Белок формула химическая: химическая формула белка — Школьные Знания.com

Белки с зеркальным отображением являются ключевым компонентом оригинального метода «зеркального фагового дисплея» для систематической разработки высокоаффинных лигандов d-пептида для природных белков.41 Форма d-белка природного l-белка получается путем полного химического синтеза, и используется в качестве приманки при выборе связывающих веществ из пептидных библиотек, отображаемых на фаге. После идентификации пептида с высоким сродством синтезируется d-пептид с той же аминокислотной последовательностью.По причинам симметрии 42 d-пептид имеет такое же высокое сродство к нативному l-белку-мишени. Этот мощный метод разработки стабильных, высокоаффинных лигандов d-пептида в настоящее время используется для множества терапевтических белков-мишеней.43-49 Во многих случаях достаточно создать один домен целевого белка в форме зеркального отображения, а не в форме зеркального отражения. чем вся молекула белка, что упрощает задачу синтеза.

Зеркальное изображение белок фаговый дисплей — мощный метод систематической инженерии взаимодействий между левыми и правыми молекулами белка.Чтобы разработать антагонист d-белка ангиогенного белкового гормона фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A) 50, белок d-VEGF-A размером 22 кДа был получен путем полного химического синтеза и использовался для скрининга большого количества варианты белкового каркаса, отображаемые на фаге. Был идентифицирован наномолярный аффинный связывающий d-белок. Данные о рацемической кристаллической структуре гетерохирального комплекса VEGF-A и связующего d-белка (описанного выше) 32 использовали для уточнения свойств этого антагониста d-белка VEGF-A.50

Хиральность — это доминирующий фактор во взаимодействии низкомолекулярных соединений натуральных продуктов с молекулами белков.51 Обычно исследования по открытию лекарственных препаратов в остро конкурентной области фармацевтических разработок на основе натуральных продуктов сильно пересекаются. Обычно одни и те же белки идентифицируются как важные в настоящее время мишени, и часто бывает, что несколько программ разработки лекарств предлагают аналогичные ведущие соединения для дальнейшего уточнения с помощью медицинской химии.По этой причине большое значение будет иметь метод идентификации уникальных соединений свинца. Очень рано было понято, что скрининг библиотек соединений хиральных природных продуктов (NP) против химически синтезированной зеркальной формы белковой мишени с последующим созданием зеркального отображения выбранных NP с помощью обычного органического синтеза может дать уникальные выводы, которые не обнаружены. обычными методами скрининга52 (рис. 4).

Скрининг библиотеки хиральных натуральных продуктов против зеркальных форм фермента может обеспечить новые совпадения.Затем синтез зеркального отражения хитового соединения дает новую молекулу, родственную натуральному продукту, активную против нативного фермента.

Недавно Нобутака Фуджи и др. воплотили эту концепцию в жизнь.53 Они проверили хиральную библиотеку, состоящую из ~ 22 000 соединений природного продукта, против зеркальных форм p53-связывающего домена белка MDM2. Хиральное производное α-токоферола было идентифицировано как ингибитор взаимодействия d-MDM2 / d-p53. Зеркальное отображение идентифицированного производного α-токоферола, полученного обычным органическим синтезом, ингибировало взаимодействие l-MDM2 / l-p53, но не влияло на взаимодействие d-MDM2 / d-p53.53

Диастереомеры белков

Диастереомеры представляют собой белки, которые содержат смесь d-аминокислот и l-аминокислот, 54 или которые имеют перевернутую стереохимию боковой цепи Thr или Ile.55 Эти стереохимические гибриды могут быть полезными зондами молекулярной основы свойств белка.

Термодинамика C-концевого «перекрытия спирали», геометрически ограниченного участка, где альфа-спиральный участок полипептида переходит в более протяженную вторичную структуру, была исследована в молекуле белка убиквитина.56 Полный химический синтез был использован для замены консервативного остатка Gly сразу после альфа-спирали на d- и l-энантиомеры аминокислот Ala и Val, таким образом создавая две пары диастереомеров белка. Измеренные энергетические различия между стабильностью диастереомеров показали, что доминирующим термодинамическим эффектом была необходимость принять левостороннюю конформацию скелета для остатка после альфа-спирали, конформацию, которая может быть принята только Gly из всех протеиногенных аминокислот. или d-аминокислотой.56

Белок ShK токсина яда скорпиона содержит два остатка Ile и четыре остатка Thr. На основании предсказанной относительной стабильности из расчетов молекулярной динамики три диастереомера ShK были химически синтезированы как l-белки, содержащие один остаток со стереохимией перевернутой боковой цепи: [l- allo -Ile ⁷ ] ShK; [1- алло -Thr ¹³ ] ShK; и [1- allo -Thr ³¹ ] ShK.1 36 Скорости сворачивания и относительная стабильность свернутых диастереомеров согласуются с расчетами.Квазирацемическая кристаллография, в которой каждый диастереомер l-ShK был совместно кристаллизован с d-ShK, была использована для определения структуры диастереомеров [l- allo -Ile ⁷ ] ShK и [l- allo ] -Thr ¹³ ] ШК. Интересно, что наименее стабильный диастереомер [1- алло -Thr ³¹ ] ShK спонтанно кристаллизовался сам по себе из квазирацемической смеси с d-ShK.36

Топология

В структурной науке о белках термин «топология» используется для описания вторичных и третичных структур свернутой белковой молекулы.В математическом смысле 57 «топология» отличает линейные полипептидные цепи, обычно встречающиеся в белках, от разветвленных, кольцевых, линейных петель и множества других возможных конфигураций полипептидных цепей. Здесь мы будем использовать термин топология в обоих этих смыслах.

Вторичная структура

Предварительно сформированные компоненты вторичной структуры или фрагменты, индуцирующие вторичную структуру, могут быть введены в пептидную цепь белковой молекулы путем химического синтеза.Последовательность Gly ¹⁶ –Gly ¹⁷ в обратном повороте в молекуле протеина протеазы ВИЧ-1 была заменена на BTD, непептидный имитатор β-поворота типа II фиксированной геометрии.58 Сложенный BTD-содержащий белок имел полная ферментативная активность, неизменная субстратная специфичность и повышенная термостабильность. Аналогичный подход был использован для изучения домена белка GB1 Staph. Aureus ,59. Совсем недавно лактамы, образованные между боковой цепью аминокислоты и соседней пептидной связью, были использованы для контроля вторичной структуры белка.60

Другой подход к контролю вторичной структуры белков можно назвать «космической инженерией Рамачандрана». Гомодимерная молекула протеина протеазы ВИЧ-1 имеет две идентичные мобильные лоскутные структуры, которые закрываются над связанным субстратом. Ковалентная димерная форма протеазы ВИЧ-1 с полипептидной цепью из 203 аминокислот была получена путем полного химического синтеза, чтобы сделать возможными асимметричные изменения в ковалентных структурах лоскутов.61 Остаток Gly ⁵¹ и Gly ^{51 ‘} были заменены на d-Ala, l-Ala или Aib (α-амино-изомасляная кислота) в одном или обоих створках, что привело к образованию серии молекул аналогового белка, в которых доступное конформационное пространство позвоночника на кончике каждого лоскута было ограничено определенным образом. Симметричная замена Gly ⁵¹ и Gly ^{51 ’} на d-Ala или l-Ala приводила к существенному снижению ферментативной активности. Протеаза ВИЧ-1 [Ala ⁵¹ , Aib ^{51 ’}], в которой доступные конформации лоскута были сильно ограничены, имела резко сниженную ферментативную активность.Интересно, что асимметричный аналог [d-Ala ⁵¹ , l-Ala ^{51 ‘}] протеаза ВИЧ-1 обладал полной ферментативной активностью, что позволяет предположить, что различная геометрия скелета наблюдалась для Gly ⁵¹ и Gly ^51′ в исходном состоянии. ферменты функционально значимы.62

Новая ковалентная топология

Synthesis можно использовать для создания уникальных химических вариаций простой линейной топологии от N-конца к C-концу полипептидных цепей в большинстве природных белков.

Ядерные белки cMyc и Max регулируют экспрессию генов, образуя нековалентный гетеродимер, который связывается со специфической нуклеотидной последовательностью в двухцепочечной ДНК.63 Была разработана конструкция гетеродимера из 172 остатков, в которой отдельные домены b / HLHZ cMyc и Max были ковалентно связаны в C-концевой области каждого домена, чтобы получить молекулу белка с беспрецедентной ковалентной структурой: полипептидная цепь изменяет направление в средней точке и имеет два N-концевых остатка, но не имеет C-конца.Целевой ковалентный гетеродимер получали конденсацией четырех синтетических пептидных сегментов с использованием двух различных, взаимно совместимых химических методов лигирования. Этот уникальный химический аналог белка cMyc-Max обладал той же специфичностью связывания, что и нековалентный гетеродимер. Интересно, что КД-спектроскопия синтетической конструкции ковалентного гетеродимерного белка cMyc-Max показала, что он был предварительно свернут в отсутствие лиганда дцДНК, тогда как домены b / HLHZ нативных cMyc и Max образуют только свернутый белок (нековалентный). димер в присутствии дцДНК-мишени.64

Убиквитин — это высококонсервативная белковая молекула, которая в природе присоединяется к другим белкам для изменения их биохимических свойств.65 Присоединение убиквитина к боковой цепи лизина в другой молекуле белка может быть использовано для нацеливания этого белка на деградацию протеасомным механизмом клетки. .66 Ковалентная модификация гистоновых белков убиквитином модифицирует экспрессию генов.67 В обеих этих биохимических системах присоединенный убиквитин может быть дополнительно модифицирован ковалентным присоединением одного или нескольких убиквитинов с образованием убиквитиновых цепей.68 Топологически убиквитинированные белки состоят из разветвленных полипептидных цепей . Несколько исследовательских групп использовали химический синтез белка для создания разветвленных конструкций убиквитин-белок с определенной ковалентной структурой, а затем для исследования их биохимических свойств.69-73 Новые методы химического синтеза олигоубиквитинов предоставили разветвленные белковые конструкции с определенной ковалентной структурой. с массами до 51 кДа, 74 и даже больше мультиубиквитинов путем контролируемой нативной химической лигированной полимеризации.75

В клетке некоторые линейные полипептидные цепи, продуцируемые рибосомной трансляцией, подвергаются посттрансляционной биохимической обработке с образованием белков, которые имеют кольцевых полипептидных цепи : то есть белковые молекулы, в которых N-конец и C-конец полипептидной цепи находятся соединены пептидной связью. Кольцевые белки первоначально были выделены из растений и названы «циклотидами». 76 В исследовательской лаборатории химический синтез является предпочтительным способом создания этих кольцевых белковых молекул для изучения структуры и функции.77 Циркулярные белки были идентифицированы из самых разных природных источников, в том числе из бактерий.78 Группа Боде недавно сообщила об общем химическом синтезе 70-остаточного кольцевого белка бактериоцина As-48.79

Катенаны — это молекулы, в которых две макроциклические структуры взаимопроникают и, таким образом, механически связаны друг с другом. Химический синтез был использован для разработки и создания белковых катенанов s, которые содержат взаимосвязанные макроциклические полипептидные цепи.80

Химический синтез также был использован для получения уникального аналога крамбина, в котором взаимодействие ионной пары между гуанидином боковой цепи остатка Arg10 и α-карбоксилатом полипептидной цепи было заменено ковалентной связью с образованием полипептидной цепи с линейной петлей. ковалентная топология. Сворачивание дало молекулу белка новой топологии, в которой N-конец полипептидной цепи проникает в кольцо макролактама и удерживается на месте дисульфидными связями, напоминая лассо-пептиды.1 34 Структура этого нового топологического аналога белка была определена с помощью квази -рацемической рентгеновской кристаллографии (рис. 5).

Quasi- рацемическая рентгеновская кристаллография: определение структуры взаимопроникающего топологического аналога крамбина с линейной петлей. (A) Кристаллографическая элементарная ячейка. (B) Мультяшное изображение структуры позвоночника. Новая амидная связь показана в виде сфер КФК. C. Электрон карта плотности 2Fo – Fc с подобранной структурой новой амидной связи, показанной в виде стержней. (D) Наложение структуры топологического аналога крамбина (зеленый) и структуры нативного крамбина (голубой), полученного путем инвертирования структуры d-крамбина. Обе белковые структуры были получены в одном эксперименте. По материалам Ref. 34.

Химическая промышленность

Synthesis позволяет использовать весь репертуар органической химии для создания уникальных химических вариантов ковалентной структуры белка.Существует обширная литература по «пептидомиметической химии» 82, и все они могут быть применены к молекулам белков с использованием современных методов химического синтеза. Корреляция изменений ковалентной структуры белковых молекул с эффектами на структуру и свойства свернутых белков обеспечивает новое понимание молекулярных основ функции белка и позволяет создавать новые формы (пере) дизайна белков.

Магистральная инженерия

Ранним примером уникальных химических вариантов белка была «инженерия остова» путем полного химического синтеза молекулы протеина протеазы ВИЧ-1.Две пептидные связи были заменены тиоэфирными связями, что предотвратило образование водородных связей с карбонилами на пептидном субстрате.83 Полученный химически сконструированный фермент имел k _cat (число оборотов, когда фермент насыщен субстратом) ниже на ~ В 3000 раз по сравнению с молекулой фермента нативного скелета. Это каталитическое снижение скорости на ~ 5 ккал / моль соответствует энергии двух водородных связей, предполагая, что эти взаимодействия между пептидным субстратом и основной цепью белка являются каталитически релевантными.84 Недавние примеры инженерии белковой основы с помощью химического синтеза включают использование химической конденсации «щелчка» пептидных сегментов с получением белковых молекул, содержащих изостер триазола вместо пептидной связи.85, 86 Химический синтез был использован для проведения систематической C -альфа- и амид-азот-метил-сканирование полипептидной цепи белка для выявления конформаций скелета, которые влияют на структуру и функцию белка.87

Транслокация боковой цепи

В молекулах природного белка боковые цепи аминокислот являются боковыми цепями α-углеродов в основной цепи полипептида.Химический синтез белка можно использовать для сдвига боковой цепи аминокислоты к атому азота пептидной связи. В модельном белке ингибитора трипсина поджелудочной железы крупного рогатого скота (BPTI) остаток Cys38 был заменен пептоидным фрагментом, несущим N ^α -этанотиоловый фрагмент. Уникальный химический аналог белка [(N ^α (CH ₂ ) ₂ SH) Gly ³⁸ )] BPTI имел такую ​​же складчатую структуру и термостабильность, что и нативный BPTI, как показал многомерный ЯМР88. , полусинтез использовали для осуществления серии пептоидных транслокаций боковых цепей отдельных остатков Lys, Glu и His в N-концевой области полипептидной цепи фермента рибонуклеазы A, а также для изучения влияния на ферментативную активность полученных аналогов.89

Медицинская химия

Используя синтетическую химию, принципы медицинской химии могут быть применены к молекулам белков, чтобы оптимизировать их свойства. Для хемокина RANTES это привело к разработке уникального химического аналога белка AOP-Rantes, который связывается с хемокиновым рецептором CCR5 и ингибирует проникновение ВИЧ-1 в клетки периферической крови.90, 91 человеческие терапевтические средства были улучшены за счет включения галоген-модифицированных аминокислот.92 Применение медицинской химии к инсулину в значительной степени облегчается за счет разработки эффективного полного синтеза молекулы белка инсулина через «сложноэфирный инсулин», химический заменитель проинсулина, в котором две полипептидные цепи зрелого инсулина связаны сложноэфирной связью. между боковыми цепями Glu ^A4 и Thr ^B30 . Эффективно это заменяет 35 остатков С пептида проинсулина одной ковалентной связью между двумя боковыми цепями. Депсипептидная цепь из 51 остатка сворачивается при физиологическом pH, и полученный сложноэфирный белок инсулина может быть химически преобразован в человеческий инсулин с отличным выходом.93-95 Сложноэфирные депсипротеины основной цепи могут быть получены с помощью химии лигирования KAHA, которая может непосредственно генерировать продукты лигирования сложноэфирной полипептидной цепи.96

Гликопротеиновая инженерия

Делая шаг вперед в науке о синтетических гликопротеинах, Kajihara et al. сообщили об общем химическом синтезе, фолдинге и биологической активности пяти различных гликоформ эритропоэтина (ЭПО). Каждая гликоформа содержала один или несколько двухантенных сиалилолигосахаридов человеческого типа в определенных положениях гликозилирования, и они были получены с высокой степенью чистоты и с определенной химической структурой97 (рис.6).

Гликоформы ЭПО, полученные методом полного химического синтеза. (A) Модульная конвергентная синтетическая схема. В нижнем ряду показаны мультяшные изображения пяти гликоформ. (B) Масс-спектры синтетических гликопротеинов с электрораспылением для прямой инфузии. Наблюдаемые массы синтетических гликопротеинов составляли 20 540 Да, 22 746 Да (три изомерные гликоформы) и 24 952 Да. По материалам Ref. 97.

В более ранней работе был разработан и синтезирован синтетический белок эритропоэза (SEP) — химический «гликопротеиновый миметик» варианта EPO.SEP содержал две тетраразветвленные олиго (этиленоксид-амидные) части, каждая из которых несла четыре отрицательных заряда, которые заменяли сложные сиалогликаны нативного белка. Молекула белка SEP 50 825 Да обладала полной биологической активностью и увеличенной продолжительностью действия in vivo .98, 99

Априорная

конструкция белка

Создание белковых молекул с заданной структурой и новыми функциями — это «святой Грааль» белковой науки.100 Полный химический синтез позволяет разработчику выйти за рамки 20 аминокислот, обычно присутствующих в белках, и обойти парадигму линейной полипептидной цепи, навязанную рибосомной трансляцией. Примером третичной структуры является разработанный трициклический белок «CovCore 3h3». Белок 6280 Да был получен путем полного химического синтеза и содержит кольцевую полипептидную цепь. Белок был заблокирован в том, что в противном случае было бы высокоэнергетической конформацией из-за неестественных ковалентных ограничений.Его структура была определена методом рентгеновской кристаллографии102 (рис. 7).

Рентгеновская структура априорно сконструированной белковой молекулы. Кольцевая полипептидная цепь показана фиолетовым цветом с карикатурным изображением спиральных участков. Ароматическое кольцо, используемое для ковалентного соединения трех спиралей и ограничения складчатой ​​структуры, показано голубым цветом.102

Аналогичный подход был использован для создания тримерного аналога 24 кДа амилоидного агрегата.103

Продвинутые физические техники

Химический синтез обеспечивает исключительно точное введение ядер изотопных зондов в молекулу белка и сайт-специфическое прикрепление других спектроскопических зондов. Это позволило по-новому применить передовые спектроскопические методы для выяснения молекулярных основ структуры и функции белков.

Ядерный магнитный резонанс

Спектроскопия ЯМР

широко используется для определения структуры белков и исследования динамики белков.Назначение резонансов отдельным ядрам и определение молекулярной структуры методами многомерного ЯМР может быть сложной задачей для многодоменных белков, и особенно сложной задачей для интегральных мембранных белков из-за спектрального перекрытия резонансов от гидрофобных аминокислотных остатков в трансмембранных спиралях. 104 Химическое лигирование может использоваться для упрощения этих проблем путем включения сегментов, меченных изотопами ЯМР, и немеченых сегментов в полипептидную цепь белка.105-107 ЯМР-спектроскопия особенно полезна для определения ионизационных свойств функциональных групп в белковых молекулах. Однозначное определение значений функциональности отдельных боковых цепей для p K a важно для понимания ферментативного катализа и в значительной степени облегчается за счет сайт-специфического включения аминокислот, содержащих ядра ЯМР-зонда, в молекулу белка.108

Флуоресценция

Флуоресцентные красители являются полезными датчиками динамики белков и могут использоваться для измерения расстояний внутри белков и белковых комплексов.Химический синтез может включать флуоресцентные красители в определенных участках белковой молекулы для измерения расстояний с помощью Förster Resonance Energy Transfer (FRET) .109 Сайт-специфически меченные флуоресцентные токсинные белки были получены путем полного химического синтеза и использованы для измерений резонансного переноса энергии лантаноидов (LRET). конформационных изменений потенциалзависимого натриевого канала Na _V 1.4 в состоянии покоя и в инактивированном состоянии, а также в живых клетках 110 (рис. 8).

Измерение расстояний в натриевом канале Nav1.1 молекула белка. Измерения резонансного переноса энергии лантаноидов (LRET) стали возможными благодаря полному химическому синтезу малых белковых токсинов, сайт-специфично меченных флуорофорным красителем. По материалам Ref. 110.

Ансамблевые измерения усредняют конформации и динамику субпопуляций белков и, таким образом, скрывают поведение отдельных белковых молекул. Флуоресцентные зонды можно использовать для изучения одиночных молекул ферментного катализа. Ковалентную гомодимерную протеазу ВИЧ-1, снабженную связкой ПЭГ-биотин, получали путем полного химического синтеза и закрепляли на предметном стекле, покрытом стрептавидином.Используя пептидный субстрат, меченный одним членом пары красителей FRET на N-конце и другим красителем на C-конце, регистрировали зависимые от времени наблюдения связывания и расщепления субстрата одной молекулы.111 Одномолекулярный FRET также может быть осуществляется с помощью химически синтезированных белковых молекул, содержащих несколько флуоресцентных красителей. Конвергентный общий химический синтез в сочетании с региоспецифической защитой боковой цепи цистеина использовали для сайт-специфического введения трех различных флуорофоров в молекулу белка -синуклеина.Одномолекулярные трехцветные FRET-эксперименты проводили в растворе на свободно диффундирующих молекулах α-синуклеина.112

Инфракрасная спектроскопия

Инфракрасная спектроскопия белков с двумерным преобразованием Фурье с временным разрешением (FTIR) может предоставить информацию о конформационной динамике белков в масштабах от пикосекунд до миллисекунд.113 Чтобы использовать FTIR для исследования роли специфических водородных связей в образовании димеров инсулина, общий химический анализ синтез использовали для получения молекул инсулина, содержащих массивы изотопных зондов ¹³ C = ¹⁸ O в карбонильных фрагментах специфических пептидных связей в двух полипептидных цепях белка.114

Новые вибрационные зонды, доступные для наблюдения через прозрачное окно между 1880 и 2500 см ⁻¹ , могут быть введены в определенные места, чтобы действовать как репортеры электростатики и других характеристик физико-химической среды внутри белковой молекулы.115 Эффект Штарка, сдвиг частоты инфракрасного резонанса в ответ на изменения приложенного электрического поля, является чувствительным зондом локальной электростатики внутри белковой молекулы.116 Фрагменты вибрационного зонда, такие как нитрил и тиоцианат, были введены в молекулы ферментного белка на боковых цепях остатков Cys. В пионерских экспериментальных исследованиях нитрильные колебательные зонды с эффектом Штарка использовались для выяснения роли электростатических эффектов в ферментативном катализе.117 Эти и аналогичные исследования эффекта Штарка подтверждают значительный вклад электрических полей в катализатор в молекуле ферментного белка, образующей комплекс с его субстратом118. Недавно был опубликован современный взгляд на роль электростатики в ферментативном катализе.119 Химический синтез был бы более универсальным и контролируемым способом введения фрагментов зонда с вибрационным эффектом Штарка в молекулы белка. Полный химический синтез будет играть важную роль в дальнейших экспериментальных испытаниях роли и величины предварительно ориентированных диполей Н-связи в ферментативном катализе.

Первичная структура белка | Аминокислоты и химический состав — стенограмма видео и урока

Первичная структура белка

Какова первичная структура белка? Белки являются структурными компонентами клеток и выполняют множество функций, например транспортируют материалы, обеспечивают структурную поддержку и катализируют химические реакции.Это макромолекулы, состоящие из мономерных аминокислот. Есть двадцать различных аминокислот, которые могут составлять белки. Порядок расположения определенных аминокислот в белке — это первичная структура белка. Например, часть первичной структуры белка гемоглобина, который переносит кислород у животных, следующая:

val — his — leu — thr — pro — glu

Это означает, что первые шесть аминокислот в гемоглобине — это валин, гистидин, лейцин, треонин, пролин и глутамат.Белки могут состоять из тысяч аминокислот, так что это только начало первичной структуры гемоглобина.

Формирование цепи

Первичная структура белка формируется в процессе синтеза белка. При синтезе белка исходная первичная структура кодируется инструкциями ДНК.ДНК копируется в информационную РНК (мРНК) во время транскрипции. Затем мРНК экспортируется из ядра для выполнения следующего шага — трансляции. Во время трансляции рибосомы прикрепляются к мРНК, которые представляют собой уменьшенные копии отдельных генов ДНК. Рибосомы считывают мРНК группами из трех нуклеотидов, называемыми кодонами. Каждый кодон кодирует одну аминокислоту. Рибосома катализирует образование пептидной связи между указанными аминокислотами посредством синтеза дегидратации, при котором молекула воды теряется.Эта полимеризация формирует полипептидную цепь, которая в конечном итоге сворачивается в трехмерный белок посредством посттрансляционной модификации. Во время посттрансляционной модификации к первичной последовательности белка могут быть добавлены дополнительные модификации. Полипептидная цепь имеет определенную ориентацию, причем один термин называется N-элементом, а другой — C-элементом. Это относится к ориентации аминокислот. Полипептидные цепи всегда синтезируются и считываются от N-члена к C-члену.

Секвенирование первичных структур белка

Существует несколько способов выяснить первичную структуру белка. Если белок можно выделить, существует несколько методов, включая следующие:

• Деградация по Эдману
• Масс-спектрометрия

При деградации по Эдману одна аминокислота удаляется из белка за раз с использованием специального реагента, называемого фенилизотиоцианатом, который не повреждает последовательность. Однако деградация по Эдману может занять много времени и не подходить для нужд высокой производительности.Сегодня многие ученые используют масс-спектрометрию для идентификации белков. Во время масс-спектрометрии белок расщепляется на более мелкие фрагменты, которые затем можно провести с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии для идентификации компонентов. Затем вычислительные алгоритмы могут быть использованы для выяснения исходной последовательности белка.

Если ген белка известен, ген можно секвенировать с помощью технологии секвенирования ДНК. Как только последовательность ДНК известна, генетический код можно использовать для идентификации аминокислот в первичной последовательности белка.

границ | Автоматизированная фрагментация QM / MM Расчет химических сдвигов ЯМР для комплексов белок-лиганд

Введение

Вычислительные методы, основанные на структуре, являются полезными инструментами для анализа способов связывания и сродства для комплексов белок-лиганд (Grinter and Zou, 2014). С развитием рентгеновской кристаллографии и технологии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) было определено более 100000 трехмерных белковых структур с высоким разрешением, что полезно для поиска основных соединений и терапевтических целей (Ferreira et al., 2015). По сравнению с экспериментальными методами, вычислительные подходы, такие как молекулярная стыковка, являются быстрыми и эффективными способами открытия лекарств. В программах молекулярного стыковки оценочные функции используются для аппроксимации свободной энергии связи и, следовательно, для ранжирования смоделированных поз-приманок (Sliwoski et al., 2014). Большинство оценочных функций примерно получены из потенциалов, основанных на силовом поле (Morris et al., 1998; Englebienne and Moitessier, 2009), эмпирических (Eldridge et al., 1997; Murray et al., 1998) или основанных на знаниях (Gohlke и другие., 2000; Хуанг и Цзоу, 2006). Однако, основанные на параметризованных функциях, эти методы оценки обычно недостаточно точны, чтобы отличить экспериментальную структуру от пристыкованных структур-ловушек, и иногда рейтинги из разных программных пакетов могут быть несовместимыми (ledź and Caflisch, 2018). Для решения этой проблемы много усилий было направлено на разработку методов стыковки путем введения экспериментальной структурной информации или квантово-механических (КМ) расчетов для оценки исходных и прогнозируемых поз (Mohan et al., 2005; Гринтер и Зоу, 2014; Адени, Солиман, 2017).

Химический сдвиг — один из наиболее эффективных и точных параметров ЯМР в отражении локальной химической среды вокруг атома, которая играет важную роль в определении и уточнении структуры (Zhu et al., 2014; Bratholm and Jensen, 2017). Для расчетов химического сдвига ЯМР используются программы для прогнозирования эмпирического химического сдвига ShiftS (Xu и Case, 2001; Moon and Case, 2007), ShiftX (Neal et al., 2003), ShiftX2 (Han et al., 2011), CamShift (Robustelli et al., 2010), PROSHIFT (Meiler, 2003; Meiler and Baker, 2003), SHIFTCALC (Williamson and Craven, 2009), ProCS (Christensen et al., 2014; Bratholm and Jensen, 2017). ), CheShift (Vila et al., 2009; Garay et al., 2014) и Sparta + (Shen, Bax, 2010). Эти эмпирические методы обладают высокой скоростью вычислений и успешно предсказывают химические сдвиги в основной цепи. Поскольку эмпирические формулы для этих моделей получены на основе экспериментальной или рассчитанной QM базы данных химических сдвигов и высококачественных структур, эти модели не очень подходят для точного предсказания химических сдвигов ЯМР для некоторых сложных систем, таких как комплексы белок-лиганд, нестандартные белковые остатки или неканонические пары оснований в системах нуклеиновых кислот (Swails et al., 2015). Расчеты квантово-механического химического сдвига в принципе способны предсказать химические сдвиги ЯМР для любых сложных систем (Lodewyk et al., 2012; Hartman and Beran, 2014; Merz, 2014). Для расчетов химического сдвига ЯМР белков Cui и Karplus предложили очень эффективный подход QM / MM (Cui and Karplus, 2000), Gao et al. разработали метод молекулярных орбиталей фрагментов (FMO) (Gao et al., 2007, 2010), Экснер с соавторами использовали подход сборщика регулируемой матрицы плотности (ADMA) (Frank et al., 2012; Victora et al., 2014), Тан и Беттенс разработали комбинированный метод фрагментации (CFM) (Tan and Bettens, 2013), а He и его коллеги разработали метод автоматизированной квантовой механики / молекулярной механики фрагментации (AF-QM / MM) (He et al., 2009, 2014; Zhu et al., 2012, 2013, 2014, 2015; Swails et al., 2015; Jin et al., 2016). Эти методы QM на основе фрагментов успешно применялись для расчета химического сдвига ЯМР. белков и нуклеиновых кислот.

Исходя из того, что химические сдвиги или возмущения химического сдвига (CSP) чувствительны к изменениям химической среды, эти параметры вполне подходят для определения структуры (Case, 1998; Cavalli et al., 2007; Шен и Бакс, 2015). Многие методы на основе ЯМР были разработаны для прогнозирования режимов связывания белок-лиганд (Medek et al., 2000; Cioffi et al., 2008; Riedinger et al., 2008; Aguirre et al., 2014). McCoy и Wyss использовали данные протонного CSP, индуцированного эффектом ароматического кольцевого тока в лигандах, чтобы определить положение кольца стыковочных структур (McCoy and Wyss, 2002). Недавно Ten Brink et al. сравнили экспериментальные и смоделированные CSP для проверки конформационных изменений белков и разработали метод стыковки на основе CSP (Ten Brink et al., 2015). Merz et al. разработали оценочные функции на основе CSP для определения положений связывания для комплексов белок-лиганд (Wang et al., 2007; Yu et al., 2017). Однако большинство этих оценочных функций рассчитывают только химический сдвиг протонов в белках. Оценочные функции могут быть более эффективными, если принять во внимание химические сдвиги лиганда ¹ H.

В этой работе мы применили подход AF-QM / MM для расчета химического сдвига ЯМР на комплексах связывания белок-лиганд.На основе вычислений методом DFT, химические сдвиги ¹ H как для белка, так и для лиганда доступны для определения структуры и улучшения оценочных функций. В рамках подхода AF-QM / MM лиганд также разделяется на более мелкие фрагменты, и, следовательно, это значительно снижает вычислительные затраты для расчета химического сдвига ¹ H ЯМР для большого лиганда. В этом исследовании белок неокарзиностатин (NCS) выбран в качестве тестового примера для метода AF-QM / MM из-за его важности в терапии рака.NCS имеет экспериментальные химические сдвиги как для апо, так и для голо форм (Myers et al., 1988; Mohanty et al., 1994; Schaus et al., 2001; Takashima et al., 2005; Wang and Merz, 2010). Кроме того, путем сравнения рассчитанных AF-QM / MM химических сдвигов с данными эксперимента была разработана оценочная функция на основе химического сдвига для ранжирования нативных и предсказанных поз связывания белок-лиганд.

Эта статья организована следующим образом: сначала был проведен тестовый тест с использованием метода AF-QM / MM для расчетов химического сдвига ЯМР комплекса белок-лиганд.Расчетные результаты сравниваются с расчетами химического сдвига ЯМР для крупноразмерной системы. Впоследствии рассчитанные AF-QM / MM химические сдвиги сравниваются с экспериментальными результатами как для апо, так и для голо NCS структур. Далее обсуждается эффективность оценочных функций, основанных на химическом сдвиге, и обычных оценочных функций, основанных на энергии, для ранжирования предсказанных поз связывания белок-лиганд. Наконец, гибридная оценочная функция, которая объединяет вычисленные химические сдвиги ЯМР и энергию связи, применяется для ранжирования экспериментальной структуры и других стыкованных поз связывания.

Вычислительные подходы

Подготовка конструкции

Рентгеновские структуры апо и голо NCS были загружены из банка данных по белкам (идентификаторы PDB: 1NOA и 1NCO соответственно). Данные экспериментального химического сдвига апо-белка и хромофора были получены из предыдущих исследований (Myers et al., 1988; Mohanty et al., 1994). Химические сдвиги эксперимента holo NCS были загружены из банка данных биологического магнитного резонанса (запись BMRB: 5969). Минимизацию структуры рентгеновских структур белков проводили с помощью программы AMBER12 (Case et al., 2012) с силовым полем ff99SB. Структуры апо и голо NCS были сольватированы в усеченном октаэдрическом периодическом ящике молекул воды TIP3P с каждой стороной, по крайней мере, 10 Å от ближайшего атома растворенного вещества (Jorgensen and Jenson, 1998). После того, как вся система была нейтрализована противоионами, были использованы 1000 шагов алгоритма наискорейшего спуска с последующими 4000 шагов метода сопряженных градиентов для удаления неправильных контактов системы. Для получения параметров силового поля лиганда использовали общее силовое поле AMBER (GAFF) (Wang et al., 2004) и модель заряда AM1-связи (AM1-BCC) была использована для лиганда (Jakalian et al., 2002). Молекулярный докинг был выполнен с использованием модуля Glide в программе Schrödinger (Friesner et al., 2004; Halgren et al., 2004). В данном исследовании использовалась функция оценки Glide XP. В этом исследовании структура белка была зафиксирована, когда лиганд был прикреплен к сайту связывания. Поэтому мы не включали гибкость белка во время молекулярного стыковки. Основываясь на оптимизированной экспериментальной структуре с использованием поля молекулярных сил, Glide предсказал 38 стыковочных поз лиганда, среднеквадратичные отклонения которых варьируются от 1.От 5 до 10,5 Å по отношению к исходному положению были выбраны для последующих расчетов химического сдвига на уровне QM.

Метод AF-QM / MM для расчета химического сдвига ЯМР комплекса белок-лиганд

В подходе AF-QM / MM (He et al., 2009, 2014; Zhu et al., 2012, 2013; Swails et al., 2015; Jin et al., 2016) белок апо делится на отдельные остаток, разрезая пептидные связи. Количество фрагментов такое же, как количество остатков в белке.Каждый фрагмент содержит сердцевину (каждую аминокислоту) в белке и буферную область, которая содержит близлежащие остатки, окружающие сердцевину области. И сердцевина, и буферные области обрабатываются квантовой механикой (QM), в то время как остатки за пределами буферной области описываются молекулярной механикой (MM). Детали для определения буферных областей описаны в нашей предыдущей работе (He et al., 2009; Zhu et al., 2012, 2013). Для исследуемого в данной работе голопротеина мы разработали схему фрагментации лиганда и окружающих его белковых остатков.Как показано на рисунке 1, мы также разделили хромофор на три части, разрезав одинарную связь C-O. Фрагмент 1 содержит нафтоатную группу, фрагмент 2 включает ендииновое кольцо, а фрагмент 3 содержит аминосахарную группу, соответственно. Для каждого фрагмента лиганда (взятого в качестве каждой области ядра) остальная часть лиганда и остатки белка, окружающие область ядра (каждый фрагмент лиганда), принимаются в качестве буферной области (см. Рисунок 1). Критерии расстояния для выбора буферной области для каждого фрагмента лиганда такие же, как и для каждого остатка в белке.

Рисунок 1 . Схема фрагментации лиганда в AF-QM / MM. (A) Лиганд разделен на три фрагмента. Каждый фрагмент лиганда принимают за сердцевину. Буферная область содержит оставшуюся часть остатков лиганда и белка в пределах определенного порогового расстояния от центральной области (см. Текст для более подробной информации). Ядро и буферные области рассчитываются на уровне QM, в то время как остальная часть системы описывается вложенными зарядами. (B) Определение каждой области ядра хромофора. Фрагмент 1: нафтоатная группа; фрагмент 2: часть эндиинового кольца; фрагмент 3: аминосахарная группа. Буферная область имеет тот же цвет, что и основная область.

В этом исследовании мы принимаем следующие зависящие от расстояния критерии для включения остатков в буферной области каждой области ядра для лиганда: (1) если тяжелый атом остатка находится на расстоянии менее 3,5 Å от любого атома в области ядра , (2) если расстояние до атома водорода остатка меньше 3.0 Å от любого атома в области ядра. Отсечка обеспечивает достаточный размер буферной области для сходимости расчетов химического сдвига в области ядра (Flaig et al., 2012). Остальные остатки за пределами буферной области описываются включением зарядов для учета электростатического поля за пределами области QM. Заряды белка были получены непосредственно из силового поля ff99SB. Для назначения буферной области для каждого остатка (где каждый остаток определяется как центральная область) лиганд обрабатывают как целую молекулу (нефрагментированную), и определение буферной области следует тем же критериям, что и апо-белок.Оборванные связи закрыты атомами водорода для построения фрагмента с замкнутой оболочкой.

Расчеты QM фрагментов проводились параллельно на уровне B3LYP / 6-31G **. Все расчеты QM проводились с использованием пакета Gaussian 09 (Frisch et al., 2009). Только изотропные экранирования ЯМР атомов центральной области были собраны из расчета QM каждого фрагмента. Химические сдвиги ¹ H получены путем обращения к таковому для тетраметилсилана (TMS) на том же вычислительном уровне, который равен 31.66 частей на миллион. Неявная сольватационная модель была применена для аппроксимации эффекта растворителя. Распределение заряда белка поляризует диэлектрический раствор и создает поле реакции, чтобы воздействовать на растворенное вещество до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие. Поле реакции, действующее на растворенное вещество, может быть эффективно представлено индуцированными зарядами на поверхности полости. В этой работе поверхностные заряды рассчитываются по модели Пуассона-Больцмана (PB) с использованием программы Delphi (Rocchia et al., 2001). Набор точечных зарядов в среде ММ и на поверхности молекулы, представляющий поле реакции, используется в качестве фоновых зарядов при расчете КМ.Поскольку вычислительные затраты на расчеты химического сдвига QM будут резко увеличены для нескольких конфигураций, если принять во внимание эффект конформационной выборки. В этом исследовании оптимизированная рентгеновская структура с использованием молекулярного силового поля была взята в качестве типичной конфигурации для структуры усреднения ансамбля.

Функции подсчета очков

Чтобы отличить структуру связывания нативный белок-лиганд от поз-приманок, здесь мы предлагаем функцию оценки, основанную на химических сдвигах ЯМР (оценка CS ), которая представляет собой просто среднеквадратичное отклонение (RMSD) вычисленных химических сдвигов с ссылка на экспериментальные значения,

CSscore = ∑i = 1N (δHi-δexpi) N (1)

, где δHi — химический сдвиг –-го атома водорода на лиганде и близлежащих остатках, а δexpi — экспериментальный химический сдвиг соответствующего атома в нативном комплексе (holo NCS). N — число атомов, химические сдвиги которых были выбраны в качестве молекулярного зонда для характеристики структуры связывания NCS-хромофора. В этом исследовании N был установлен на 31 для голо-NCS, 21 из которых являются неамидными протонами на хромофоре, а остальные 10 атомов водорода — с экспериментальными нарушениями химического сдвига (CSP, между связанными и несвязанными комплексами). более 0,5 частей на миллион от остатков в сайте связывания белка (см. рисунок 2 и таблицу S1 дополнительных материалов).

Рисунок 2 . Трехмерная структура переплетного кармана. Неполярные атомы водорода на лиганде и протеиновые протоны, значения CSP которых (между связанными и несвязанными комплексами) больше 0,5 ppm (обозначены желтым цветом), выбираются в оценочных функциях на основе химического сдвига (а именно, CS _оценка и CS _Gscore ).

Стоит отметить, что в уравнение (1) мы также могли бы добавить химические сдвиги атомов водорода, которые экспериментально не изменяются при связывании лиганда.Ложная поза стыковки может вызвать значительные отклонения в CSP для этих атомов водорода. Однако на остатках в связывающем кармане имеется много таких протонов, которые будут усреднять итоговую оценку, чтобы функция оценки не могла отличить нативную структуру от наборов-ловушек. Протоны с экспериментальными возмущениями более 0,5 ppm более чувствительны к позе связывания, поэтому мы учли эти атомы в функции подсчета очков. Кроме того, хотя химические сдвиги ЯМР протонов амида также очень чувствительны к локальному химическому окружению связывающего кармана, эти атомы были исключены из-за отсутствия экспериментальных данных.

Вторая функция оценки ( CS _Gscore ), которую мы предлагаем здесь, представляет собой линейную комбинацию оценки CS и оценки Glide,

CSGscore = CSscore + Оценка αGlide (2)

, где α — весовой коэффициент. В этом исследовании диапазоны CSscore и Glide Score составляют 0,42 ~ 2,90 и -10,96 ~ 10,98 (см. Таблицу S2 дополнительных материалов), соответственно, и поэтому мы выбираем α = (2,90–0,42) / (10,98 — (- 10,96). )) ≈ 0,1. Добавляя оценку Glide к оценке CS , можно избежать нефизической структуры с неблагоприятной энергией связи.Поскольку и оценка CS , и оценка Glide будут меньше по мере приближения стыковочной позы к экспериментальной структуре, исходная стыковочная поза даст самое низкое значение CS _Gscore .

Результаты и обсуждение

Сравнительный тест AF-QM / MM на комплексе связывания нативного NCS-хромофора

Сначала мы сравнили рассчитанные химические сдвиги на хромофоре между AF-QM / MM и расчетами систем большого размера. Поскольку голо-NCS содержит более 1500 атомов и был слишком большим для выполнения полных расчетов QM системы, мы альтернативно использовали весь лиганд и его буферную область для расчета QM большого размера.Другие атомы за пределами буферной области считаются фоновыми зарядами, а поверхностные заряды ПБ для всего комплекса также помещаются так, чтобы приблизиться к неявному растворителю. Рассчитанные химические сдвиги для такой модельной системы (около 460 атомов в области QM) приняты в качестве опорных значений. Здесь мы только сравниваем химические сдвиги на лиганде между расчетом AF-QM / MM и расчетом системы большого размера. Как показано на рисунке 3, химические сдвиги ¹ H на лиганде, рассчитанные методом AF-QM / MM (где лиганд разделен на три части), хорошо согласуются с расчетом системы большого размера.Средняя ошибка без знака (MUE) между результатами AF-QM / MM и химическими сдвигами из расчета крупноразмерной системы составляет 0,046 ppm, а RMSD между ними составляет 0,051 ppm. Результаты показывают, что подход AF-QM / MM может точно воспроизвести расчет крупногабаритной системы. Кроме того, на уровне DFT общая стоимость вычислений была снижена на 36%, с 5 601 мин (время ЦП) при вычислении системы большого размера до 3585 мин при разделении лиганда на 3 фрагмента. Кроме того, параллельно выполнялись 3 расчета QM / MM на основе фрагментов.Таким образом, время вычислительной стены можно дополнительно сократить примерно на 2/3.

Рисунок 3. (A) Система большого размера содержит лиганд и его буферную область (около 460 атомов) в голо-NCS. (B) Сравнение рассчитанных ¹ химических сдвигов H между расчетом крупногабаритной системы и подходом AF-QM / MM. «Полная система» означает расчет крупногабаритной системы.

Затем мы сравниваем рассчитанные химические сдвиги для апо и голо NCS (31 протон в связывающем кармане, как показано на рисунке 2) с экспериментальными значениями.В этом тесте результаты AF-QM / MM хорошо коррелируют с экспериментом (см. Рисунок 4). Для связанного комплекса MUE между расчетным и экспериментальным химическими сдвигами составляет 0,44 м.д., а RMSD составляет 0,57 м.д. Для несвязанного белка и лиганда MUE и RMSD между расчетными и экспериментальными химическими сдвигами составляют 0,45 и 0,62 частей на миллион, соответственно.

Рисунок 4 . Сравнение результатов AF-QM / MM и экспериментальных ¹ H химических сдвигов (31 протон в связывающем кармане, как показано на рисунке 2) как для апо, так и для голо NCS.

Прогнозирование возмущений химического сдвига (CSP) между апо и голографическим NCS могло бы дополнительно подтвердить точность подхода AF-QM / MM. Среди атомов водорода в связывающем кармане, h25, h41 лиганда, HD2 Leu45 и HB2 Cys37 значительно зависят от эффекта кольцевого тока, где они близки к ароматическим кольцам в нативной голоструктуре (см. Рисунок 5). . В результате для этих атомов наблюдались большие сдвиги в сильное поле при связывании лиганда. Экспериментальные CSP этих четырех атомов (а именно, h25, h41, Leu45: HD2 и Cys37: HB2) равны -0.93, -0,86, -1,15 и -0,72 частей на миллион, соответственно, тогда как результаты AF-QM / MM для них составляют -0,45, -0,34, -1,25 и -0,71 частей на миллион. Результаты показывают, что большие нарушения химического сдвига между системами апо и голо белок-лиганд могут быть точно предсказаны с помощью подхода AF-QM / MM.

Рисунок 5 . Рентгеновская структура голографической НКС. CSP для протонов h25 (a) и h41 (b) в хромофоре, Leu45: HD2 (c) и Cys37: HB2 (d) в NCS, значительно зависят от кольцевого тока. эффект.

Показатели по шкале CS

Функция подсчета баллов

Оценки за скольжение 38 пристыкованных ложных целей и исходной голографической NCS показаны на рисунке 6. Функция оценки на основе энергии способна отличить экспериментальную структуру от стыкованных поз, структурные RMSD которых больше 4 Å по отношению к исходной позе. . Однако для закрепленных поз, среднеквадратичное отклонение которых составляет от 2 до 4 Å, их оценка за скольжение иногда очень близка к экспериментальной структуре (см. Позу 7 на рисунке 6A).Напротив, по шкале CS легче отличить экспериментальную структуру от наборов приманок, структурные RMSD которых составляют около 2 Å. В основном это связано с тем, что химические сдвиги весьма чувствительны к местной химической среде в месте связывания. При оценке CS протоны в лиганде и выбранные атомы водорода в белковых остатках служат в качестве молекулярных зондов для обнаружения среды связывания. Когда протоны имеют разные тесные контакты между нативными и ложными структурами, такие как взаимодействия с ароматическими кольцами или водородными связями, расчетный химический сдвиг определенных протонов может иметь существенные отклонения между различными режимами связывания.Следовательно, изменение химических сдвигов ЯМР протонов может четко отражать соответствующие связывающие взаимодействия между белком и лигандом.

Рисунок 6 . Оценки Glide (A) и CSscore (B) с различными структурными RMSD хромофора в голографической NCS. Зеленая точка представляет собой оценку позы связывания на рентгеновской структуре голографической NCS. Красные, желтые и фиолетовые точки обозначают стыковочные позы 7, 10 и 18 соответственно.

Сравнение рассчитанных химических сдвигов между нативной позой и позой стыковки может исследовать структурные изменения поз связывания лиганда между ними. На рис. 7 показано, что для положений нафтоатной группы и ендиинового кольца в позе 7 хромофор очень близок к нативной связывающей структуре. Однако группа аминосахаров указывает на другое направление, что приводит к большим отклонениям химических сдвигов для h23 и h25 лиганда (см. Таблицу 1).

Рисунок 7 .Сравнение связывающей структуры позы 7 и естественной связывающей позы. Модель зеленой палочки обозначает естественную позу привязки, а модель красной палочки обозначает структуру привязки Позы 7 из программы стыковки Gilde. Группа аминосахара в хромофоре была смещена в позе стыковки 7 по сравнению с экспериментальной структурой.

Таблица 1 . Сравнение экспериментальных и расчетных химических сдвигов (в ppm).

Слабость CS _{с оценкой} заключается в том, что для ловушек с более крупными структурными RMSD функция оценки на основе химического сдвига может быть не такой эффективной, как у тех, у кого структурные RMSD низкие.В диапазоне высоких структурных среднеквадратичных отклонений некоторые позы лигандов могут быть близки к состоянию апо (меньше взаимодействий с белком), а оценка CS для состояния апо хромофора составляет 0,60. Следовательно, ранжирование этих поз не очень чувствительно к структурным RMSD с использованием CS _балла . Примеры случаев для поз 10 и 18 будут обсуждаться в разделе «Улучшение гибридной функции подсчета очков CS _Gscore ».

Улучшение гибридной CS

_Gscore Функция подсчета очков

На рис. 8 показано, что по шкале CS _Gscore можно отличить экспериментальную структуру от ловушек для комплекса белок-лиганд.В этой работе весовой коэффициент α в уравнении (2) должен был быть установлен равным 0,1, чтобы CS _набрал баллов и оценки Glide по той же шкале. Как показано на Рисунке 8, для поз, структурные RMSD которых составляют около 2–4 Å, оценка CS по химическим сдвигам ЯМР доминирует над оценочной функцией. Несмотря на то, что оценка Glide для структур-приманок близка к экспериментальной (см. Рисунок 6B), оценка CS _{может отличить экспериментальную структуру от ложных, в результате чего CS Gscore (комбинация оценок CS и Оценка скольжения) явно оценила позу нативного связывания как наиболее благоприятную структуру.С другой стороны, для поз-приманок, структурные RMSD которых больше 4 Å, функция оценки на основе энергии (оценка скольжения) имеет большое влияние на CS Gscore , что заставляет приманки с большими структурными RMSD больше отклоняться от экспериментальных структура по сравнению с CS оценка баллов (Рисунок 6B).}

Рисунок 8 . Рейтинг аборигенов (зеленый) и стыковочных структур (красный: поза 7; желтый: поза 10; фиолетовый: поза 18; и синий: другие закрепленные позы, предсказанные Glide), рассчитанные с помощью CS _Gscore .

Поза 10 ранее получала низкую оценку в CS _{с оценкой} , среднеквадратичное значение химического сдвига которого составляет 0,70 ppm между расчетными и экспериментальными данными. Нафтоатная группа лиганда была перевернута в стыковочной структуре, в то время как положения других областей хромофора аналогичны позе нативного связывания (см. Фигуру 9). В нафтоатной группе h33 имеет наибольшее отклонение химического сдвига между нативной структурой связывания и позой 10. В позе нативного связывания h33 находится рядом с ароматическим кольцом, что вызывает химический сдвиг в слабом поле h33.Находясь в позе 10, атом h33 удаляется от индольного кольца Trp39, в результате чего его расчетный химический сдвиг намного ниже, чем у экспериментальной структуры (см. Таблицу 2). Кроме того, на рис. 9а показано, что в позе 10 h41 удаляется от фенильного кольца Phe52, и соответствующее химическое экранирование снижается, что приводит к более высокому химическому сдвигу ЯМР. Кроме того, поскольку положение ароматического кольца нафтоатной группы перемещается в стыковочной структуре, химический сдвиг ¹ H на окружающих белковых остатках, таких как Cys37: HB3, также значительно изменился.Между тем, поскольку нафтоатное кольцо сильно влияло на химические сдвиги ¹ H из несвязанного в связанное состояния, отклонение нафтоатной группы в Позе 10 привело к тому, что химические сдвиги меньше влияют на связывание лиганда, что приводит к немного более высокому CS _{. набрать} баллов (см. Рисунок 6В, но другие группы близки к родному состоянию). Принимая во внимание физические несвязанные взаимодействия между NCS и хромофором, нафтоатная группа остается глубоко внутри связывающего кармана в нативном состоянии, что вносит наибольший вклад в энергию связывания NCS-хромофора.Следовательно, структурная деформация в позе 10 привела к тому, что энергия взаимодействия между ними стала слабее, и соответствующий показатель скольжения дал более низкий ранг. В гибридной функции оценки CS _Gscore рейтинг позы 10 четко отделен от экспериментальной структуры, поскольку он включает как отклонения химического сдвига ЯМР от экспериментальных данных, так и энергию физического взаимодействия между белком и лигандом.

Рис. 9. (a) Связывающие структуры позы 10 (оранжевый) и естественной позы (зеленый).Переворот нафтоатной группы заставил h41 и Cys37: HB3 отойти от области ароматического кольца, что вызовет химический сдвиг в сильном поле. (b) Для позы 10 h33 перемещается от области ароматического кольца, что вызывает химический сдвиг в слабое поле.

Таблица 2 . Сравнение экспериментальных и рассчитанных химических сдвигов для модели нативного связывания и позы 10 (в ppm).

Поза стыковки 18 также является случаем, когда функция энергии более важна, чем оценка CS _{при ранжировании поз стыковки.На фиг.10 показано, что положение лиганда в позе 18 почти транслируется в направлении от кармана связывания. По мере удаления нафтоатного кольца химическая защита Cys37: HB2, Cys37: HB3 и Leu45: HD2 снижалась по сравнению с нативным состоянием (см. Таблицу 3). Поза лиганда 18 ближе к состоянию апо, что привело к высокому баллу CS и баллу , но энергия взаимодействия между хромофором и NCS будет явно слабее, чем у нативного состояния, а оценка Glide для позы 18 составляет существенно выше, чем нативная поза связывания (см. фиг. 6А).Следовательно, в гибридной функции оценки CS Gscore рейтинг позы 18 явно ниже, чем в исходном состоянии, что правильно отражает то, что рейтинги снижаются по мере того, как структурные RMSD становятся больше.}

Рисунок 10 . Структуры позы 18 (фиолетовый) и естественного состояния (зеленый). Хромофор в позе 18 сместился от положения нативного состояния, в результате чего Cys37: HB2, Cys37: HB3 и Leu45: HD2 отошли от ароматических колец хромофора.

Таблица 3 . Сравнение экспериментальных и расчетных химических сдвигов в исходном состоянии и в позе стыковки 18 (в ppm).

Заключение

В данной работе мы применили автоматизированный метод фрагментации для расчета КМ / ММ химических сдвигов ЯМР для комплексов связывания белок-лиганд. В подходе AF-QM / MM химические сдвиги атомного ЯМР были получены путем автоматического разделения белка на фрагменты, ориентированные на остатки. Чтобы снизить вычислительные затраты для лиганда, хромофор, содержащий 81 атом, также был разделен на три меньших фрагмента, чтобы сделать размер QM для расчета лиганда сравнимым с фрагментами белка.Подход AF-QM / MM с неявной сольватационной обработкой является эффективным с точки зрения вычислений и линейным масштабированием с низким предварительным фактором. Более того, этот подход во многом параллелен и может применяться для рутинного расчета ab initio химических сдвигов ЯМР для комплексов белок-лиганд любого размера.

Химические сдвиги ¹ H, рассчитанные с помощью подхода AF-QM / MM на уровне DFT, хорошо согласуются с расчетом системы большого размера, где весь лиганд и его буферная область обрабатываются QM, а оставшиеся атомы белки описываются фоновыми зарядами.MUE между AF-QM / MM и расчетом крупногабаритной системы составляет 0,046 ppm. Кроме того, MUE между расчетными и экспериментальными ¹ H химическими сдвигами в связывающем кармане апо и голо NCS составляют 0,45 и 0,44 м.д., соответственно. Наши результаты демонстрируют, что подход AF-QM / MM способен воспроизводить расчеты химических сдвигов ЯМР для комплексов белок-лиганд в крупноразмерной системе ab initio , и рассчитанные химические сдвиги хорошо согласуются с экспериментальными результатами.

Результаты оценки CS баллов показывают, что химические сдвиги можно использовать в качестве молекулярных зондов для обнаружения конформации связывания комплекса белок-лиганд. Экспериментальная структура имеет явный лидирующий рейтинг по сравнению с позами связывания ложных целей. Изучая паттерны CSP структур-ловушек, изменения положения лиганда могут быть обнаружены по вариациям химических сдвигов в различных локальных химических условиях.

В этом исследовании мы также предложили гибридную функцию оценки CS _Gscore , которая сочетает в себе оценку CS и функцию оценки на основе энергии для оценки скольжения.Гибридная функция подсчета очков CS _Gscore может помочь отличить структуру нативного лиганда от поз стыковки-приманки. CS _Gscore также может четко отделить оценки структур-ловушек, которые имеют значительно большие структурные значения RMSD и дают относительно низкие оценки CS баллов, от естественной стыковочной позы. CS _Gscore включает в себя как экспериментальную информацию о химическом сдвиге ЯМР, так и метод оценки на основе энергии, который может лучше определять структуру сайта связывания комплекса белок-лиганд.Следовательно, подход AF-QM / MM обеспечивает точную и эффективную платформу для предсказания структуры связывания белок-лиганд на основе информации, полученной с помощью ЯМР.

Авторские взносы

XH разработал исследование; XJ, TZ и XH проводили исследования; XJ, TZ, JZ и XH проанализировали данные; и XJ и XH написали статью.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (грант № 2016YFA0501700), Национальным фондом естественных наук Китая (№№ 21673074, 21761132022 и 21433004), Молодежной программой поддержки первоклассных талантов Шанхая, Центром NYU-ECNU по вычислительной химии в Нью-Йоркском университете Шанхая и округе Путуо Шанхая (грант 2014-A-02). Мы благодарим Суперкомпьютерный центр Восточно-Китайского педагогического университета за предоставленное время для вычислений.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fchem.2018.00150/full#supplementary-material

Список литературы

Адении, А.А., Солиман, М.Э.С. (2017). Внедрение QM в расчеты стыковки: это пустая трата вычислительного времени? Drug Discov. Сегодня 22, 1216–1223. DOI: 10.1016 / j.drudis.2017.06.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Aguirre, C., ten Brink, T., Cala, O., Guichou, J.-F., and Krimm, I. (2014). Структура белок-лиганд определяется возмущениями химического сдвига протонов в основной и боковой цепи. J. Biomol. ЯМР 60, 147–156. DOI: 10.1007 / s10858-014-9864-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Братхольм, Л. А., и Дженсен, Дж. Х. (2017). Уточнение структуры белка с использованием предсказателя химической защиты на основе квантовой механики. Chem. Sci. 8, 2061–2072. DOI: 10.1039 / C6SC04344E

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дело, Д. А. (1998). Использование химических сдвигов и их анизотропии в определении структуры биомолекул. Curr. Opin. Struct. Биол. 8, 624–630. DOI: 10.1016 / S0959-440X (98) 80155-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Case, D., Darden, T., Cheatham, T. E. III., Simmerling, C., Wang, J., Duke, R., et al. (2012). ЯНТАРЬ 12 . Сан-Франциско, Калифорния: Калифорнийский университет.

Кавалли А., Сальвателла Х., Добсон К. М. и Вендрусколо М. (2007). Определение структуры белков по химическим сдвигам ЯМР. Proc. Nat. Акад.Sci. США 104, 9615–9620. DOI: 10.1073 / pnas.0610313104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Christensen, A. S., Linnet, T. E., Borg, M., Boomsma, W., Lindorff-Larsen, K., Hamelryck, T., et al. (2014). Проверка и уточнение структуры белков с использованием химических сдвигов амидных протонов, полученных из квантовой механики. PLoS ONE 8: e84123. DOI: 10.1371 / journal.pone.0084123

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чоффи, М., Хантер, К. А., Пакер, М. Дж., Пандья, М. Дж., И Уильямсон, М. П. (2008). Использование количественных изменений химического сдвига ¹ H ЯМР для стыковки лиганда с барназой. J. Biomol. ЯМР 43, 11–19. DOI: 10.1007 / s10858-008-9286-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цуй, К., и Карплюс, М. (2000). Молекулярные свойства из комбинированных методов QM / MM. 2. химические сдвиги в больших молекулах. J. Phys. Chem. B 104, 3721–3743. DOI: 10.1021 / jp994154g

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Элдридж, М.Д., Мюррей, К. В., Аутон, Т. Р., Паолини, Г. В., и Ми, Р. П. (1997). Функции эмпирической оценки: I. Разработка быстрой эмпирической функции оценки для оценки сродства связывания лигандов в рецепторных комплексах. J. Comput. Помощь Мол. Des. 11, 425–445.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Englebienne, P., and Moitessier, N. (2009). Стыковка лигандов в гибкие и сольватированные макромолекулы. 5. Основанное на силовом поле прогнозирование аффинности связывания лигандов с белками. J. Chem. Инф. Модель. 49, 2564–2571. DOI: 10.1021 / ci

1k

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Феррейра Л., душ Сантуш Р., Олива Г. и Андрикопуло А. (2015). Молекулярный докинг и стратегии дизайна лекарств на основе структуры. Молекулы 20, 13384–13421. DOI: 10,3390 / молекулы200713384

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флэйг Д., Бир М. и Оксенфельд К. (2012). Сходимость электронной структуры с размером области QM: пример экранирования QM / MM ЯМР. J. Chem. Теор. Comput. 8, 2260–2271. DOI: 10.1021 / ct300036s

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Франк А., Мёллер Х. М. и Экснер Т. Э. (2012). К квантово-химическому расчету химических сдвигов белков ЯМР. 2. Уровень теории, основы и зависимость модели от растворителей. J. Chem. Теор. Comput. 8, 1480–1492. DOI: 10.1021 / ct200913r

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фриснер Р.А., Бэнкс, Дж. Л., Мерфи, Р. Б., Халгрен, Т. А., Кличич, Дж. Дж., Майнц, Д. Т. и др. (2004). Glide: новый подход к быстрой и точной стыковке и подсчету очков. 1. Методика и оценка точности стыковки. J. Med. Chem. 47, 1739–1749. DOI: 10.1021 / jm0306430

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Frisch, M., Trucks, G., Schlegel, H. B., Scuseria, G., Robb, M., Cheeseman, J., et al. (2009). по Гауссу 09 . Уоллингфорд, Коннектикут: Gaussian Inc.

Google Scholar

Гао, К., Йокодзима, С., Федоров, Д. Г., Китаура, К., Сакураи, М., и Накамура, С. (2010). Расчеты химического сдвига ЯМР на основе фрагментно-молекулярно-орбитального метода для больших молекулярных систем. J. Chem. Теор. Comput. 6, 1428–1444. DOI: 10.1021 / ct100006n

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гао, К., Йокодзима, С., Коно, Т., Исида, Т., Федоров, Д. Г., Китаура, К., и др. (2007). Расчеты химического сдвига ЯМР ab initio белков с использованием фрагментных молекулярных орбиталей с электростатическим окружением. Chem. Phys. Lett. 445, 331–339. DOI: 10.1016 / j.cplett.2007.07.103

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарай П. Г., Мартин О. А., Шерага Х. А. и Вила Дж. А. (2014). Факторы, влияющие на расчет экранирования ¹³ C в дисахаридах. J. Comput. Chem. 35, 1854–1864. DOI: 10.1002 / jcc.23697

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гринтер, С., Цзоу, X. (2014). Проблемы, приложения и недавние достижения стыковки белок-лиганд в разработке лекарств на основе структуры. Молекулы 19, 10150–10176. DOI: 10.3390 / молекулы1

150

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Халгрен, Т. А., Мерфи, Р. Б., Фриснер, Р. А., Берд, Х. С., Фрай, Л. Л., Поллард, В. Т. и др. (2004). Glide: новый подход к быстрой и точной стыковке и подсчету очков. 2. Факторы обогащения при проверке базы данных. J. Med. Chem. 47, 1750–1759. DOI: 10.1021 / jm030644s

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хан, Б., Лю Ю., Гинзингер С. В., Вишарт Д. С. (2011). SHIFTX2: значительно улучшенное предсказание химического сдвига белка. J. Biomol. ЯМР 50, 43–57. DOI: 10.1007 / s10858-011-9478-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хартман, Дж. Д., Беран, Г. Дж. О. (2014). Метод электронной структуры на основе фрагментов для расчета химических сдвигов ядерного магнитного резонанса в молекулярных кристаллах. J. Chem. Теор. Comput. 10, 4862–4872. DOI: 10.1021 / ct500749h

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хе Х., Ван Б. и Мерц К. М. младший (2009). Расчеты химического сдвига ЯМР белков на основе метода автоматизированной фрагментации QM / MM. J. Phys. Chem. B 113, 10380–10388. DOI: 10.1021 / jp

2p

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хэ Х., Чжу Т., Ван Х., Лю Дж. И Чжан Дж. З. (2014). Фрагментный квантово-механический расчет белков и его приложения. В соотв. Chem. Res. 47, 2748–2757. DOI: 10.1021 / ar500077t

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуанг, С.-Й., и Цзоу, X. (2006). Итеративная функция оценки, основанная на знаниях, для прогнозирования взаимодействий белок-лиганд: I. Получение потенциалов взаимодействия. J. Comput. Chem. 27, 1866–1875. DOI: 10.1002 / jcc.20504

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джакалиан А., Джек Д. Б. и Бейли К.И. (2002). Быстрая и эффективная генерация качественных атомных зарядов. Модель AM1-BCC: II. параметризация и проверка. J. Comput. Chem. 23, 1623–1641. DOI: 10.1002 / jcc.10128

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цзинь, X., Чжу, Т., Чжан, Дж. З., и Хэ, X. (2016). Систематическое исследование расчета химического сдвига РНК ЯМР на основе автоматизированного подхода QM / MM фрагментации. RSC Adv. 6, 108590–108602. DOI: 10.1039 / C6RA22518G

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йоргенсен, В.Л. и Дженсон К. (1998). Температурная зависимость воды TIP3P, SPC и TIP4P из моделирования NPT Монте-Карло: поиск температур максимальной плотности. J. Comput. Chem. 19, 1179–1186. DOI: 10.1002 / (SICI) 1096-987X (19980730) 19: 103.0.CO; 2-J

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лодевик, М. В., Зиберт, М. Р., и Тантилло, Д. Дж. (2012). Вычислительное предсказание химических сдвигов ¹ H и ¹³ C: полезный инструмент для естественных продуктов, механистической и синтетической органической химии. Chem. Rev. 112, 1839–1862. DOI: 10.1021 / cr200106v

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маккой, М.А., и Висс, Д.Ф. (2002). Пространственная локализация сайтов связывания лиганда с поверхностей плотности электронного тока, рассчитанная на основе возмущений химического сдвига ЯМР. J. Am. Chem. Soc. 124, 11758–11763. DOI: 10.1021 / ja026166c

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Медек, А., Хайдук, П. Дж., Мак Дж. И Фесик С. В. (2000). Использование дифференциальных химических сдвигов для определения местоположения сайта связывания и ориентации лигандов, связанных с белками. J. Am. Chem. Soc. 122, 1241–1242. DOI: 10.1021 / ja993921m

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мохан В., Гиббс А.С., Каммингс М.Д., Джагер Э.П. и ДеДжарле Р.Л. (2005). Стыковка: успехи и проблемы. Curr. Drug Metab. 11, 323–333. DOI: 10.2174 / 1381612053382106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моханти, С., Зикер, Л. К., и Дробный, Г. П. (1994). Последовательное отнесение ¹ H ЯМР комплекса апонеокарзиностатина с бромидом этидия и исследование взаимодействий белок-лекарство в сайте связывания хромофора. Биохимия 33, 10579–10590. DOI: 10.1021 / bi00201a003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моррис Г. М., Гудселл Д. С., Холлидей Р. С., Хьюи Р., Харт В. Э., Белью Р. К. и др. (1998). Автоматическая стыковка с использованием генетического алгоритма Ламарка и эмпирической функции свободной энергии связи. J. Comput. Chem. 19, 1639–1662. DOI: 10.1002 / (SICI) 1096-987X (19981115) 19: 143.0.CO; 2-B

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мюррей К. В., Аутон Т. Р. и Элдридж М. Д. (1998). Эмпирические оценочные функции. II. Тестирование эмпирической функции оценки для предсказания аффинности связывания лиганд-рецептор и использование байесовской регрессии для улучшения качества модели. J. Comput. Помощь Мол. Des. 12, 503–519.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Майерс, А.Г., Протеу П. Дж. И Гендель Т. М. (1988). Стереохимическое отнесение хромофора неокарзиностатина. Структуры аддуктов хромофор-метилтиогликолят неокарзиностатина. J. Am. Chem. Soc. 110, 7212–7214.

Google Scholar

Нил С., Нип А. М., Чжан Х. и Вишарт Д. С. (2003). Быстрый и точный расчет химических сдвигов белка ¹ H, ¹³ C и ¹⁵ N. J. Biomol. ЯМР 26, 215–240. DOI: 10.1023 / A: 1023812930288

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ридингер, К., Эндикотт, Дж. А., Кемп, С. Дж., Смит, Л. А., Уотсон, А., Валер, Э. и др. (2008). Анализ изменений химического сдвига показывает способы связывания изоиндолиноновых ингибиторов взаимодействия MDM2-p53. J. Am. Chem. Soc. 130, 16038–16044. DOI: 10.1021 / ja8062088

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Робустелли П., Кольхофф К., Кавалли А. и Вендрусколо М. (2010). Использование химических сдвигов ЯМР в качестве структурных ограничений при моделировании молекулярной динамики белков. Структура 18, 923–933. DOI: 10.1016 / j.str.2010.04.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Роккиа В., Алексов Э. и Хониг Б. (2001). Расширение применимости нелинейного уравнения Пуассона-Больцмана: множественные диэлектрические проницаемости и многовалентные ионы. J. Phys. Chem. B 105, 6507–6514. DOI: 10.1021 / jp010454y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шаус, С.Э., Кавальери, Д., и Майерс, А.Г. (2001). Анализ транскрипции генов Saccharomyces cerevisiae, подвергнутых воздействию комплекса белок неокарзиностатин-хромофор, выявляет доказательства повреждения ДНК, потенциального механизма устойчивости и последствий длительного воздействия. Proc. Nat. Акад. Sci. США 98, 11075–11080. DOI: 10.1073 / pnas.1

698

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шен Ю. и Бакс А. (2010). SPARTA +: небольшое улучшение эмпирического предсказания химического сдвига ЯМР с помощью искусственной нейронной сети. J. Biomol. ЯМР 48, 13–22. DOI: 10.1007 / s10858-010-9433-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Śledź, P., and Caflisch, A. (2018). Дизайн лекарств на основе структуры белков: от докинга до молекулярной динамики. Curr. Opin. Struct. Биол. 48, 93–102. DOI: 10.1016 / j.sbi.2017.10.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Swails, J., Zhu, T., He, X., and Case, D. A. (2015). AFNMR: автоматизированный квантово-механический расчет фрагментации химических сдвигов ЯМР для биомолекул. J. Biomol. ЯМР 63, 125–139. DOI: 10.1007 / s10858-015-9970-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Такашима, Х., Ёсида, Т., Ишино, Т., Хасуда, К., Окубо, Т., и Кобаяши, Ю. (2005). Исследование структуры ЯМР раствора для механизма высвобождения хромофора неокарзиностатина из голопротеина. J. Biol. Chem. 280, 11340–11346. DOI: 10.1074 / jbc.M411579200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тан, Х.-J., И Беттенс, Р. П. (2013). Расчеты химического сдвига Ab initio ЯМР на основе комбинированного метода фрагментации. Phys. Chem. Chem. Phys. 15, 7541–7547. DOI: 10.1039 / c3cp50406a

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тен Бринк, Т., Агирре, К., Экснер, Т. Э. и Кримм, И. (2015). Выполнение стыковки белок-лиганд с моделированием возмущений химического сдвига. J. Chem. Инф. Модель. 55, 275–283. DOI: 10.1021 / ci500446s

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Виктора, А., Мёллер, Х. М., Экснер, Т. Э. (2014). Точное ab initio предсказание химических сдвигов ЯМР нуклеиновых кислот и комплексов нуклеиновых кислот / белков. Nucleic Acids Res. 42, e173 – e173. DOI: 10.1093 / nar / gku1006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вила, Дж. А., Арнаутова, Ю. А., Мартин, О. А., и Шерага, Х. А. (2009). Квантовая механика ¹³ C ^α сервер химического сдвига (CheShift) для проверки структуры белка. Proc. Nat. Акад. Sci. США 106, 16972–16977. DOI: 10.1073 / pnas.0

3106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Б. и Мерц К. М. младший (2010). Важность динамики петли в механизмах связывания и высвобождения хромофора неокарзиностатина. Phys. Chem. Chem. Phys. 12, 3443–3449. DOI: 10.1039 / b924951f

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Б., Вестерхофф Л. М. и Мерц К.М. (2007). Критическая оценка эффективности функций оценки белок-лиганд на основе возмущений химического сдвига ЯМР. J. Med. Chem. 50, 5128–5134. DOI: 10.1021 / jm070484a

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Дж., Вольф Р. М., Колдуэлл Дж. У., Коллман П. А. и Кейс Д. А. (2004). Разработка и тестирование общего янтарного силового поля. J. Comput. Chem. 25, 1157–1174. DOI: 10.1002 / jcc.20035

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сюй, X.-П., И Кейс, Д.А. (2001). Автоматическое предсказание химических сдвигов ¹⁵ N, ¹³ C ^α , ¹³ C ^β и ¹³ C ‘в белках с использованием базы данных с функциональной плотностью. J. Biomol. ЯМР 21, 321–333. DOI: 10.1023 / A: 1013324104681

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ю. З., Ли П., Мерц К. М. (2017). Использование индуцированных лигандом нарушений химического сдвига белков для определения структур белок-лиганд. Биохимия 56, 2349–2362. DOI: 10.1021 / acs.biochem.7b00170

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжу Т., Хэ Х. и Чжан Дж. З. (2012). Расчет химических сдвигов ЯМР для белков с неявной сольватацией с помощью функциональной теории плотности фрагментов. Phys. Chem. Chem. Phys. 14, 7837–7845. DOI: 10.1039 / C2CP23746F

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhu, T., Zhang, J. Z. H., and He, X.(2013). Автоматический расчет химических сдвигов амидных протонов в белках с помощью QM / MM с использованием явной модели растворителя. J. Chem. Теор. Comput. 9, 2104–2114. DOI: 10.1021 / ct300999w

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжу, Т., Чжан, Дж. З. Х., Хе, X. (2014). Коррекция ошибочно упакованных боковых цепей белка в структуре ЯМР на основе ab initio расчетов химического сдвига. Phys. Chem. Chem. Phys. 16, 18163–18169.DOI: 10.1039 / C4CP02553A

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжу, Т., Чжан, Дж. З. Х., Хэ, X (2015). «Квантовый расчет химических сдвигов белкового ЯМР на основе автоматизированного метода фрагментации», в Advance in Structural Bioinformatics , ред. Д. Вей, К. Сюй, Т. Чжао и Х. Дай (Дордрехт: Springer), 827, 49– 70.

Google Scholar

Молекулярные основы химической денатурации белков мочевиной

Реферат

Моделирование молекулярной динамики протеина химотрипсин-ингибитор 2 в 8 М мочевине при 60 ° C было предпринято для исследования молекулярных основ химической денатурации.Белок быстро разворачивался в этих условиях, но при контрольной моделировании в воде при той же температуре он сохранил свою естественную структуру. Общий процесс разворачивания в мочевине был аналогичен наблюдаемому при моделировании термической денатурации выше T _m белка при 75 ° C. Первым шагом в развертывании было расширение гидрофобного ядра. Затем керн сольватировали водой, а затем мочевиной. Денатурированные структуры как в мочевине, так и при высокой температуре содержали остаточную нативную спиральную структуру, тогда как β-структура была полностью разрушена.Среднее время пребывания мочевины вокруг гидрофильных групп было в шесть раз больше, чем вокруг гидрофобных остатков, и во всех случаях больше, чем соответствующее время пребывания в воде. Самодиффузия воды снижалась на 40% в 8 М мочевине. Мочевина изменила структуру и динамику воды, тем самым уменьшив гидрофобный эффект и способствуя сольватации гидрофобных групп. Кроме того, из-за ослабления структуры воды мочевиной вода стала свободно конкурировать с внутрибелковыми взаимодействиями. Мочевина также напрямую взаимодействует с полярными остатками и пептидным остовом, тем самым стабилизируя неродные конформации.Это моделирование предполагает, что мочевина денатурирует белки с помощью как прямых, так и косвенных механизмов.

Небольшие органические молекулы в водном растворе могут оказывать сильное влияние на стабильность, структуру и функцию белка. Использование этих растворов для стабилизации или дестабилизации белков в зависимости от сорастворителя является обычным явлением. На самом деле исследования белков проводятся почти исключительно в комплексных растворах. Химическая денатурация с помощью такого агента, как мочевина, является одним из основных способов оценки стабильности белка, влияния мутаций на стабильность и развертывания белка (1).Несмотря на широкое распространение, молекулярная основа способности мочевины денатурировать белки остается неизвестной. Мочевина может оказывать свое действие напрямую, связываясь с белком, или косвенно, изменяя среду растворителя (2–20). Большинство версий модели прямого взаимодействия постулируют, что мочевина связывается и стабилизирует денатурированное состояние (D), тем самым способствуя разворачиванию. Но эта интерпретация не объясняет, как белок преодолевает кинетический барьер для разворачивания. В связи с этим мочевина может связываться с белком и конкурировать с нативными взаимодействиями, тем самым активно участвуя в процессе разворачивания.В качестве альтернативы было предложено, что мочевина действует косвенно, изменяя среду растворителя, тем самым смягчая гидрофобный эффект и облегчая обнажение остатков в гидрофобном ядре. Также возможно, что механизм разворачивания, вызванного мочевиной, зависит от концентрации мочевины. К сожалению, кажется маловероятным, что экспериментальные подходы предоставят молекулярные детали того, как мочевина денатурирует белки, поэтому мы используем моделирование молекулярной динамики (МД) с атомным разрешением для решения этой проблемы.

Использование реалистичных сорастворителей в МД-моделировании белков — редкость. На сегодняшний день опубликовано немного таких исследований: убиквитин в 60% метаноле (21), барназа в 8 М мочевине (22, 23), γ-химотрипсин в гексане (24) и субтилизин в диметилформамиде (25). Первое из этих исследований смогло продемонстрировать конформационное поведение, зависящее от растворителя, приводящее к частично развернутому состоянию убиквитина, согласующемуся с исследованиями ЯМР в тех же условиях растворителя. Исследования барназы в мочевине были направлены на изучение основ химической денатурации, как мы делаем здесь, но, к сожалению, их моделирование было слишком коротким (0.9–2 нс), даже при использовании повышенной температуры (87 ° C), чтобы денатурировать белок. Последние два исследования были разными и вместо этого содержали небольшое количество воды и были почти чистыми органическими растворителями, потому что авторы изучали функцию белков в органических средах. Таким образом, все еще существует потребность в дальнейшем исследовании влияния мочевины на белки, и теперь можно проводить гораздо более длительные симуляции, чтобы просмотреть всю координату реакции разворачивания.

При подготовке к моделированию, описанному здесь, мы рассмотрели влияние мочевины на структуру и динамику воды, особенно в отношении алканов (26) и циклических дипептидов (27).Мочевина мало влияет на структуру воды по отношению к функциям радиального распределения (26). Следовательно, мы использовали количество водородных связей на молекулу воды в качестве метрики, чтобы различать решения и силу водородной связи (28), потому что они могут выявить тонкие различия, не наблюдаемые в других усредненных по ансамблю свойствах. Число водородных связей на воду ниже в гидратной оболочке неполярных молекул, таких как октан, и эти воды ограничены из-за их усилий по максимальному взаимодействию с соседними водами при минимальном взаимодействии с углеводородами (26).

Мочевина приводит к аналогичному снижению взаимодействий вода-вода и прочности водородных связей, а также к локальному упорядочению воды вокруг полярных атомов мочевины, тем самым снижая штраф за воздействие растворителя на неполярные группы по сравнению с чистой водой (27). Интересно, что количество водородных связей на воду не может сходиться к постоянному значению, пока не будет достигнут радиус 6 Å от углеводорода или мочевины. Таким образом, проецирование мочевины на окружающую водную среду приводит к радиусу воздействия 6 Å “.«Сфера влияния примечательна: при такой низкой концентрации, как 4 M, 76% воды находится в контакте, по крайней мере, с одной молекулой мочевины. Таким образом, мочевина, по-видимому, лучше растворяет гидрофобные растворенные вещества за счет возмущения воды и, таким образом, предварительной загрузки растворителя для принятия неполярных групп за счет тонкого нарушения предпочтительной структуры воды и переориентации воды вокруг ее полярных атомов (27). При более высоких концентрациях между мочевиной и растворенным веществом наблюдается более прямое взаимодействие. Таким образом, наши предыдущие модельные исследования предполагают, что мочевина действует как прямо, так и косвенно на модельные соединения, но мы не знаем, применимо ли это к белкам.

Чтобы изучить механизм денатурации белков мочевиной, мы выполнили моделирование ингибитора химотрипсина 2 (CI2) в 8 M мочевине. CI2 был выбран для этого исследования из-за обширного количества доступной информации о его поведении при сворачивании / разворачивании как в теоретических, так и в экспериментальных исследованиях (29). Предыдущие исследования моделирования были сосредоточены на развертывании пути термической денатурации (30–35). Здесь мы описываем моделирование CI2 в 8 M растворе мочевины и в чистой воде (контроль) при 60 ° C [что ниже T _m белка (36)], уделяя особое внимание процессу развертывания.Результаты сравниваются с его поведением при разворачивании при высокой температуре (125 ° C) в воде (35).

Методы

МД моделирования были выполнены с использованием encad (37). Были описаны протоколы и потенциальные функции белков (38), воды (39) и мочевины (27). Моделирование началось с кристаллической структуры CI2 [1ypc (40)]. Было описано моделирование 125 ° C в воде (35).

Контрольная траектория CI2 в чистой воде была подготовлена ​​для MD путем сольватации белка с молекулами воды, простирающимися по крайней мере на 8 Å от любого атома белка, с получением 2596 воды.Объем коробки был отрегулирован для воспроизведения экспериментальной плотности 0,983 г / мл при 60 ° C (41). Было выполнено несколько шагов для дальнейшей подготовки системы к MD. Во-первых, только вода была минимизирована для 1001 шага, затем последовали 1001 шаг MD и еще 1001 шаг минимизации. Затем белок подвергали 1001 стадии минимизации. Наконец, вся система была минимизирована на 1001 шаг. Затем было проведено производственное моделирование. Использовалась отсечка без скрепления 8 Å с плавным усечением с силовым смещением, и список без скрепления обновлялся каждые два-пять шагов.Для уменьшения краевых эффектов в микроканоническом ансамбле использовались периодические граничные условия и соглашение о минимальном изображении. Затем моделирование проводилось в течение 20 нс с использованием временного шага 2 фс. Структуры сохранялись каждые 0,2 пс для анализа, в результате получалось 100 000 структур для каждой симуляции.

систем мочевины (8 M; мольная доля 0,186) были сконструированы путем случайной замены молекул воды мочевиной, в результате чего получили 2 103 молекулы воды и 493 молекулы мочевины. Объем коробки был отрегулирован для получения экспериментальной плотности для 60 ° C, 1.103 г / мл (42). Были выполнены три независимых моделирования 8 M мочевины: UR1, UR2 и UR3. Эти системы были подготовлены для MD путем изменения подготовительного протокола, описанного выше для CI2 в чистой воде, для создания независимых траекторий. Внесены следующие изменения: в UR1 выполнено 2001 (вместо 1001) начальные шаги минимизации системы растворителей; в UR2 был выполнен 2001 шаг (вместо 1001) динамики на растворителе; и при моделировании UR3 использовался базовый протокол, описанный выше.Производственное моделирование MD было выполнено, как описано выше.

Результаты

Свойства белка в различных средах с растворителями.

Во время моделирования отслеживали несколько общих свойств CI2 и растворителя. Сравнение среднеквадратичного отклонения Cα (rmsd) для всех траекторий показывает поразительный контраст между CI2 в воде и 8 M мочевине при 60 ° C (рис. 1 a ). Белок начал разворачиваться в мочевине в течение первых нескольких наносекунд, напоминая то, что происходило во время термической денатурации при 125 ° C (рис.1 a ).

Рисунок 1

Общие свойства CI2 в зависимости от условий моделирования. ( a ) Cα среднеквадратичное значение по кристаллической структуре. ( b ) Изменение во времени доступной площади поверхности неполярной боковой цепи для растворителя, рассчитанной с использованием модифицированной версии NACCESS (43).

Неполярная доступная для растворителя площадь поверхности при моделировании мочевины была больше, чем в воде (рис. 1 b ). Экспозиция ключевых остатков (Ile-20, Leu-49 и Ile-57) в гидрофобном ядре CI2 показана на рис.2. В каждом случае гидрофобные остатки ядра сначала сольватировали водой, а затем мочевиной (рис. 2). Доступные для растворителя площади поверхности этих ключевых остатков существенно увеличились в 8 M мочевине, в то время как они оставались погребенными при моделировании воды при 60 ° C (рис. 2). Несколько групп остатков испытали значительное увеличение сольватации в течение первых 2–3 нс в мочевине (рис. 3). Две из этих групп определяют верхний край гидрофобного ядра (остатки 9–11 и 55–58) и образуют ключевые водородные связи в нативном состоянии (N).На рис. 3 показаны снимки нескольких из этих остатков ядра, сольватированных между 0,2 и 8 нс при моделировании UR3. Боковые цепи этих гидрофобных краевых остатков стабильно сольватировались водой, а затем мочевиной до тех пор, пока неполярные внутрибелковые взаимодействия не были полностью экранированы растворителем. Водородная связь основной цепи в этой области между остатками 11 и 57 представляет собой пример прямой конкуренции за стабилизацию нативных взаимодействий растворителем. Эта водородная связь была разорвана в течение ≈1 нс, и вода и, в конечном итоге, молекулы мочевины стали новыми партнерами по водородной связи этих остатков (рис.3).

Рисунок 2

Взаимодействия растворитель-белок в гидрофобном ядре CI2. ( a ) Ленточное представление кристаллической структуры, построенное с использованием MOLSCRIPT (44) и RASTER3D (45). ( b ) Контакты воды (красный) и мочевины (пурпурный) для Ile-20 нанесены на график как функция времени для CI2 в 8 M мочевине при 60 ° C (UR1). Контакты считали, когда тяжелые атомы находились в пределах 4,6 Å или 5,4 Å для алифатических атомов углерода. ( c ) Контакты воды (темно-синий) и мочевины (голубой) для Leu-49.( d ) Контакты воды (темно-зеленый) и мочевины (светло-зеленый) для Ile-57. ( e ) Боковая цепь (с использованием окраски в a ) доступная для растворителя площадь поверхности как функция времени для этих трех гидрофобных остатков ядра в моделировании UR1 и в воде ( f ).

Рисунок 3

Сольватация гидрофобного ядра. Снимки из моделирования UR3, показывающие воду и мочевину в пределах 5,4 Å от остатков 11, 16, 20, 49 и 57 (показаны в виде заполнения пространства).Показано, что вода (зеленая) проникает через верхний край гидрофобной сердцевины за 1 нс. К 2 нс мочевина (окрашенная атомами) попала в гидрофобное ядро. Водородная связь основной цепи остатка 57 и карбонильный атом кислорода остатка 11 также показаны вверху структур. Рисунок был сделан с использованием VMD (46) и визуализирован с помощью RASTER3D (45).

Свойства воды в различных средах.

Самодиффузия воды контролировалась для измерения возможных изменений в динамике растворителя при высокой температуре и в присутствии мочевины.Диффузия воды немного снизилась при добавлении белка с 0,46 до 0,41 Å ² / пс при 60 ° C, но резко упала в 8 M мочевине до 0,18 и 0,17 Å ² / пс с и без CI2, соответственно. Для сравнения: экспериментальная константа диффузии воды при этой температуре составляет 0,47 Å ² / пс (47), что хорошо согласуется со значением из MD (0,46). Время пребывания молекул растворителя вокруг поверхности белка также отслеживали для полярных и неполярных групп. Время пребывания мочевины было одинаково больше, чем у воды.Например, для UR1 среднее время пребывания мочевины составляло 25 пс вокруг полярных остатков и 3,6 пс вокруг неполярных групп, а дополнительные значения для воды составляли 2,8 и 2,6 пс соответственно.

Влияние мочевины на воду проиллюстрировано на рис. 4. Хотя общее количество водородных связей растворителя было одинаковым для CI2 в воде и 8M мочевины, 1818 и 1956, соответственно, произошел сдвиг в сторону более длинных водородных связей в мочевине. Следовательно, произошло снижение количества сильных (≤1.8 Å) водородных связей вода – вода на 136. Эти сдвиги привели к ослаблению структуры воды.

Рисунок 4

Распределение водородных связей для CI2 в воде и в 8 М мочевине. Вероятность разной длины водородной связи в течение 200 пс временного интервала от 0,8 до 1,0 нс перед разворачиванием отображается для взаимодействий вода-вода и вода-мочевина. Значения даны для объемного растворителя (> 3,5 Å для полярных атомов и> 4,5 Å для неполярных атомов) и нормированы на среднее количество молекул в объеме.Критерии водородной связи приведены в легенде к Таблице 1.

Контакты мочевины и воды также отслеживались на предмет основных гидрофобных остатков ядра на протяжении всего моделирования. Как показано на фиг. 2, когда мочевина контактировала с гидрофобным остатком, также присутствовали контакты с водой. Контакты воды и мочевины увеличиваются примерно на 2 нс (рис. 2), что совпадает с переходом через переходное состояние (TS). Как правило, вода опережала мочевину в сольватировании гидрофобного ядра. Количество водородных связей вода – белок увеличивалось на ≈50% на ранних стадиях разворачивания от N к TS (Таблица 1).Напротив, изменение количества водородных связей мочевина-белок было более вариабельным за тот же период времени. В одном случае (UR1) количество водородных связей мочевина-белок мало изменилось от N к TS и, вместо этого, увеличилось позже при разворачивании после распада вторичной структуры. В двух других моделях было большее количество водородных связей мочевина-белок в TS, особенно в UR3. В целом 30–35% групп основной цепи взаимодействовали с мочевиной> 40% времени в ансамблях TS.

Таблица 1

Внутри- и межмолекулярные водородные связи в зависимости от конформационного состояния и среды растворителя

В среднем количество водородных связей вода – белок мало увеличивалось при переходе от TS к D (табл. 1). Этот результат, по крайней мере частично, связан с относительным обогащением мочевиной на поверхности белка; отношение воды к мочевине в первой сольватной оболочке было меньше, чем в массе (3,6 против 4,2, исходя из расстояния контакта тяжелого атома 3 Å).Всего CI2 приобрел 50 водородных связей с растворителем в процессе N → D и потерял ≈25 внутрибелковых водородных связей.

Конформационные свойства, индуцированные растворителем.

Рис. 5 содержит снимки CI2 в различные моменты времени, чтобы проиллюстрировать влияние мочевины на общую укладку белка. Структуры из моделирования разворачивания обладают некоторыми основными характеристиками, такими как полностью сольватированное гидрофобное ядро ​​и степень разрушения α-спирали и β-листа.Гидрофобные контакты между спиралью и β-листом были потеряны, что позволило остаткам, определяющим ядро, Ala-16, Ile-20, Leu-49 и Ile-57 стать сольватированными (рис. 2 и 3), а также Trp 5. (данные не показаны), спектроскопический зонд использовался экспериментально для наблюдения за разворачиванием. Спиральная структура не была полностью потеряна в 8 М мочевине, хотя происходило раскручивание и повторная укладка спирали (рис. 5). Β-структура, напротив, была отменена. В целом конформационные свойства CI2 в 8 M мочевине резко отличались от таковых при контрольном моделировании CI2 в воде при той же температуре, и, вместо этого, они были аналогичны тем, что наблюдались на траектории денатурации 125 ° C (рис.5).

Рисунок 5

Структурные изменения CI2 как функция времени и окружающей среды. Позиции нативной вторичной структуры окрашены в красный цвет (спираль) и голубой цвет (β-тяжи).

Обсуждение

Многие исследования пытались объяснить действие денатурантов, таких как мочевина (2–20, 48). Эти исследования предполагают три возможных механизма: ( i ) прямые взаимодействия мочевины с белком, особенно с D; ( ii ) косвенные эффекты через возмущение среды растворителя, способствующие сольватации гидрофобных остатков; и ( iii ) сочетание прямых и косвенных эффектов.МД моделирования с соответствующими моделями растворителей могут пролить свет на атомные детали химической денатурации мочевиной. Две группы, в частности, использовали такой подход для изучения взаимодействия мочевины с ферментом барназой (22, 23). Оба этих исследования были сосредоточены на описании прямых взаимодействий белок-мочевина с N белка, потому что моделирование было слишком коротким, чтобы наблюдать разворачивание. Кроме того, хотя их результаты в целом совпадают, они не рассматривают возможные косвенные эффекты мочевины посредством анализа растворителя.Здесь мы продолжили эти более ранние исследования, доведя разворачивание до конца и проанализировав не только прямые взаимодействия мочевина-белок, но и свойства растворителя, чтобы получить атомарное описание химической денатурации.

Основываясь на результатах нашего моделирования CI2 в 8 M мочевине, денатурация, катализируемая мочевиной, произошла за счет сочетания прямых и косвенных механизмов. Во-первых, мочевина нарушила структуру и динамику воды, что привело к ослаблению взаимодействия вода-вода и уменьшению диффузии воды.Константы диффузии воды в 8 M мочевине при 60 ° C были аналогичны константам для чистой воды при 25 ° C, что было совершенно неожиданным. Многие из ранних объяснений денатурации, зависимой от мочевины, основывались на хаотропных аргументах: мочевина нарушает структуру воды, так что гидрофобные молекулы легче сольватируются. Наши предыдущие исследования концентраций мочевины ≤4 M согласуются с этой идеей (27).

При высоких концентрациях, таких как описанные здесь, это воздействие на воду усиливается и способствует «хаотропным» свойствам мочевины и способствует более легкой сольватации неполярных остатков.Кроме того, гидрофобный эффект увеличивается с повышением температуры (49, 50), отражая увеличивающееся неравенство между возмущенными водами, вынужденными выстраиваться вокруг неполярных групп (48), и водами, свободными для взаимодействия с объемным растворителем. В 8 M мочевине гидрофобный эффект смягчается снижением динамики воды при 60 ° C. Фактически, среда растворителя лучше способна сольватировать гидрофобные группы, и исключение неполярных боковых цепей из растворителя дает небольшое преимущество; таким образом, косвенные эффекты мочевины действуют для стабилизации не-N белка, включая TS, тем самым ускоряя разворачивание белка.

Вторая часть нашей модели включает прямые взаимодействия между растворителем и CI2, которые четко видны при моделировании. Нарушение структуры воды мочевиной уменьшило когезию воды, сделав ее основным денатурантом на ранних этапах развертывания, тем самым обеспечивая связь между прямым и косвенным механизмами. Количество водородных связей вода-белок увеличилось на ≈50% от N к TS, при меньшем изменении взаимодействия мочевины. Однако мочевина также напрямую взаимодействовала с белком, особенно после разрушения вторичной структуры.Число водородных связей мочевины с основной цепью пептида увеличивалось от TS до D, тогда как водородные связи воды оставались относительно постоянными, но эти числа значительно варьировались. Увеличение «связанной» мочевины при разворачивании согласуется с оценками, основанными на кривых перехода ≈10–15 дополнительных связанных молекул (2) и значениями Махатадзе и Привалова (5) ≈30 для белков, вдвое превышающих размер CI2. Степень взаимодействия основной цепи с мочевиной в TS при моделировании (30–35% остатков) также хорошо согласуется с оценками, основанными на эксперименте (36%) (9).

Растворитель не только участвует в специфических электростатических взаимодействиях с белком, но также проверяет гидрофобные взаимодействия. Например, остатки, составляющие край гидрофобного ядра, взаимодействовали с мочевиной и водой до тех пор, пока не нарушились стабилизирующие гидрофобные и водородные связи, что привело к притоку воды, а затем и мочевины к гидрофобному ядру (рис. 2 и 3). Поскольку белок подвергает воздействию растворителя большее количество атомов основной цепи, мочевина взаимодействует преимущественно с этими атомами и исключает воду в процессе, что согласуется с предыдущими исследованиями калориметрии (51, 52), растворимости (19) и сольватации (11, 53, 54). и недавняя работа Тимашева (10, 11).Относительное обогащение мочевины вокруг белка наблюдалось в предыдущих моделях (4, 22, 23). Более того, расчет коэффициента распределения локально-объемного K _p (отношение молярных концентраций сорастворителя около белка к массе) из нашего моделирования дает среднее значение 1,2, что хорошо согласуется с экспериментом (1,1 –1.4; ссылки 7 и 8). Короткое время пребывания мочевины вокруг неполярных остатков (≈4 пс) по сравнению с полярными остатками (25 пс) подтверждает часть нашей модели о прямом взаимодействии.Кроме того, время пребывания мочевины было больше, чем в воде, что согласуется с исследованиями ЯМР (55). Белок содержал остаточную структуру в виде динамической нативной спиральной структуры и кластеров гидрофобных боковых цепей, что согласуется с экспериментом (34).

Выводы

Моделирование CI2 в 8 M мочевине показывает, что мочевина способствует разворачиванию как косвенными, так и прямыми механизмами. Прямые взаимодействия с мочевиной заключаются в связывании водорода с полярными фрагментами белка, особенно с пептидными группами, что приводит к скринингу внутримолекулярных водородных связей.Сольватация гидрофобного ядра происходила за счет притока молекул воды, затем мочевины. Мочевина также способствовала разворачиванию белка косвенным образом, изменяя структуру и динамику воды, что также происходит при введении неполярных групп в воду, тем самым уменьшая гидрофобный эффект и облегчая воздействие на гидрофобные остатки ядра. В целом, воздействие мочевины на воду косвенно способствовало развертыванию, способствуя гидрофобной сольватации, тогда как прямые взаимодействия обеспечивали путь.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Бен Ли, Дарвин Алонсо и Кейт Лейдиг за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантом GM50789 Национального института здравоохранения (для V.D.) и учебным грантом GM07750 (для BJB) Национального института здравоохранения.

Сноски

• ↵ * Кому следует направлять корреспонденцию. Электронная почта: daggett {at} u.washington.edu.

• Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в офис PNAS.

Сокращения

CI2,

ингибитор химотрипсина 2;

MD,

молекулярная динамика;

N,

родное состояние;

TS,

переходное состояние;

D,

денатурированное состояние

• Получено 8 января 2003 г.

• Copyright © 2003, Национальная академия наук

Химический состав и антигенность протеина Миндаль (Prunus Dulcis) и Macadamia Integolia ) Семена

Сорта миндаля и ореха макадамия были проанализированы на предмет физических характеристик семян, химического состава и белковой антигенности.Также было исследовано влияние условий окружающей среды (географическое положение и год сбора урожая) на состав семян миндаля. Масса отдельных семян миндаля составляла 0,78–1,44 г, длина 18,3–27,8 мм, ширина 9,8–13,8 мм и толщина 6,9–10,2 мм. Образцы орехов макадамия имели массу семян 2,41–3,36 г, диаметр 18,7–20,1 мм и толщину 14,4–15,9 мм. Влага, липиды, белок, зола, растворимые сахара и дубильные вещества варьировались от 2,9 до 5,6%, 50,9-66,7%, 15,7-26%.7%, 2,6-3,5%, 3,0-6,5% и 0,07-0,36% в семенах миндаля и 1,7-2,6%, 60,0-66,2%, 5,6-7,1%, 1,0-1,4%, 5,3-8,7% и 0,03- 0,04% в семенах ореха макадамия соответственно. Кислые аминокислоты (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота) были доминирующими аминокислотами в белках миндаля и ореха макадамия, составляя 24,4-43,3% и 35,1-40,8% от общего количества аминокислот. Белки семян миндаля и ореха макадамия имеют соотношение незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислот в диапазоне 25,4-33,8% и 22,5-26,1%, а также являются богатыми источниками аргинина в диапазоне 7.3-11,9% и 9,4-11,5% соответственно. Общее количество свободных аминокислот в семенах миндаля варьировалось от 172,3 до 723,2 мг / 100 г сухого веса, при этом свободный аспарагин составлял 14,9-44,9% от общего количества свободных аминокислот. Моноклональный сэндвич-ELISA и поликлональный ингибирующий ELISA были разработаны для обнаружения и оценки антигенности белков миндаля и орехов макадамии, соответственно. ELISA в сочетании с вестерн-анализом и дот-блоттингом использовали для исследования антигенной стабильности белков миндаля и ореха макадамия при различных обработках (термических и pH) и для количественного определения этих белков в сложных пищевых матрицах.ELISA был способен обнаруживать основной белок миндаля (AMP) и белки ореха макадамии на уровнях от 19,2 ± 1,3 нг / мл и 21,8 ± 0,9 нг / мл, а также был способен обнаруживать белки AMP и ореха макадамии при 10 ppm или ниже в большинство протестированных пищевых матриц.

.