг-экв / л до 15 мг-экв / л. Общая жесткость колодезной воды общины Мясникян Армавирской области в 2,9 раза превышает армянский стандарт качества питьевой воды. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций, норма минерализации оросительной воды составляет 2000 мг / л.

«Вроде можно использовать для полива, но в случае выше 1000 мг / л необходимо применять специальный режим полива, иначе почва будет засолена», — сказал спикер.По словам Лианы Маргарян, если уровень воды снизится или артезианский бассейн не будет постоянно восстанавливаться, качество воды будет продолжать ухудшаться, что в конечном итоге приведет к непригодности питьевой воды не только в Мясникянской общине, но и в ряде других общин.

Изменение климата меняет качество поверхностных вод и количество воды, используемой для питья. Оценка этих изменений дана на примерах рек из общин Геги, Мегри и Мармарик.

Изучены характеристики изменения количества и количества водоподачи из рек Геги, Мегри, Мармарик. По ее словам, ежегодно из реки Геги забирается около 19,3 миллиона кубометров воды, чтобы обеспечить 80% водоснабжения из реки Геги в город Капан Сюникской области, но потери воды в системе составляют 75-78%.

«Фактически, средний объем водоснабжения составляет всего 4,5 миллиона кубометров. Водоснабжением пользуются около 40 283 жителей.Количество воды на душу населения в день составляет 54,4 литра, что примерно в 3,7 раза меньше необходимого по норме, установленной в Республике Армения (200-250 литров в день). Согласно прогнозам глобального потепления, естественный сток у истока реки Гехи в 2040, 2070 и 2100 годах уменьшится на 5-8%, 10-15% и 18-25% соответственно. Поэтому в условиях этих потерь воды риск водоснабжения Капана очень высок, необходимо принять меры адаптации », — сказал Маргарян.

Аналогичные изменения наблюдаются и с водоснабжением в Мегри. «Около 3,5 миллионов кубометров воды ежегодно перекачивается из реки Мегри для питьевых и хозяйственных нужд 90% населения Мегри, но из-за потерь воды 73-82%, только около 0,79 миллиона кубометров воды подается на 4700 человек. жителей. Количество воды на душу населения составляет 460 литров в сутки, что примерно в 2,3 раза больше необходимого. По прогнозам, в условиях глобального потепления уменьшение естественного стока в истоке реки Мегри в 2040, 2070 и 2100 годах будет составляют 8-9%, 16% и 26-27% соответственно.

Даже при наихудшем сценарии, если количество воды уменьшится на 26-27% в 2100 году, доли воды будет достаточно для удовлетворения питьевых и хозяйственных нужд. Однако это не означает, что мы можем использовать его с большой интенсивностью и иметь такие большие потери воды.

Ежегодно из реки Мармарик забирается около 3,6 млн кубометров воды для питьевого и хозяйственно-питьевого снабжения в рекреационных зонах сел Анкаван, Агавнадзор, Меградзор (в Анкаване и Цахкадзоре), но потери воды составляют 80%, всего около 0.В Цахкадзор поставляется 72 миллиона кубометров, из которых 0,19 миллиона кубометров доходит до города: 6306 жителей получают воду. Количество воды на душу населения составляет 313 л / сутки, что примерно в 1,5 раза больше нормы, установленной в Республике Армения (200-250 л / сутки). Для естественного стока в источнике Мармарик прогнозируется снижение на 2-4% в 2040 году и на 4-5% и 6-12% в 2070 и 2100 годах соответственно », — сказала она.

Лиана Маргарян отметила, что качество воды этих поверхностных источников в 2007-2018 годах также изучалось и сравнивалось с качеством воды в 1980-1990 годах.Речная экосистема меняет свои свойства, а свойство самоочищения снижается. В результате органическое загрязнение водоемов начинает увеличиваться. «Уровень кальция во всех источниках воды увеличивается на 4-12,5%, что может вызвать серьезные проблемы, от изменения вкуса воды до проблем со здоровьем», — сказала она.

Проблемы озера Севан

По данным ГНКО «ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИЯ И МОНИТОРИНГ» Министерства окружающей среды РА, в 2010-2018 годах содержание фосфора в озере Севан продолжает расти, качество воды ухудшается.«Около 270 тонн фосфора и около 1396 тонн азота ежегодно попадают в озеро Севан через бытовые сточные воды, что создает благоприятные условия для роста водорослей. С другой стороны, добавляется эффект повышения температуры воздуха. Между ними существует прямая взаимосвязь. биомасса фитопланктона и температура воздуха в озере. С повышением температуры наблюдается рост фитопланктона. Уровень воды повышается, но качественных изменений в озере и улучшения экосистемы мы не наблюдаем.Следует иметь в виду, что чем выше уровень, тем больше становится водная поверхность озера, тем быстрее вода в озере может нагреваться, а повышение температуры воздуха способствует этому процессу. С одной стороны, мы больше нагреваем воду, разливаем, увеличиваем площадь, с другой — повышаем содержание азота и фосфора в озере. Таким образом создаются идеальные условия для роста водорослей.

Инга Зарафян, президент ИНО «ЭкоЛур» поинтересовалась, возможно ли восстановить водные ресурсы.В ответ Лиана Маргарян привела в пример озеро Севан. «Интенсивность цветения — это естественный процесс, который показывает защитную реакцию экосистемы. Озеро цветет, водоросли поглощают азот и фосфор, выносят его из озера. Это реакция самообороны, делается попытка восстановить систему. Я не хочу сказать, что мы не можем вернуться в прежнее состояние. Но опыт показывает, что когда воздействие на экосистему уменьшится, она может восстановиться. Если мы сможем провести целевые меры на озере Севан, мы сможем восстановить его.

Воздействие горнодобывающей промышленности и изменения климата на водные ресурсы

«Из-за воздействия горнодобывающей промышленности водные ресурсы загрязнены большим количеством тяжелых металлов. В рамках 4-го Национального отчета об изменении климата для обсерватории Вохчи-Капан было предсказано, как в этом случае изменится качество воды. непрерывного загрязнения, принимая медь и цинк в качестве индикаторов добычи, нитраты и аммоний в качестве бытовых сточных вод.Оценка проводилась по двум сценариям.

Если при наихудшем сценарии не будет предпринято никаких действий и загрязнение продолжится, загрязнение нитратами и аммонием продолжит увеличиваться, превышая 1,7-2 раза, как в случае с медью и цинком. Однако в случае принятия природоохранных мер мы увидим снижение аммиака до 40 раз, меди в два раза, цинка в реке Вохчи за пять лет до 10 раз », — сказала Лиана Маргарян.

«Если предотвратить попадание загрязняющих веществ в водную экосистему, система восстановится, а вода будет очищена благодаря способности водной экосистемы к самовосстановлению.В случае тяжелых металлов это явление представляет собой довольно длительный процесс, но они могут превращаться в модифицированные, безвредные, ассимилированные формы для водного биоразнообразия из-за биохимических процессов, оставаясь на дне речной воды ».

19 апреля 2021, 10:03